Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T12:08:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Spejo_AlineBarroso_M.pdf: 5889410 bytes, checksum: 655242e3ec4018faf3f968013fd8d36d (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Estudos recentes mostram resultados promissores no tratamento de lesões ao sistema nervoso (SN) através do implante de células-tronco, atribuindo essa melhora funcional à produção de fatores tróficos pelas células. Neste trabalho, o efeito neuroprotetor e neurorregenerativo de células-tronco mesenquimais (CTM) de ratos Lewis-EGFP foi investigado após o esmagamento das raízes motoras L4, L5 e L6. Cinco ratas fêmeas Lewis foram utilizadas em cada um dos seguintes grupos: G1 - esmagamento de raízes motoras; G2 - esmagamento de raízes motoras e injeção de DMEM (Meio de Eagle modificado pela Dubelco) na interface da substância branca e cinzenta (funículo lateral); G3 - esmagamento de raízes motoras e injeção de CTM (funículo lateral). Após 4 semanas, a sobrevivência neuronal foi estudada por coloração de Nissl, onde se observou, a partir da contagem neuronal, aumento da sobrevivência no grupo tratado com CTM. A técnica de imunoistoquímica foi utilizada para avaliar a expressão de sinaptofisina, sinapsina, VGLUT1 (Transportador vesicular de glutamato-1) e GAD65 (Glutamato descarboxilase 65KDa). A expressão de sinaptofisina e sinapsina na superfície dos motoneurônios lesionados mostrou uma menor redução de inputs em animais tratados com CTM, sugerindo uma possível redução no processo de eliminação sináptica. Para detectar possíveis mudanças no equilíbrio de inputs excitatórios / inibitórios em aposição ao corpo dos neurônios motores, os anticorpos VGLUT1 (marcador de terminais glutamatérgicos) e GAD 65 (marcador de terminais GABAérgicos) foram utilizados. A redução dos terminais glutamatérgicos foi semelhante em todos os grupos. Enquanto a redução de terminais GABAérgicos ocorreu em maior proporção em G1 e G2, em relação ao grupo tratado com CTM. Os dados indicam que CTM podem proteger os neurônios contra a excitotoxicidade, resultando em menor perda de células. Com sobrevida de 12 semanas após a lesão, a regeneração nervosa foi avaliada através da análise morfológica do nervo isquiático (área do nervo, número e morfometria de fibras mielínicas) e da recuperação da função motora (walking track test). O grupo tratado com DMEM apresentou nervo com menor área e menor número de fibras mielínicas do que o tratado com CTM, porém, o grupo tratado com células obteve resultados semelhantes ao grupo que sofreu apenas esmagamento. A morfometria revelou fibras com menor mielinização nos três grupos lesionados, em comparação ao nervo contralateral à lesão, porém, para os lados ipsilaterais não houve diferença entre os tratamentos. A função motora apresentou-se melhor no grupo tratado com CTM, quando comparada com o tratado com DMEM, mas não em relação ao grupo que sofreu apenas esmagamento. O efeito das CTM na função motora foi agudo, mostrando eficiência de 4 a 6 semanas após a lesão. Assim, as CTM mostraram efeito neuroprotetor e contribuíram para a regeneração, porém a forma de administração dessas células, através de injeção diretamente na medula, apesar de resultar num maior número de células enxertadas, contribuindo com a sobrevivência dos neurônios, mostrou-se um problema quando avaliada a regeneração e função motora dos animais, indicando a necessidade de desenvolvimento de outras formas de administração / Abstract: Recent studies have shown promising results in the treatment of nervous system injuries through stem cells implantation, attributing this functional improvement to the production of trophic factors by these cells. In this study, the neuroprotective and neurorregenerative effects of mesenchymal stem cells (MSC) from Lewis-EGFP mice was investigated after crushing the motor roots L4, L5 and L6. Five female rats Lewis were used in each of the following groups: G1 - motor roots crushing; G2 - motor roots crushing and DMEM (Dulbeco's Modified Eagle Medium) injection in the white/gray matter interface; G3 - motor roots crushing and MSC injection in the white/gray matter interface. At 4 weeks after injury, neuronal survival was evaluated by Nissl staining, and revealed, by the neuronal count, increased survival in the group treated with MSC. The technique of immunohistochemistry was used to evaluate the expression of synaptophysin, synapsin, VGLUT1 (Vesicular Glutamate Transporter-1) and GAD65 (Glutamate decarboxylase 65). The expression of synaptophysin and synapsin on the surface of lesioned motoneurons, showed a smaller decrease of inputs in animals treated with MSC, suggesting a possible reduction in synaptic elimination process. To detect possible changes in the balance of excitatory / inhibitory inputs reaching the cell body of the motoneurons, antibodies for VGLUT1 (marker of glutamatergic terminals) and GAD 65 (marker of GABAergic terminals) were used. The reduction of glutamatergic terminals was similar in all groups. While the reduction of GABAergic terminals was in greater extent in G1 and G2 with respect to the group treated with MSC. The data indicate that MSC can protect neurons against excitotoxicity, resulting in decreased cell loss. With survival of 12 weeks after the injury, nerve regeneration was assessed by morphological analysis of the sciatic nerve (nerve size, number and morphology of myelinated fibers) and motor function recovery (walking