Tese de mestrado integrado. Engenharia Civil (especialização em Construções Civis). Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2008

Tese de mestrado integrado. Engenharia Electrotécnica e de Computadores (Major Automação). Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2009

Orientador: Gisele Zoccal Mingoti / Resumo: O receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) está relacionado com a retomada da meiose induzida por estímulo gonadotrófico. Nós utilizamos um inibidor do EGFR (AG1478) para inibir a retomada da meiose durante a pré-maturação (PMIV). No experimento I, foi avaliada a maturação oocitária, a expansão das células do cumulus, a funcionalidade das junções gap, a distribuição dos microfilamentos de actina e o conteúdo lipídico em oócitos e, a expressão gênica nas células do cumulus. No experimento II, foi avaliado o desenvolvimento embrionário, a taxa de eclosão, o número total de células, a taxa de apoptose, o conteúdo lipídico e expressão gênica nos embriões. No experimento I, os COC foram PMIV por 8h em meio com 1 μM de AG1478, inibidor do EGFR, (EGFR-_PreIVM), em seguida foram MIV por 22h (EGFR-_IVM); foram feitos 4 grupos controle: oócitos imaturos imediatamente após sua remoção do folículo (Control_Immat), oócitos MIV por 8h (Control_PreIVM), por 22h (Control_IVM_22h) e por 30h (Control_IVM_30h). No experimento II, os COC foram PMIV por 8h em meio com 1 μM do inibidor do EGFR, em seguida foram MIV por 22h (EGFR-); os COC do grupo controle foram MIV por 22h (Control). Em seguida, os oócitos foram FIV e cultivados por até 9 dias. No experimento I, o grupo EGFR-_PreIVM apresentou 53,1% dos oócitos em GV, com a maioria em GV1 (42,9%; P>0,05) ou em GV3 [28,6%, semelhante ao grupo Control_Immat (P>0,05) e menor que o grupo Control_PreIVM (P<0,05)]; após a MIV não foram encontr... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Epidermal growth factor receptor (EGFR) is related with meiosis resumption by gonadotropic stimulus. We used an EGFR inhibitor (AG1478) to block meiosis resumption during prematuration (PIVM). In experiment I, was evaluated oocyte maturation, cumulus cells expansion, gap junctions functionality, microfilaments distribution and lipid content in oocytes and, gene expression in cumulus cells. In experiment II, was assessed embryo development, hatching rates, total cell number, apoptosis, lipid content and gene expression in embryos. For experiment I, COC were PIVM for 8h in medium supplemented with 1μM of AG1478, an EGFR inhibitor, (EGFR-_PreIVM), followed by 22h IVM (EGFR-_IVM); four control groups were evaluated: immature oocytes immediately after follicle removal (Control_Immat), oocytes IVM for 8h (Control_PreIVM), oocytes IVM for 22h (Control_IVM_22h) and oocytes IVM for 30h (Control_IVM_30h). For experiment II, COC were PIVM for 8h in medium supplemented with 1μM of EGFR inhibitor, followed by 22h IVM (EGFR-); COC from control group were matured for 22h (Control). After that, oocytes were IVF and zygotes were cultured up to 9 days. In experiment I, EGFR-_PreIVM group had 53.1% of the oocytes blocked in GV, the majority in GV1 (42.9%; P>0.05) or in GV3 [28.6%, similar to Control_Immat (P>0.05) and lower than Control_PreIVM (P<0.05)]. After IVM, no differences (P>0.05) were found between groups in MII rates, but Control_IMV_30h (9.1%) had higher (P<0.05) rates of degenerated... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by RACHEL SANTINI PAULINO null (rachel_santini@hotmail.com) on 2018-04-04T13:58:29Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado 2.pdf: 1550212 bytes, checksum: 709a7ceb2f2c96479c741d61c71f0143 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-04-04T14:13:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 paulino_rs_me_jabo.pdf: 1550212 bytes, checksum: 709a7ceb2f2c96479c741d61c71f0143 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-04T14:13:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 paulino_rs_me_jabo.pdf: 1550212 bytes, checksum: 709a7ceb2f2c96479c741d61c71f0143 (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O estresse oxidativo causado pela produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) é uma das respostas que as plantas apresentam frente a um estresse ambiental. Nosso objetivo foi avaliar o estresse oxidativo das macrófitas aquáticas Crinum americanum e Spartina alterniflora em duas condições: salinidade e nutrientes que ocorrem no estuário do rio Itanhaém (SP). Raízes e folhas (5 plantas) de C. americanum foram coletadas em cada área (5 amostras/área). O material vegetal para análises de clorofila (a+b), carotenóides, peróxido de hidrogênio (H2O2), malonaldeído (MDA) e enzimas antioxidantes SOD e CAT foram acondicionado em N2 líquido no campo e posteriormente armazenado em freezer a -80 °C. Também foram coletados em cada réplica material vegetal para avaliar o teor de N e P totais da planta e do sedimento Os dados obtidos foram submetidos à Análise de Variância (ANOVA) e comparados pelo teste de Tukey (p < 0,05). Os resultados obtidos mostraram que: C. americanum e S. alterniflora sofreram maior estresse oxidativo em alto e médio estuário, respectivamente; Os indivíduos de S. alterniflora sofreram maior estresse na área de lançamento de esgoto. / The oxidative stress caused by the production of reactive oxygen species (ROS) is one of the responses that plants exhibit facing environmental stress. Our objective was to evaluate the oxidative stress of the aquatic macrophytes Crinum americanum and Spartina alterniflora under two conditions: salinity and nutrients that occur in the estuary of the Itanhaém river (SP). Roots and leaves (5 plants) of C. americanum were collected in each area (5 samples / area). The plant material for analysis of chlorophyll (a + b), carotenoids, H2O2, MDA and antioxidant enzymes SOD and CAT with platform in N2 without field and liquid in freezer at -80 ° C. Vegetable material was also collected in each replicate to evaluate the total N and P content of the plant and of the sediment. The data were submitted to Analysis of Variance (ANOVA) and compared by the Tukey test (p <0.05). The results showed that: C. americanum and S. alterniflora suffered higher oxidative stress in upper and middle estuary, respectively; The State of São Paulo changes have suffered greater stress in the area of sewage / 2018SLR05032

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-14T11:23:47Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 947659 bytes, checksum: e40a84800499bceebcf0b0b2051d2265 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-14T11:23:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 947659 bytes, checksum: e40a84800499bceebcf0b0b2051d2265 (MD5) Previous issue date: 2007-07-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Geminivírus constituem um grupo de vírus com genoma composto de DNA de fita simples que se replicam no núcleo de células do hospedeiro através de um intermediário dupla fita, podendo ser constituídos por um genoma mono ou bi-segmentado. O transporte do DNA viral do núcleo para o citoplasma de geminivírus bi-segmentados requer a proteína viral designada NSP, Nuclear Shuttle Protein (BV1). A localização de NSP e seu papel proposto no movimento célula-a-célula do DNA viral predizem que podem ocorrer interações com fatores do hospedeiro tanto no citoplasma quanto no núcleo. Inicialmente foi demonstrado que a proteína NSP de geminivírus que infecta Arabidopsis Cabbage leaf Curl Virus (CaLCuV) interage com receptores cinase (RLK) contendo repetições ricas em leucina (LRR) designadas NIK (NSP-Interacting Kinase). A interação NSP-NIK foi mapeada em NIK1 e ocorre através de uma região de 81 resíduos de aminoácidos do domínio cinase (aa 422-502) que compreende o potencial sítio ativo ser/tre cinase (subdomínio VIbHrDvKssNxLLD) e a alça de ativação (subdomínio VII-DFGAk/rx, mais subdomínio VIII GtxGyiaPEY). A proteína comportou-se como um autêntico receptor cinase, sofrendo autofosforilação in vitro. Sendo, entretanto, a atividade cinase inibida pela proteína NSP. A fim de analisar o papel biológico da interação NSP-NIK, ensaios de infecção foram realizados em plantas contendo alelos nulos para o gene NIK1. Estes resultados demonstraram que a inativação dos alelos NIK1 e NIK3 aumentou a suscetibilidade à infecção causada pelo CaLCuV. Dada a sobreposição do domínio de interação com NSP com domínios regulatórios, foram realizados estudos bioquímicos através de mutagênese sítio dirigida em NIK1. A fim de mapear os sítios envolvidos na ativação da fosforilação de NIK1, o resíduo Thr-474 na alça de ativação foi substituído para resíduos de Ala, Asp ou Glu. Além disso, os resíduos Thr-468, Thr-469 e Ser-465 foram trocados por Ala. Foi demonstrado que a proteína receptora NIK1 exibe um padrão complexo de sítios de fosforilação, que agem independentemente em reações de transfosforilação e fosforilação de substratos. O resíduo de Thr-474 possui um papel central na ativação da proteína cinase, uma vez que os mutantes T474A e T474E apresentaram baixas atividades de auto e fosforilação do substrato. Similarmente, substituição do resíduo Gly-473 por Val juntamente com substituição de Thr-474 por Ala aboliu a autofosforilação e a fosforilação do substrato, sugerindo que, esta mutação acarreta modificações estruturais da alça de ativação que promovem impedimentos estéricos. Em contraste, a substituição dos resíduos Thr-469 e Ser465 por alaninas não causou impacto acentuado na autofosforilação, mas aumentou a atividade de fosforilação do substrato. Provavelmente, fosforilação desses resíduos provocam um efeito inibitório na atividade cinase. Além disso, foram conduzidos experimentos de complementação em A. thaliana nocautes para NIK. Complementação de NIK1 restaurou o fenótipo selvagem com a diminuição da suscetibilidade ao vírus. Em contraste, a expressão de NIK1 mutante com o domínio cinase inativo não reverteu o fenótipo do nocaute nik1, mantendo a elevada taxa de infecção. Estes resultados suportam o argumento de que o domínio cinase de NIK1 medeia uma via de sinalização que culmina em uma resposta de defesa. / Geminiviruses are small, single-stranded DNA viruses that replicate through doublestranded DNA intermediates in the nuclei of their plant hosts and can be mono or bipartite. The transport of bipartite viral DNA from the nucleus to the cytoplasm requires the viral protein NSP, and the nuclear shuttle protein NSP (BV1), both required for systemic infection. The localization of NSP and its proposed role in cell-to-cell movement of the viral DNA predict that interactions with host factors may occur in both the cytoplasm and the nucleus. Initially we have demonstrated that the NSP from an Arabidopsis-infecting geminivirus, Cabbage leaf Curl Virus (CaLCuV) interacts with a leucine rich repeat (LRR) receptor like kinases (RLK) designated NIK (NSP-Interacting Kinase). The NSP-NIK interaction occurs in NIK1 through an 81 amino acid region of the kinase domain (aa 422502) that encompasses the putative active site for ser/thr kinases (sub-domain VIbHrDvKssNxLLD) and the activation loop (sub-domain VII-DFGAk/rx, plus subdomain VIII -GtxGyiaPEY).The protein behaved like authentic receptor kinase undergo autophosphorylation in vitro. However, NSP protein inhibits the kinase activity. To unravel the biological significance of the NSP-NIK interaction we have selected nik null alleles for infection assays. Inactivation of NIK1 and NIK3 alleles enhanced the susceptibility to geminivirus infection. Given the overlap of the NSP-interacting domain with regulatory domains for kinase activity, we focused on site-directed mutagenesis studies on NIK1 To map the phosphorylation sites involved in activation of NIK1, we have replaced Thr-474 in the activation loop by Ala, Asp or Glu residues, whereas Thr-468, Thr-469 and Ser 465 were replaced by Ala. We found that NIK1 exhibits a complex pattern of phosphorylation sites that function independently in auto- and in substrate phosphorylation. The Thr-474 residue seems to play a pivotal role in the activation of the kinase protein, since the mutants T474A and T474E exhibited low auto- and substrate phosphorylation activities. Furthermore, the replacement of Gly-473 by Val in addition to Thr-474 by Ala abolished autophosphorylation and phosphorylation of substrate, sugesting that this mutation promotes a structural rearrangement of the A-loop that compromises activity. In contrast, the replacement of Thr469 and Ser-465 for alanines did not impact autophosphorylation significantly, but increased substrate phosphorylation activity. Possibly the phosphorylation of these residues impairs the kinase activity. In addition, we conducted complementation experiments in the nik1 genetic background. NIK1 expression in nik1 complemented the mutant and restored the wild type phenotype, with decreased virus susceptibility. In contrast, an inactive kinase domaincontaining NIK1 mutant did not reverse the enhanced susceptibility phenotype of the knockout lines and kept a high infection rate. These results are consistent with a model in which the kinase domain of NIK mediates a signaling pathway that culminates in antiviral defense.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-05-26 / A via de sinalização Janus Kinase/Transdutores de Sinal e Ativadores de Transcrição (JAK/STAT) é uma das mais importantes vias de sinalização para transdução do sinal usadas pelas citocinas. Entretanto, o papel da via JAK/STAT na lesão de isquemia reperfusão (IR) hepática ainda não foi explorado. Este estudo foca no papel da proteína-quinase JAK2, que está acima de STAT-1 na cascata de sinalização JAK/STAT, e o seu papel no mecanismo da lesão de IR hepática. Isquemia quente parcial (lobos esquerdo e médio) foi induzida no fígado de camundongos C57BL/6 por 90 minutos, seguidos por 6 horas de reperfusão. Os animais foram tratados com o inibidor específico de JAK-2 (Tyrphostin AG490; 40 mg/kg, i.p) ou veículo (DMSO), 60 minutos antes do início da isquemia. O bloqueio de JAK2 resultou em significante redução da lesão hepática e da apoptose de hepatócitos. A análise imunohistoquímica revelou uma importante redução no infiltrado de macrófagos e de polimorfonucleares neutrófilos no tecido hepático dos animais que receberam AG490 anteriormente ao insulto isquêmico, comparado aos animais controle (DMSO). A expressão de citocinas pro-inflamatórias (TNF-α, IL-6, IL-1β) e das quimiocinas (CXCL-10 and CXCL-2) também estava reduzida no grupo tratado com AG490, comparado ao grupo controle. A análise da presença de células apoptóticas, através da técnica de TUNEL no tecido hepático dos camundongos, revelou menor número de hepatócitos em processo de apoptose no grupo tratado com AG490 consistente com o achado de western-blot que revelou menor expressão da proteína caspase-3 clivada em paralelo com o aumento da expressão da proteína anti-apoptótica Bcl-XL, no grupo que recebeu AG490. Para confirmar nossos achados in vivo nós testamos AG490 (75 mM) em culturas de macrófagos derivados da medula óssea (BMM) e em cultura de células da linhagem de hepatoma- CRL1830, ambas estimuladas com LPS (10 ng/ml). Em culturas de macrófagos derivados da medula óssea, AG490 reduziu a expressão gênica das citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL-12p40, IL-1β, CXCL-10 e iNOS) que encontravam-se elevadas apos estimulação com LPS. Em cultura de células da linhagem de hepatoma- CRL1830, AG490 reduziu a expressão de caspase-3 clivada. Além do que, o bloqueio de JAK2 inibiu a fosforilação de STAT1 e STAT3. Pela primeira vez demonstramos que a sinalização por JAK2 é essencial na fisiopatologia da lesão de IR hepática, já que seu bloqueio seletivo protegue o fígado contra inflamação e apoptose. / The Janus kinase/signal transducers and activators of transcription (JAK/STAT) signaling is one of the major pathways for cytokine signal transduction. However, the role of the JAK/STAT pathway in liver I/R is not clear. This study focuses on JAK2, which functions upstream of STAT-1 in JAK/STAT, and its role in the mechanism of liver IRI. Partial warm ischemia was produced in the hepatic lobes of C57BL/6 mice for 90min, followed by 6h of reperfusion. Mice were treated with JAK-2 inhibitor (Tyrphostin AG490; 40 mg/kg, i.p) or veicle, 60min prior to ischemic insult. JAK2 blockade resulted in significant reduction of hepatocyte apoptosis and liver injury. Macrophage and neutrophil infiltration, as assessed by immunohistochemistry, was markedly decreased in AG490-treated livers, compared with controls. The expression of proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-6, IL-1β) and chemokines (CXCL-10 and CXCL-2) was also significantly reduced in AG490-treated group, compared with controls. AG490-treated livers showed less TUNEL positive cells and reduced cleaved caspase-3 protein expression in parallel with increased Bcl-XL expression. We employed AG490 (75 mM) in primary bone marrow-derived macrophage (BMM) and hepatoma cell (CRL1830) cultures, both stimulated with LPS (10 ng/ml). In BMM cultures, AG490 depressed otherwise LPSinduced pro-inflammatory gene expression programs (IL-6, IL-12b, IL-1β, CXCL-10 and iNOS). In hepatoma cells, AG490 reduced cleaved-caspase-3 expression. Moreover, JAK2 blockade inhibited STAT1 and STAT3 phosphorylation. This is the first report, which documents that JAK2 signaling is essential in the pathophysiology of liver IRI, as its selective blockage ameliorated the disease process and protected livers from inflammation and apoptosis. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações / 103 p.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:08Z : No. of bitstreams: 1 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 2 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 3 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5) Publico-12671c.pdf: 1578441 bytes, checksum: ec8da9ba80d717052e7ce5a4dea5ed15 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 4 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5) Publico-12671c.pdf: 1578441 bytes, checksum: ec8da9ba80d717052e7ce5a4dea5ed15 (MD5) Publico-12671d.pdf: 1855087 bytes, checksum: 67b34f9a1e733efa6279c9269310368a (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 5 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5) Publico-12671c.pdf: 1578441 bytes, checksum: ec8da9ba80d717052e7ce5a4dea5ed15 (MD5) Publico-12671d.pdf: 1855087 bytes, checksum: 67b34f9a1e733efa6279c9269310368a (MD5) Publico-12671e.pdf: 132448 bytes, checksum: 7153a9583a94f50f2a56c79c6d7d320a (MD5) / O heparam sulfato (HS) tem importante papel no comportamento celular devido a sua capacidade de interagir com uma variedade de moléculas, tais como fatores de crescimento e enzimas. HS está envolvido na sinalização celular, e a ativação da cascata de sinalização está relacionada com a fosforilação de proteínas citosólicas, que levam à regulação gênica. Estudos anteriores mostram que o sindecam-4 (Syn4), um proteoglicano de heparam sulfato, está envolvido na modulação da adesão celular e na regulação do ciclo celular. Assim, o objetivo deste trabalho foi promover o “knock-down” do Syn4 em células endoteliais, pela utilização de pequenos RNAs em forma de grampo (shRNA) para um melhor entendimento da importância do Syn4 na sobrevivência celular. Células shRNA-Syn4-EC foram comparativamente estudadas com células endoteliais selvagens (EC), com células endoteliais que super-expressam o oncogene ras (EJ-ras-EC) e com células transfectadas com o plasmídeo vazio (mock EC). As diferentes células foram avaliadas por citometria de fluxo e microscopia confocal quanto à expressão da proteína Ras (Ras), integrina b1 (b1), fibronectina (FN), biglicam (Big), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de Von Willebrand (vWF), além do esqueleto protéico do sindecam-4. Os clones foram selecionados por PCRsq para o Syn4 e incorporação de [35S]-sulfato nas cadeias de glicosaminoglicanos. A transfecção não alterou a expressão de vWF que é um marcador de células endoteliais. A expressão do sindecam-4 e incorporação de [35S]-sulfato variou nos diferentes clones de shRNA-Syn4-EC em até 80%. O “knock-down” do Syn4 levou à redução significativa na expressão de Ras, integrina b-1, e fibronectina, quando comparado com células endoteliais selvagens, bem como com EJ-ras-EC. Por outro lado, a super-expressão de Ras levou à superexpressão de Syn4, diminuição da expressão de VEGF e alteração na localização celular da integrina b-1. Além disso, as células shRNA-Syn4-EC apresentam fraca adesão ao substrato, indicando que a ausência de Syn4 leva à alteração nas interações célula-célula e célula-matriz. Todos esses resultados mostram claramente que o Syn4 exerce importante papel na biologia celular. / Heparan sulfate (HS) plays an important role in cell behavior due to its ability to interact with a variety of molecules modulating growth factors and enzymes. HS participates in cellular signaling, and the activation of downstream pathways is related to the phosphorylation of cytosolic proteins leading to gene regulation. Previous studies show that syndecan-4 (Syn4), a heparan sulfate proteoglycan, modulates cell adhesion and is involved in the regulation of cell cycle. Thus the aim of the present work was to promote Syn4 knock down on endothelial cells using small hairpin RNA (shRNA) in order to gather information on its effect on cell behavior. For comparison, shRNA-Syn4-EC cells were simultaneously investigated with wild type endothelial cells (EC), as well as endothelial cells that overexpress ras oncogene (EJ-ras-EC) and a control that was transfected with the empty plasmideo (mock EC). The different cells were evaluated regarding the expression of Ras protein (Ras), b1-integrin (b1), fibronectin (FN), biglycan (Big), vascular endothelial growth factor (VEGF), von Willebrand factor (vWF), besides the core protein for syndecan-4 (Syn4) by flow cytometry and confocal microscopy. Clones were selected through sqPCR for Syn4 and [35S]-sulfate incorporation into heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) chains. Regardless of the transfection, the expression of vWF, an endothelial cell marker, was maintained in all cells, confirming their endothelial origin. The expression of syndecan-4 and incorporation of [35S]- sulfate varied among the different clones of shRNA-Syn4-EC up to 80%. The knockdown of Syn4 lead to significant reduction in the expression of Ras, b-1 integrin and FN, when compared to wild type cells as well as EJ-ras-EC. The overexpression of Ras leads to an overexpression of Syn4 and a decrease in VEGF expression and cellular localization of b-1 integrin. Furthermore, shRNASyn4- EC shows weak adhesion to the substrate, indicating that the lack of Syn4 altered cell-cell and cell-matrix interactions. The combined results clearly show that Syn4 plays an important role in cellular biology. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-05-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:48Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10866.pdf: 1428796 bytes, checksum: 3e8b3b83a47e7f481fd590e1f74949b4 (MD5) / A degradacao de proteinas pelo sistema ubiquitina-proteassoma gera uma grande quantidade de oligopeptideos dentro das celulas. Para investigar possiveis efeitos desses oligopeptideos, alguns deles foram isolados do cerebro de rato, sintetizados acoplados a sequencia peptidica TAT atraves de pontes dissulfeto, sendo entao analisados nas vias de transducao de sinal de receptores acoplados a proteina G. A mistura contendo os quatro peptideos analisados (20-80 ƒÊM) inibiu de forma significativa o aumento da taxa de acidificacao do meio extracelular induzido pela angiotensina II em celulas CHO-S que expressam o receptor AT1 (CHO-S-AT1). Adicionalmente, tanto sozinhos quanto em mistura, estes peptideos aumentaram a transcricao do gene reporter da luciferase induzida pela angiotensina II em celulas CHO-S-AT1, assim como aquela induzida pelo isoproterenol em celulas HEK293. Os peptideos sem TAT, incapazes de atravessar a membrana das celulas, nao alteraram as respostas a estimulacao dos receptores, sugerindo um efeito intracelular dos peptideos nas cascatas de transducao de sinal. Alem disso, todos os peptideos estudados inibiram competitivamente a degradacao de um substrato sintetico da oligopeptidase EP24.15 in vitro. O aumento da expressao da EP24.15 em celulas CHO-S e HEK293 foi suficiente para reduzir a atividade do gene reporter luciferase induzida pela angiotensina II ou pelo isoproterenol. Finalmente, a utilizacao dos peptideos como gisca h em colunas de afinidade revelou que diversas proteinas envolvidas na sinalizacao de receptores acoplados a proteina G interagem com os peptideos, incluindo a adaptina A-alfa e a dinamina-1. Estes resultados sugerem que antes de serem completamente degradados, os peptídeos intracelulares semelhantes àqueles gerados pelo proteassoma podem afetar ativamente a sinalização intracelular, delineando-se como novas moléculas bioativas dentro das células. / TEDE

WONG, Deysi Viviana Tenazoa. Mediação dos receptores TLR2, NOD1, e da proteína MYD88 na modulação da mucosite intestinal induzida pelo irinotecano. 2013. 198 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-02-19T14:28:30Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_dvtwong.pdf: 7706778 bytes, checksum: 49ef5f002021c0ff998f1315d44d798a (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-02-19T14:31:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_dvtwong.pdf: 7706778 bytes, checksum: 49ef5f002021c0ff998f1315d44d798a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-19T14:31:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_dvtwong.pdf: 7706778 bytes, checksum: 49ef5f002021c0ff998f1315d44d798a (MD5) Previous issue date: 2013 / The Colorectal Cancer (CRC) is one of the most prevalent neoplastic diseases in the world and is one leading cause of death. Irinotecan is a drug used as first line treatment for CRC and its liver metastases and has markedly improved the overall survival of patients. However, irinotecan-related side-effects, which include intestinal mucositis (IM), have impacted negatively on therapeutic outcome, leading to delayed chemotherapy cycles, dose reductions and treatment interruption. IM and life-threatening diarrhea may affect up to 15-25% of patients under irinotecan-based cancer chemotherapy regimens. Aims: To study the intestinal barrier function and the mechanisms involved in the IM induced by irinotecan and its active metabolite, SN-38. Methods: Male C57BL/6 mice (WT, n=6-8) were divided into groups and injected with saline (5 mL/kg, i.p.) or irinotecan (IRI, 75 mg/kg, i.p.) for 4 days. Body weight, diarrhea and blood leukocyte count were assessed on days 5 [D5] and 7 [D7]. Following euthanasia, intestinal samples were collected for histopathology, morphometry, mieloperoxidase and imunohistochemistry assays. In addition, in vivo intestinal permeability and perfusion tests were performed. Bacteremia and bacterial translocation to mesenteric lymph node and liver were further carried out. Additionally, the participation of toll-like receptors 2 (TLR2), 4 (TLR4) and 9 (TLR9), the adaptor protein MyD88 and NOD1 receptor in the pathogenesis of IM were investigated by the use of WT mice and knockout with target gene disruptions. Furthermore, the in vivo and in vitro effects of SN-38 were studied. Data analysis was performed with ANOVA/Bonferroni’s test or Kruskal Wallis/Dunn’s test. P<0,05 was accepted. (CEPA 99/10). Results. IRI-injected WT mice presented a marked (P<0.05) weight loss, leukopenia, diarrhea, increased neutrophil infiltration in lung, jejunum, ileum associated with villi and crypt morphologic alteration and apoptotic cell death versus saline-administered mice. Besides, reduced lactulose renal excretion, gut secretion of sodium, potassium and chloride evidenced intestinal barrier dysfunction in IRI-injected WT mice versus saline-administered control mice (P<0.05). Bacterermia and bacterial translocation to mesenteric lymph node and liver were also observed in the IRI group. Biochemical identification of translocating bacteria revealed the presence of Escherichia coli (75%), Citrobacter sp. (17.2%), non-fermenting gram-negative bactéria and Pseudomona aeruginosa (18%) in blood samples of IRI-injected mice. In addition, an increased TLR4 imunoexpression was detected in that group (IRI D5: 4[3-4] and D7: 4[3-4]) when compared with saline control (1.5[1-4]). Gene deletion to TLR2 and MyD88, but not to TLR4 or TLR9, prevented weight loss, diarrhea, intestinal morphometric alterations, neutrophil infiltration in the gut and bacteremia development versus the IRI-injeted WT group (P<0.05). However, NOD1 deletion was protective only against IRI-induced diarrhea without affecting the inflammatory infiltration. Furthermore, SN-38 promoted a marked neutrophil infiltration in ileum loops (P<0.05) but did not induce intestinal secretion of liquids (P>0.05) versus saline injected mice. Besides, cultured intestinal cells (IEC-6) incubated with SN-38 presented morphological changes in comparison to DMEN-cultured cells. Conclusions: IRI induced functional alterations in the gut and also bacteremia and bacterial translocation to peripheral organs. TLR2 and MyD88 deficiency prevented IRI-related intestinal damage and the diarrhea. However, NOD1 deficiency was protective only against diarrhea development. In addition, SN-38 might be responsible for the intestinal inflammatory reaction without affecting gut secretion of liquids. / O câncer colorretal (CCR) é uma das neoplasias mais prevalentes em todo o mundo, sendo uma das principais causas de óbito por câncer. Dentre as drogas utilizadas como primeira linha no tratamento do CCR e do CCR metastático hepático, o irinotecano apresenta destaque pelo impacto sobre o aumento da sobrevida dos pacientes. Contudo, o surgimento de efeitos colaterais associados ao irinotecano (IRI), como a mucosite intestinal (MI), tem impactado negativamente no curso terapêutico do paciente, observando-se atrasos nos ciclos subsequentes de quimioterapia, redução de doses e, por vezes, interrupção do tratamento. A MI e a diarréia grave são efeitos colaterais frequentes que pode atingir de 15-25% dos pacientes em quimioterapia. Objetivos: Estudar os parâmetros funcionais da barreira intestinal e os mecanismos envolvidos na mucosite intestinal induzida pelo Irinotecano e seu metabólito ativo, SN-38. Métodos: Camundongos C57BL/6 machos (WT), 20-25g, foram divididos em grupos (n=6-8), administrados por 4 dias com salina (5 mL/Kg, i.p) ou com irinotecano (IRI, 75 mg/Kg, i.p). Os animais foram analisados no 5º dia [D5] ou 7º dia [D7] quanto ao peso corpóreo, escores de diarreia, contagem de leucócitos. Após sacrifício, uma amostra de intestino foi coletada para dosagem de mieloperoxidase, análise histopatológica, morfométrica, e imunohistoquímica para TLR4. Adicionalmente, realizou-se o teste de permeabilidade e perfusão intestinal in vivo. Avaliou-se também a bacteremia e a translocação bacteriana em linfonodo mesentérico e fígado. Em adição, a participação de receptores Toll-like 2 (TLR2), 4 (TLR4) e 9 (TLR9) da proteína adaptadora MyD88 e NOD1 na mucosite intestinal foi verificada pelo uso de camundongos knockout com deleção gênica específica para aqueles receptores e seus respectivos camundongos selvagens (WT). Adicionalmente, realizou-se a avaliação dos efeitos in vivo e in vitro do SN-38. Os dados foram analisados com ANOVA/teste de Bonferroni ou Kruskal Wallis/teste de Dunn. P<0,05 foi aceito. (Protocolo CEPA 99/10). Resultados: A injeção de IRI causou uma significativa (P<0,05) perda ponderal, leucopenia e diarreia, associada a um aumento da infiltração de neutrófilos no jejuno, íleo e pulmão, com alterações morfométricas e uma intensa destruição da arquitetura dos vilos e criptas, apoptose celular em camundongos WT versus animais injetados com salina. Além disso, o IRI induz uma alteração da barreira intestinal evidenciada pela diminuição da excreção de lactulose, aliado a um aumento significativo (P<0,05) da secreção intestinal de sódio, potássio e cloreto. Os camundongos injetados com Irinotecano apresentaram bacteremia e translocação bacteriana (P<0,05) no linfonodo mesentérico e fígado, quando comparados ao grupo salina. A identificação bioquímica das bactérias translocadas evidenciou a presença de Escherichia coli (75%), Citrobacter sp. (17,2%), Bactérias Gram-Negativas Não-Fermentadoras e Pseudomona aeruginosa (18%) no grupo injetado com Irinotecano, aliado a um significativo aumento (P<0,05) da imunomarcação para TLR4 no intestino de animais injetados com IRI D5 (4[3-4]) e D7 (4[3-4]) versus o grupo salina (1,5[1-4]). Observamos que a deleção gênica para o receptor TLR2 e a proteína adaptadora MyD88, mas não para TLR4 ou TLR9, preveniram a perda ponderal e o dano funcional, relacionado aos eventos de diarreia, bem como as alterações morfométricas, histopatológicas, infiltração de neutrófilos e bacteremia induzida pelo Irinotecano versus o grupo WT injetado com IRI (P<0,05). Entretanto, a deficiência genética de NOD1 conferiu uma reduzida diarreia, sem reverter o dano pró-inflamatório induzido pelo IRI. Adicionalmente, o SN-38 causou um aumento da atividade de mieloperoxidase (P<0,05), sem alterar a secreção intestinal na alça isolada de camundongos (P>0.05) versus o grupo injetado com salina. O SN38 foi capaz de induzir alterações morfológicas nas células intestinais de ratos (IEC-6). Conclusão: O IRI induziu alteração dos parâmetros funcionais, detectadas pelo teste de permeabilidade e de perfusão intestinal. O IRI induziu uma bacteremia e translocação bacteriana para órgãos periféricos. Além disso, a deficiência do receptor Toll-like do tipo 2, e da proteína MyD88 previniu o dano intestinal e a diarreia induzida pelo IRI. Contudo, a deficiência de receptores NOD1 somente melhorou a diarreia. Adicionalmente, o SN38 foi associado a um aumento da infiltração de neutrófilo, sem alteração da secreção intestinal no modelo de alça isolada.

