Las proteínas quinasas BRSK1 y BRSK2 (Brain-specific kinase 1 y 2) pertenecen a la familia de las AMPK-related kinases, y son activadas mediante fosforilación por la proteína kinasa supresora de tumores LKB1. Las BRSKs se expresan mayoritariamente en cerebro, donde juegan un papel clave en el establecimiento de la polaridad neuronal y sinaptogénesis. En la neurona madura, BRSK1 modularía la función sináptica controlando la liberación de neurotransmisores en la neurona madura. Así pues, LKB1-BRSK1/2 constituye una nueva vía de señalización crucial para la función neuronal. Sin embargo, se desconoce cómo las BRSKs ejercen su función, dado que no se han descrito los mecanismos que regulan su actividad (LKB1 es una quinasa constitutivamente activa) ni los sustratos a través de los cuales median su función. En este trabajo se han obtenido y puesto a punto las herramientas bioquímicas para el estudio de las BRSKs (anticuerpos, constructos de DNA, preparaciones puras y activas, etc.), que se han utilizado para mostrar que tanto el desarrollo ontogénico del cerebro como la diferenciación neuronal transcurren con un aumento de expresión de BRSK1 y BRSK2. Mediante ensayos de gene-reporter luciferase e inmunoblots demostramos que las neurotrofinas NGF y BNDF promueven el aumento de la transcripción y expresión de las BRSKs, en un proceso mediado por la vía de señalización de Ras-Raf-MEK1-ERK1/2 y el factor de transcripción Sp1. Por otra parte, se ha caracterizado el patrón de localización subcelular de las BRSKs en neuronas corticales maduras: BRSK1 presenta un marcaje puntuado (similar al que del marcador de vesículas sinápticas sinaptofisina), y BRSK2 presenta una distribución homogénea a lo largo del soma, axón y dendritas, donde co-localiza con el marcador MAP2. Por primera vez se describe que las BRSKs se expresan en células gliales. Por primera vez se muestra en sinaptosomas de cerebro de rata la existencia de un pool de BRSK1, pero de BRSK2 o LKB1, en microdominios de membrana ricos en colesterol lipid rafts, y que esta localización resulta en una BRSK1 que presenta una mayor actividad kinasa que la proteína citosólica. Mediante ensayos de purificación de los lípidos de lipid rafts y reconstitución de vesículas multilamelares lipídicas, así como utilizando lípidos sintéticos, se muestra que la actividad kinasa BRSK1 (pero BRSK2) es regulada por el entorno lipídico mediante un mecanismo nuevo, diferente al de fosforilación por LKB1. Por último, se ha identificado un nuevo sustrato para BRSK1: la proteína t-SNARE sintaxina-1A, que regula la liberación de neurotransmisores a nivel presináptico. Mediante ensayos de fosforilación, generación de mutantes de deleción y análisis por espectrometría de masas se ha identificado un residuo de Serina como el residuo de sintaxina-1A fosforilado por BRSK1. Esta fosforilación presenta una estequiometría de 1 mol de fosfato incorporado por mol de sintaxina, y ha sido confirmada mediante ensayos radiométricos de fosforilación utilizando diferentes formas mutantes de las proteínas BRSK1 y sintaxina. Se ha generado y caracterizado un anticuerpo que reconoce específicamente el residuo de Ser fosforilado, lo que ha permitido demostrar que BRSK1 fosforila a esta Ser en sistemas celulares. / Brain-specific kinase 1 and 2 (BRSK1 and BRSK2) belong to the AMPK-related family protein kinases, and they are activated by direct phosphorylation by the LKB1 tumor suppressor protein. BRSK proteins are expressed within the brain, where they play a crucial role for establishing neuronal polarity and synaptogenesis. BRSK1 also modulate synaptic function and neurotransmitter release in the mature neuron. Therefore, LKB1-BRSKs is a new signaling pathway that plays a pivotal role in neuronal function. However, how BRSKs exert their functions is unknown, since their substrates and the mechanisms modulating their activity remain to be described. In this study we have obtained new molecular and biochemical tools for the study of the BRSKs (antibodies, DNA constructs, etc), that allow us to show that neuronal differentiation and brain maturation processes take place with an increase of expression of BRSK1 and BRSK2 proteins. Using gene-reporter and immunoblot assays, we show that NGF and BDNF neurotrophins induce an increase on BRSKs transcription and translation, by a process which involves Ras-Raf-MEK1-ERK1/2 signaling pathway and the Sp1 transcription factor. We also study BRSKs subcellular localization from rat cultured cortical neurons by immunocytochemical assays. BRSK1 shows a punctuate pattern, similar to that observed for the synaptic vesicle protein marker synaptophysin, whereas BRSK2 mainly localize throughout the neuron in both axon and dendrites co-localizes with dendritic marker MAP2. We also report by the first time that glial cells express both, BRSK1 and BRSK2 proteins. We provide biochemical and pharmacological evidences demonstrating that a pool of BRSK1, but not BRSK2 or LKB1, localizes at membrane lipid rafts. We also show that raft-associated BRSK1 has higher activity than BRSK1 from non-raft environment. Further, recombinant BRSK1 activity increased 3-fold when assayed with small multilamellar vesicles (SMV) generated with both, lipids extracted from synaptosomal raft fractions or synthetic SMV made with authentic phosphatidylcholine, cholesterol and sphingomyelin. Interaction with lipid rafts represents a new mechanism of BRSK1 activity modulation, additional to T-loop phosphorylation. Finally, we have identified a new BRSK1 substrate, namely syntaxin-1A. Using phosphorylation and mass-spec analysis we have mapped and identified a residue of Ser that is mainly phosphorylated by BRSK1, showing a stechiometry of 1 mol P per mol of protein. We have generated an antibody that specifically recognizes this Ser residue and provided evidences showing that this phosphorylation occurs in vivo.

Las sinapsis son un elemento clave para el funcionamiento del sistema nervioso y la formación de las sinapsis es un proceso decisivo a lo largo de la vida. El establecimiento de los contactos sinápticos ocurre tanto en el sistema nervioso en desarrollo como en el cerebro adulto. Durante todo este proceso las neuronas y las células gliales se encuentran íntimamente acopladas por todo el sistema nervioso. Las investigaciones de las últimas décadas han evidenciado que las células gliales poseen un rol que va más allá del clásicamente atribuido, demostrando que la glía posee una función relevante en la formación y en el funcionamiento de las sinapsis mediante la secreción de diversas moléculas, las cuales han sido caracterizadas principalmente desde un punto de vista postsináptico. Para el estudio de la interacción neurona-glía, el laboratorio de Neurobiología ha implementado microcultivos de neuronas aisladas del ganglio cervical superior, sistema en el cual una neurona individual crece sobre una gota de colágeno haciendo contacto consigo misma. Los microcultivos establecidos rutinariamente en el laboratorio, consisten en una sola neurona que crece en ausencia de otros tipos celulares, denominados SCM; y una sola neurona que crece en presencia de células gliales o GM. Con este sistema, estudios previos realizados en el laboratorio demostraron que las células gliales incrementan la frecuencia de la neurotransmisión espontánea y modifica la plasticidad a corto plazo. Durante el desarrollo de esta tesis doctoral, se estableció que la glía periférica inmadura in vitro e in vivo secretan la proteína matricelular SPARC, proteína que se expresa ampliamente en el sistema nervioso en desarrollo y en áreas sinaptogénicas, a pesar de lo cual se desconoce la función que tiene en el desarrollo y en la plasticidad. En este trabajo se caracterizan las funciones de SPARC sobre la neurotransmisión y la maduración de las sinapsis colinérgicas autápticas, observándose que concentraciones nanomolares de SPARC durante el desarrollo sináptico aumentan la frecuencia de la neurotransmisión espontánea e incrementan la depresión a corto plazo. La secreción local de SPARC sobre neuronas maduras durante 24-36 horas, incrementa solamente la depresión a corto plazo. Finalmente, mediante electrofisiológica y microscopía electrónica correlativa, demostramos que los terminales presinápticos desarrollados en presencia de concentraciones nanomolares de SPARC, presentan dos a tres veces menos vesículas sinápticas totales y vesículas sinápticas ancladas a las zonas activas. Las evidencias experimentales obtenidas en este trabajo señalan que la proteína matricelular SPARC retiene las sinapsis autápticas colinérgicas en un estado inmaduro. / The synapses are a key element for the Nervous system functions. They are established mainly during the nervous system development, but they can be formed in the adult nervous system as well. Neurons and glial cells are intimately coupled during all these processes. During the last decade it has been described that glial cells participate in the synapses establishment and information processing, they do so secreting factors. To study the neuron-glía interaction, our laboratory has set up neuronal microcultures, where a single neuron grows in a drop of collagen, a permissive substracte, surrounded by agarose, a non permissive substrate, forcing the neuron to develop inside the collagen drop, forcing it to have contact only with itself. These kind of synapses are called autapses. During this PhD thesis, we found that immature glial cells secrete SPARC in vitro and in vivo. We proved that SPARC has an effect over the neurotransmission and the presynaptic terminal maturations in cholinergic autapses; nanomolar concentration of SPARC applied during the neuronal development enhances the spontaneous neurotransmission and the short-term plasticity. We have also characterized that nanomolar concentration of SPARC decreases the total vesicular number and the docked vesicles number in presynaptic terminal. These experimental results obtained during the thesis lead us to propose that SPARC arrest the synapses in an immature stage.

Lesioned axons do not regenerate in the adult mammalian central nervous system, owing to the overexpression of inhibitory molecules such as myelin-derived proteins or chondroitin sulphate proteoglycans. In order to overcome axon inhibition, strategies based on extrinsic and intrinsic treatments have been developed. For myelin-associated inhibition, blockage with NEP1-40, receptor bodies or IN-1 antibodies has been used. In addition, endogenous blockage of cell signalling mechanisms induced by myelin-associated proteins is a potential tool for overcoming axon inhibitory signals. We examined the participation of glycogen synthase kinase 3 (GSK3beta) and ERK1/2 in axon regeneration failure in lesioned cortical neurons. We also investigated whether pharmacological blockage of GSK3beta and ERK1/2 activities facilitates regeneration after myelin-directed inhibition in two models: i) cerebellar granule cells and ii) lesioned entorhino-hippocampal pathway in slice cultures, and whether the regenerative effects are mediated by Nogo Receptor 1 (NgR1). We demonstrate that, in contrast to ERK1/2 inhibition, the pharmacological treatment of GSK3beta inhibition strongly facilitated regrowth of cerebellar granule neurons over myelin independently of NgR1. Lastly these regenerative effects were corroborated in the lesioned EHP in NgR1 -/- mutant mice. These results provide new findings for the development of new assays and strategies to enhance axon regeneration in injured cortical connections. On the other hand, and focused in the OMgp, by using recording electrophysiological nano-devices we found that, OMgp has a role in synaptic transmission, since it can induce excitatory postsynaptic potentials (EPSPs) in cultured hippocampal neurons.