track test). The group treated with DMEM showed nerve with smaller area and fewer myelinated fibers than treated with MSC, however, the group treated with cells was not better than the group that only suffered crushing. Morphometry revealed fibers with less myelination in the three injured groups, compared to the contralateral side, but there was no difference between treatments. Motor function appeared better in MSC-treated group in comparison to the DMEM-treated, but not in relation to the group which only suffered crushing. The effect of MSC in motor function was acute, demonstrating efficiency between 4 to 6 weeks after injury. Thus, the MSC shown to be neuroprotective and contributed to regeneration, but the form of administration of such cells, by direct injection into spinal cord, has to be improved or substituted by another method / Mestrado / Biologia Celular / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T14:50:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Inacio_RodrigoFabrizzio_M.pdf: 6359187 bytes, checksum: 67cbbe4ec81cf9bbd0b48c1dd3b13843 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Foi demonstrado que a regulação positiva do MHC I por tratamento exógeno com interferon beta (IFN beta) influencia no processo de eliminação das sinapses. Também, o aminoácido taurina mostrou ter influencia positiva na sobrevivência e plasticidade neuronal. No entanto, o estabelecimento de um modelo in vitro para estudo do processo de formação/eliminação sináptica e sua relação com a expressão de MHC I ainda não foi proposto. Portanto, o presente estudo tem como objetivo investigar os efeitos do tratamento com IFN e taurina, sozinhos ou diluídos em meio glial (derivado do glioma NG97), na expressão de MHC classe I e na formação de sinapses em células PC12. Células PC12 foram tratadas com NGF para indução do fenótipo semelhante a neurônio e as culturas estabelecidas foram submetidas ao tratamento com IFN beta (500 e 1000 IU) e taurina (0.025 and 0.050mg/mL) por 15 dias em meio normal e por 10 dias em meio condicionado. Finalizado o período de cultivo, as células foram fixadas e processadas para imunocitoquímica com anticorpos anti-MHC I (OX18) e anti-sinaptofisina. A imunomarcação foi mensurada com o software Image J. Nesse contexto, quatro campos representativos foram usados, a partir de cada poço de cultivo. Os resultados mostraram que o IFNbeta (500UI) e a taurina (0.025 mg) modulam a expressão de MHC em células PC12, especialmente após 10 dias de tratamento. IFN e taurina apresentaram efeitos opostos, sendo que o IFN induz o aumento do MHC I, enquanto a taurina causa sua diminuição. Em ambos os casos, o aumento das doses causa degeneração da cultura. Interessantemente, a regulação diferencial do MHC I ocorreu paralelamente a um aumento ou diminuição da plasticidade sináptica, respectivamente. O uso do meio condicionado de NG97, juntamente com IFNbeta ou taurina, leva a uma diminuição da estabilidade sináptica. De uma maneira geral, os presentes dados indicam que as células PC12 podem ser usadas como modelo in vitro para estudos de modulação de MHC I e plasticidade sináptica. Também, reforçam o papel do IFNbeta na eliminação sináptica e indicam que a taurina é capaz de aumentar a formação da rede sináptica / Abstract: It has been demonstrated that MHC I up regulation by exogenous treatment with interferon beta (IFN beta) influences the glial reaction and the synaptic elimination process. Also, the amino acid taurine has been shown to positively influence neuronal survival and plasticity. Nevertheless, the establishment of an in vitro model for studying the synaptic formation/elimination process and its relationship with MHC I expression has not yet been proposed. Therefore, the present study aimed to investigate the effects of the IFN beta and taurine treatments, alone or diluted in glial medium (derived from the NG97 gliome), on the expression of MHC I and synaptic formation in PC12 cells. Established cultures were subjected to the IFN beta (500 and 1000 IU) and taurine treatments (0.025 and 0.050mg/ml) for 5 and 10 days. Finally the cells were fixed and processed for immuno-cytochemistry with antisera against MHC I (OX18) and synaptophysin. The results were compared with control cultures only treated with basal or conditioned medium. The results showed that IFNbeta (500 IU) and taurine (0.025 mg) modulated the MHC I expression in PC12 cells, especially after 10 days of treatment. IFN and taurine displayed opposite effects, such that IFN induced MHC I up regulation, while taurine induced down regulation. In both cases, the highest doses caused culture degeneration. Interestingly, the differential regulation of MHC I was paralleled by enhancement or a decrease in synaptic plasticity, respectively. The use of the NG97 conditioned medium together with IFNbeta or taurine led to a decrease in synaptic stability. Altogether, the present data indicate that PC12 cells may be used as an in vitro model for studying MHC I modulation and synaptic plasticity. It also reinforced the role of IFNbeta on synaptic elimination and indicated that taurine was able to increase the synaptic network formation / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T17:19:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simoes_GustavoFerreira_D.pdf: 65115196 bytes, checksum: 18f51cababf3e248cceb806b8faef631 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Atualmente, muito se sabe sobre o acometimento muscular