LEITE, Maria Juliana Borges. Ecologia reprodutiva de Leptodactylus aff. hylaedactylus (Anura: Leptodactylidae) em área de mata de tabuleiro no Nordeste do Brasil. 2012. 62 f. Dissertação (Mestrado em ecologia e recursos naturais)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-05-24T18:45:00Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_mjbleite.pdf: 10891745 bytes, checksum: 641839cdace7622461fd6d390f9774d5 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-05-27T20:40:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_mjbleite.pdf: 10891745 bytes, checksum: 641839cdace7622461fd6d390f9774d5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-27T20:40:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_mjbleite.pdf: 10891745 bytes, checksum: 641839cdace7622461fd6d390f9774d5 (MD5) Previous issue date: 2012 / It is presented a detailed study on the reproductive ecology of an undescribed amphibiam anura species, called here Leptodactylus aff. hylaedactylus, occurring at São Gonçalo do Amarante, west coast of Ceará. The study was during one year, however, this species showed seasonality, observed only in rainy months, from January to May 2011, with peak in April and showing nocturnal habits. We analyzed the environmental conditions like humidity, temperature and rainfall, and only rainfall showed significance when correlated with abundance of individuals. The species has the reproductive pattern described for the marmoratus group which has underground chambers and foam nest as the main features of reproduction, in these chambers are constructed by the male of the species before attracting the female for mating. The activities occurs in forested areas called “mata de tabuleiro”, vocalizing mainly in litter leaf, however, were observed males calling to about 30cm of soil. Males calls to attract females and if she to be interested in mating, displays leg kicking, after, they head to the chambers to mate. We found four underground chambers of 3.33 cm diameter and 2.32 cm depth mean. Three of these chambers were found with presence of foam nest and tadpoles inside (n= 9, 9 and 10). This species has no aquatic phase for the development of tadpoles, resulting in the reproductive mode 32. There was sexual dimorphism in size and it can be observed morphological differences between males and females, in which males have a rounded snout-shaped shovel. We observed nine visual signaling with one unprecedented being described in this work, called “cabeçadas” in which the male vocalized intensely in the presence of another invader male and then performs backwards movements, removing the arms of the soil, reaching an angle of 30°. Some of these visual displays are aggressive, demonstrating the presence of territorialism in this species. / Neste trabalho foram realizados estudos quanto à ecologia reprodutiva de uma espécie de anfíbio anuro ainda em processo de descrição taxonômica, chamada aqui de Leptodactylus aff. hylaedactylus, ocorrente até o momento somente para o município de São Gonçalo do Amarante, litoral oeste do Ceará. O estudo teve duração de um ano, porém, foi suficiente para confirmar que esta espécie apresenta sazonalidade, sendo observada somente em alguns meses chuvosos, de janeiro a maio de 2011, com pico de atividade no mês de abril e hábitos principalmente noturnos. Das condições ambientais analisadas, como umidade, temperatura e pluviosidade, somente esta última que apresentou correlação positiva quando correlacionada com a abundância de indivíduos em atividade. A espécie apresentou o padrão reprodutivo descrito para o grupo marmoratus, o qual apresenta câmaras subterrâneas e ninho de espuma como características principais da reprodução, em que estas câmaras são construídas pelo macho da espécie antes de atrair a fêmea. A atividade desta espécie ocorre em áreas de mata de tabuleiro, onde os machos vocalizam principalmente na serapilheira. Entretanto, foram observados machos vocalizando a cerca de 30 cm do solo, sobre a vegetação, onde o macho vocaliza para atrair a fêmea e esta ao se interessar em acasalar, exibe para o macho chutes no ar (“leg kicking”). Após isto, seguem para a câmara e realizam o amplexo. Foram localizadas quatro câmaras subterrâneas de diâmetro médio 3,33 cm e profundidade média de 2,32 cm e três destas foram localizadas com a presença de ninhos de espuma e girinos no interior (n=9, 9, e 10). Esta espécie não apresenta fase aquática para desenvolvimento dos girinos, ocorrendo o modo reprodutivo 32. Há dimorfismo sexual quanto ao tamanho para esta espécie e pode-se observar também diferenças morfológicas entre machos e fêmeas, em que os machos apresentam o focinho espatulado em forma de pá. Foram observadas nove sinalizações visuais para esta espécie, sendo uma inédita e descrita neste trabalho, chamada de “cabeçadas”, na qual o macho vocaliza intensamente na presença de outro macho invasor e em seguida realiza movimentos para trás, retirando as patas dianteiras do solo, chegando a formar um ângulo de cerca de 30°. Dentre estas sinalizações visuais exibidas, algumas são de caráter agressivo, demonstrando a presença de territorialismo nesta espécie.