na DMD, mas poucos estudos estão voltados para os efeitos no Sistema Nervoso Central (SNC), mais especificamente no microambiente do motoneurônio medular. Sabe-se que durante a evolução da doença, o terminal axonal, na junção neuromuscular, entra em um ciclo de denervação (retração) e reinervação (brotamento). A possibilidade de modulação do MHC I se apresenta como uma nova estratégia de influenciar positivamente o processo de plasticidade sináptica após lesões do Sistema Nervoso Periférico (SNP) e SNC. Tal modulação pode ser realizada através da utilização ou desenvolvimento de drogas específicas. O fator estimulador de colônias glanulocitárias (G-CSF) é uma glicoproteína que foi descrita há mais de vinte anos, possui aprovação do ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) e é comumente utilizada para tratar neutropenia, ou para transplantes de medula óssea. O GCSF possui um efeito neuroprotetor aparentemente multimodal, incluindo-se a atividade anti-apoptóptica em neurônios, regeneração da vascularização, efeito antiinflamatório e estimulação de neurogênese endógena, sendo capaz de atuar efetivamente no processo de regeneração do sistema nervoso. No presente trabalho, foram utilizados camundongos MDX. Os camundongos foram distribuídos em 4 grupos (axotomia + G-CSF; Axotomia; Controle + G-CSF e Controle), com n=10. Incluiu-se para imunoistoquímica o grupo placebo, onde os animais receberam uma dose diária de 200?m, via subcutânea, de glicose a 25%. Nossos resultados indicam que redução de sinapses nos motoneurônios alfamedulares e aumento da astrogliose circunjacente aos neurônios alfa-medulares, seja decorrente da desconexão parcial entre o orgão alvo e o corpo neuronal durante o período de ciclos de degeneração/regeneração muscular que ocorrem a partir das primeiras semanas de vida nos camundongos MDX. Estes ciclos podem repercutir retrogradamente nos corpos celulares dos motoneurônios alfa-medulares, provocando uma série de alterações denominadas cromatólise. A axotomia do nervo isquiático resulta num aumento significativo da expressão de MHC I nas duas linhagens estudadas. Contudo, nos animais MDX, este aumento é menor, comparativamente à linhagem C57BL/10. Quando tratados com G-CSF a expressão de MCH I ficou maior em relação aos grupos não tratados e, isso pode indicar um papel ativo da droga no potencial regenerativo após a lesão. Também podemos sugerir que, apesar dos animais MDX apresentarem uma menor função motora em relação aos animais controle, os resultados indicam que o tratamento com G-CSF é capaz de reduzir os efeitos inflamatórios e atuar positivamente no processo de regeneração nervosa periférica após esmagamento do nervo isquiático / Abstract: Currently, much is known about the muscular involvement in DMD, but few studies have focused on the effects on the central nervous system (CNS), specifically in the microenvironment of spinal motor neurons. It is known that during the course of the disease, the axon terminal at the neuromuscular junction, enters a cycle of denervation (retraction) and reinnervation (sprouting). The possibility of modulation of MHC I presents itself as a new strategy to positively influence the process of synaptic plasticity after injury Peripheral Nervous System (PNS) and CNS. Such modulation may be accomplished through the use or development of special drugs. The granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) is a glycoprotein which was first described more than twenty years, has approval from ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) and is commonly used to treat neutropenia, or bone marrow transplants. The G-CSF has a multimodal neuroprotective effect l, including the anti-apoptotic activity in neurons, regeneration of vascularization, anti-inflammatory effect and stimulation of endogenous neurogenesis, being able to act effectively in the process of regeneration of the nervous system. In this study, we used MDX mice. The mice were divided into 4 groups (axotomy + G-CSF; axotomy, Control + G-CSF and Control), with n = 10. Included immunohistochemistry to the placebo group, where the animals received a daily dose of 200?m, subcutaneously, glucose 25%. Our results indicate that reduction of synapses in the alpha motoneurosn and increased astrogliosis , either due to partial disconnection between the target organ and the neuronal body during the cycles of degeneration /regeneration muscle that occur from first weeks of life in MDX mice. These cycles can pass retrogradely in alpha motoneurons cell bodies, causing a series of changes called chromatolysis. The sciatic nerve axotomy results in a significant increase of MHC I expression in both strains studied. However, in MDX strain, this increase is smaller, compared to C57BL/10. After treatment with G-CSF the expression of MCH I got bigger compared to untreated groups, and this may indicate an active role in the regenerative potential of the drug after injury. Also we suggest that while the animals present MDX a smaller motor function compared to control animals, the results indicate that treatment with G-CSF is capable of reducing the inflammatory effects and act positively on peripheral nerve regeneration process after nerve crush sciatic. Also our results indicate that treatment with G-CSF is able to reduce the inflammatory effects and act positively on peripheral nerve regeneration process after nerve crush sciatic / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural