Resumo não disponível

Resumo não disponível

Resumo não disponível

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Plastic Surgery Educational Foundation (PSEF) / American Society for Surgery of the Hand (ASSH) / Objetivos: Comparar o fenótipo e capacidade estimulatória in vitro de populações de células dendríticas (DC) de ratos; testar estas populações celulares na sobrevida de retalhos cutâneos alógenos (RcuA); avaliar os mecanismos pelos quais as DC condicionadas com rapamicina e pulsadas com lisado de hospedeiro, em associação a uma curta administração de drogas imunossupressoras e soro anti-linfocitário atuam na sobrevida de RCuA. Métodos: As DC foram condicionadas com rapamicina (DC GM+Rapa) ou IL-4 (DC controle), sendo pulsadas ou não com aloantígenos de doador. O fenótipo e função das células foram comparados in vitro. Testou-se o potencial destas DC de aumentar a sobrevida de RCuA e comparou-se a hiporesponsividade doadoraespecífica dos receptores de RCuA. Avaliou-se e quantificou-se a presença das células T reguladoras Foxp3+CD4+ (Tregs) nos retalhos transplantados e nos órgãos linfóides secundários com citometria de fluxo e imunofluorescência. Resultados: As DC GM+Rapa expressaram níveis menores de MHCII e CD40 e apresentaram menor capacidade para estimular células T em reação mista de linfócitos. Ao estímulo com LPS, as DC GM+Rapa produziram níveis significantemente menores de IL-6 e IL-10. Somente as DC GM+Rapa pulsadas com aloantígenos aumentaram significantemente a sobrevida dos retalhos cutâneos alógenos (>180 dias). Células T periféricas em receptores com sobrevida prolongada de RcuA mostraram hiporesponsividade doadorespecífica. Quantidades significantemente maiores de Tregs foram encontradas nos retalhos com sobrevida prolongada e nos órgãos linfóides secundários destes receptores. Conclusões: As DC GM+Rapa apresentaram fenótipo mais imaturo e menor capacidade de estimulação de células T do que a população controle. A administração de DC GM+Rapa pulsadas com aloantígenos prolongou significantemente a sobrevida dos RCuA, sendo este fato associado à expansão de Tregs. / Introduction: Clinically applicable protocols capable of promoting operational tolerance to vascularized skin allografts (VSA) would contribute towards a more widespread use of composite tissue allografts (CTA). This study compared tolerogeneic properties of different host bone-marrow (BM)-derived dendritic cells (DC) populations in vitro and their potential to prolong survival of VSA across a full MHC mismatch in rats. Methods: DC were generated either with GM-CSF, rapamycin and donor-alloAg-pulsing (GM+Rapa DCp) or GM-CSF and IL-4, with (control DCp) or without alloAg-pulsing (control DC). Phenotype and function were assessed in vitro. We then tested the potential of those DC, combined with transient cyclosporine and anti-lymphocyte serum treatment to mediate prolonged survival of VSA. Graft survival and donor-specific hyporesponsiveness were compared. Presence of Foxp3+CD4+T cells (Tregs) in VSA and secondary lymphoid organs was assessed and quantified by FACS and immunofluorescence. Results: These myeloid DC populations demonstrated LPS stimulation-resistant immature phenotypes. GM+Rapa DC displayed significantly lower T-cell stimulatory capacity and produced less proinflammatory cytokines upon TLR activation. When combined with transient immunosuppresion, GM+Rapa DCp was the only population to significantly prolong VSA survival (>180days), in a donor-specific hyporesponsive milieu. Significantly higher amounts of Tregs were detected in long-term surviving VSA and secondary lymphoid organs of these recipients. Conclusion: Among the DC populations studied herein, GM+Rapa DCp showed the most tolerogeneic profile in vitro and when employed in a clinically applicable protocol in vivo led to operational tolerance of VSA, an unprecedented finding in literature. Furthermore, this is the first report to correlate use of rapamycintreated DC with Tregs expansion in vivo. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Os imunossupressores tacrolimo (Tac) e sirolimo (Srl) são amplamente utilizados no transplante renal. Estes medicamentos apresentam estreita faixa terapêutica e estão associados a uma vasta gama de efeitos colaterais. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) parecem ter um impacto significativo sobre a farmacocinética dos imunossupressores. Com o objetivo de avaliar a associação de SNP nos genes PPP3CA e MTOR com a resposta farmacológica dos imunossupressores tacrolimo e sirolimo foram selecionados 156 indivíduos indicados para transplante renal entre os pacientes atendidos no Hospital do Rim e Hipertensão da UNIFESP. Esses indivíduos foram tratados com esquema imunossupressor baseado em tacrolimo ou convertido para sirolimo. Amostras de sangue foram coletadas antes do transplante para extração de DNA. As determinações das concentrações sanguíneas de Tac foram determinadas por chemiluminescent microparticle immunoassay (CMIA) e as concentrações sanguíneas de Srl foram obtidas pela técnica de HPLC (High- Performance Liquid Chromatography). Os polimorfismos do MTOR (c.1437T>C, T c.2997C>T e c.4731G>A) e PPP3CA (c.249G>A) foram identificados por PCR em tempo real. O polimorfismo PPP3CA c.246G>A não foi associado à dose diária de tacrolimo ou sirolimo. Já a concentração sanguínea de tacrolimo foi menor nos portadores do alelo A no terceiro dia e terceiro mês de estudo. Os polimorfismos do MTOR foram relacionados à concentração sanguínea corrigida pela dose de tacrolimo. Os portadores dos alelos raros G, T e C dos polimorfismos c.4731G>A, c.14337T>C e c.2997C>T, respectivamente, apresentaram valores de Co/Do de tacrolimo menores em relação aos não portadores destes alelos. As diferenças significativas ocorreram principalmente nos primeiros três meses de estudo. A concentração sanguínea de tacrolimo foi no geral menor nos portadores dos alelos raros, sendo significativamente menor no décimo quarto dia. Doses maiores de tacrolimo foram associadas aos alelos T do c.14337T>C e C do c.2997C>T. No sexto mês de estudo, os portadores dos alelos raros receberam doses de sirolimo significativamente maiores do que os não portadores. O alelo T do polimorfismo c.1437T>C foi associado a menores valores de Co/Do de sirolimo. Os SNPs c.2997C>T e c.1437T>C do MTOR encontram-se em desequilíbrio de ligação (D\'=0,981; r2=0,690). Nos três primeiros meses de estudo, os portadores do haplótipo TC receberam doses menores de tacrolimo e apresentaram a melhor relação Co/Do. Foi possível observar que após a randomização, o haplótipo TC continuou associado a menores doses de tacrolimo e de sirolimo e manteve a tendência de melhores índices de Co/Do de ambos os fármacos. Os polimorfismos c.1437T>C e c.4731G>A foram associados a parâmetros de função renal no grupo TAC. O alelo G do SNP c.4731G>A relacionou-se a valores menores de ureia no pré-Tx, menor redução de ureia e creatinina entre o pré-Tx e o sexto mês de estudo. O alelo T do SNP c.1437T>C também foi relacionado a menores valores de ureia no pré-Tx e menor redução de creatinina. No grupo TAC, o alelo raro do SNP PPP3CA c.249G>A foi relacionado a menores valores de triglicérides no pré-Tx e no grupo SRL uma menor variação de LDL-colesterol. Os portadores do alelo C do SNP c.2997C>T apresentaram menor aumento de colesterol total e LDL colesterol entre o pré-Tx e o sexto mês de estudo, maiores valores de HDL colesterol no pré-Tx e menores valores de triglicérides no sexto mês de estudo. Os portadores do alelo T do SNP c.1437T>C apresentaram menor aumento de colesterol total, LDL colesterol, VLDL colesterol e triglicérides. No sexto mês de estudo apresentaram menores valores de triglicérides em relação aos não portadores deste alelo. Os portadores do alelo G do SNP c.4731G>A tiveram variação menor de colesterol total, VLDL colesterol e triglicérides. Não foi encontrada relação dos polimorfimos estudados e a rejeição aguda comprovada por biópsia ou com a nefropatia crônica do enxerto. Esses resultados são sugestivos de que os polimorfismos do MTOR e PPP3CA estão associados com a dose e concentração sanguínea dos imunossupressores tacrolimo e sirolimo, assim como um perfil lipídico menos aterogênico. / The immunosuppressant tacrolimus (Tac) and Sirolimus (Srl) are widely used in renal transplantation. These drugs have a narrow therapeutic range and are associated with a wide range of side effects. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) have a significant impact on the pharmacokinetics of immunosuppressants. In order to evaluate the association of SNPs in genes MTOR and PPP3CA with the pharmacological response of immunosuppressive drugs tacrolimus and sirolimus were selected 156 individuals referred for kidney transplantation among patients treated in the Hospital do Rim e Hipertensão, UNIFESP. These individuals were treated with tacrolimus-based immunosuppressive regimen or converted to sirolimus. Blood samples were collected before transplantation for DNA extraction. Determinations of blood concentrations of Tac were determined by Chemiluminescent microparticle immunoassay (CMIA) and blood concentrations Srl were obtained by the technique of HPLC (High-Performance Liquid Chromatography). Polymorphisms of MTOR (c.1437T>C, T c.2997C>T and c.4731G>A) and PPP3CA (c.249G>A) were identified by real-time PCR. The Polymorphism PPP3CA c.246G>A was not associated with the daily dose of tacrolimus or sirolimus. The blood concentration of tacrolimus was lower in carriers of the allele on the third day and third month of study. The Polymorphisms of MTOR were related to blood concentration corrected by the dose of tacrolimus. The carriers of rare alleles G, T and C polymorphisms c.4731G> A, c.14337T> C and c.2997C> T, respectively, had values of Co/Do tacrolimus lower than the non-carriers of these alleles. Significant differences occurred mainly during the first three months of study. The blood concentration of tacrolimus was generally lower in carriers of the rare alleles being significantly lower on the fourteenth day. Higher doses of tacrolimus were associated with alleles c.14337T T>C and C c.2997C>T. In the sixth month of study, the carriers of rare alleles received doses of sirolimus significantly higher than non-carriers. SNPs c.2997C>T and c.1437T>C MTOR are in linkage disequilibrium (D \'= 0.981; r2 = 0.690). In the first three months of study, carriers of the TC haplotype received lower doses of tacrolimus and presented the best value for Co/Do. It was observed that after randomization, the TC haplotype remained associated with lower doses of tacrolimus and sirolimus and continued the trend of higher rates of Co/Do of both drugs. Polymorphisms c.1437T>C and c.4731G>A were associated with renal function parameters in the TAC group. The G allele of SNP c.4731G> A was related to lower levels of urea in the pre-Tx, a smaller reduction of urea and creatinine between the pre-Tx and sixth months of study. The T allele of SNP c.1437T>C was also related to lower levels of urea in the pre-Tx and a smaller reduction of creatinine. In the TAC group, the rare allele of SNP PPP3CA c.249G>A was related to lower levels of triglycerides in the pre-Tx and the SRL group a smaller variation of LDL-cholesterol. The C allele of the SNP c.2997C>T showed a lower increase in total cholesterol and LDL cholesterol between pre-Tx and sixth months of study, higher HDL cholesterol in pre-Tx and lower levels of triglycerides in the sixth month of study. The T allele of SNP c.1437T>C showed a lower increase in total cholesterol, LDL cholesterol, VLDL cholesterol and triglycerides. In the sixth month of the study, they had lower triglyceride levels compared to non-carriers of this allele. The G allele of SNP c.4731G>A change had lower total cholesterol, VLDL cholesterol and triglycerides. There was no relationship between the studied polymorphisms and biopsy-proven acute rejection or chronic allograft nephropathy. These results suggest that MTOR and PPP3CA polymorphisms are associated with dose and blood concentration of immunosuppressants tacrolimus and sirolimus, as well as a less atherogenic lipid profile.

A resistência à quimioterapia, a qual se constitui em um dos maiores desafios a serem superados durante o tratamento do cancer de mama, pode ser modulada por várias cascatas de sinalização cellular que levam ao aumento da sobrevivência celular. A via PI3K/Akt/mTOR é uma importante reguladora desse processo, visto que ela pode favorecer o crescimento tumoral após sua ativação por diversos receptores de fatores de crescimento, incluindo os receptores HER-2. Assim, nossa proposta foi investigar se a inibição dessa via poderia aumentar a sensibilidade de linhagens epiteliais mamárias humanas ao agente quimioterápico doxorrubicina. Também decidimos analisar o perfil de expressão gênica gerado por essa abordagem com o objetivo de compreender os mecanismos moleculares associados à resposta biológica. A rapamicina (um inibidor de mTOR) e a doxorrubicina foram utilizadas individualmente ou em combinação no tratamento de três linhagens epiteliais mamárias humanas: HB4a, C5.2 e SKBR3. A linhagem HB4a, uma linhagem derivada de epitélio mamário normal, expressa níveis basais do receptor HER-2. As outras duas linhagens expressam altos níveis desse receptor: a linhagem SKBR3 (derivada de adenocarcinoma mamário), expressa constitutivamente esse receptor e a linhagem C5.2 foi derivada da linhagem HB4a pela transfecção com o cDNA full-lenght do gene HER-2. A células foram tratadas com 20 nM de rapamicina associada ou não a doses de 30 nM a 1000 nM de doxorrubicina por 24, 48 e 72 horas. Após 24 horas, os resultados de citometria de fluxo mostraram que, enquanto as linhagens SKBR3 e C5.2 apresentaram indução de parada na fase G0/G1 do ciclo celular, a linhagem HB4a não demonstrou alterações significativas na distribuição do ciclo celular pelo tratamento com rapamicina. Esses resultados sugeriram que as linhagens SKBR3 e C5.2 foram mais sensíveis à rapamicina quando comparadas à linhagem HB4a. A doxorrubicina, por sua vez, induziu parada na fase S-G2/M do ciclo celular, a qual foi maior na linhagem HB4a comparada com as demais. De forma similar ao tratamento com doxorrubicina sozinha, o tratamento combinado também induziu parada em S-G2/M nas linhagens HB4a e C5.2. Assim, os efeitos da doxorrubicina foram predominantes aos da rapamicina na distribuição do ciclo celular no tratamento combinado nessas linhagens. Por outro lado, a linhagem SKBR3 mostrou um efeito proeminente da rapamicina, visto que sua associação com doxorrubicina induziu parada na fase G0/G1 do ciclo celular após exposição a 30 nM de doxorrubicina. Os ensaios de viabilidade celular mostraram que o tratamento combinado foi 20% mais eficiente na inibição do crescimento celular quando comparado à doxorrubicina sozinha nas três linhagens celulares, o que foi associado a uma redução de 2 vezes no IC50 da doxorrubicina. Para cada linhagem, os dados de microarray foram analisados usando o SAM (FDR 5%) para comparar os tratamento com doxorrubicina, rapamicina e o tratamento combinado aos seus respectivos controles. Considerando apenas as linhagens C5.2 e SKBR3, a anotação funcional dos genes modulados pelo tratamento combinado mostrou que os genes relacionados ao tratamento combinado estavam relacionados ao rearranjo de RNAs (splicing). Além disso, genes exclusivamente modulados pelo tratamento combinado mostrou funções associadas ao transporte intracellular enquanto que a resposta mediada por HER-2 no tratamento combinado incluiu alterçãoes na via do ubiquitina-proteossomo, glicólise e cadeia trasnportadora de elétrons. Em conjunto, nossos resultados pareceram afetar vias moleculares importantes relacionadas à sobrevivência tumoral em linhagens caracterizadas pela superexpressão de HER-2, o que foi associado a uma supressão de 2 vezes no IC50 da doxorrubicina. Esses dados ressaltam a relevância clínica da terapia combinada no contexto do HER-2, visto que essa associação pode ser capaz de reduzir a toxicidade dos pacientes submetidos à quimioterapia / Chemotherapy resistance, which is the major challenge to be overcome during breast cancer treatment, can be modulated by several signaling cascades that lead to increased cell survival. The PI3K/Akt/mTOR pathway is an important regulator of this process, as it can favour the tumor growth after its activation by several growth factor receptors, including HER-2 receptors. Thus, we proposed to investigate whether the inhibition of this pathway could improve the sensitivity of human HER-2-overexpressing breast epithelial cell lines to the chemotherapeutic agent doxorubicin. We also decided to analyze the gene expression profile generated by this approach to better understand the molecular mechanisms associated with the biological response. Rapamycin (a mTOR inhibitor) and doxorubicin were used individually or in combination on three human breast epithelial cell lines: HB4a, C5.2 e SKBR3. The HB4a cell, a normal mammary epithelial cell line, expresses basal levels of HER-2. The two other cell lines express high levels of this receptor: the SKBR3 cell (derived from a mammary adenocarcinoma) expresses constitutively this receptor.and the C5.2 cell was derived from HB4a cells transfected with the cDNA-full length of HER-2. The cells were treated with 20 M of rapamycin with or without 30nM to 1000nM of doxorubicin for 24, 48 and 72 hours. After 24 hours, the flow citometry results showed that while SKBR3 and C5.2 were arrested in G0/G1 phase, HB4a demonstrated no alterations in the cell cycle distribution after rapamycin treatment. These results showed that SKBR3 and C5.2 cells were more sensitive to rapamycin compared to HB4a. Doxorubicin, in turn, led the cells to a S-G2/M arrest which was greater in HB4a cells compared to SKBR3 and C5.2. Similarly to doxorubicin alone, the combined treatment also caused an increase of S-G2/M arrest in HB4a and C5.2 cells. So, doxorubicin effects were predominant to the rapamycin effects on the cell cycle distribution of the combined treatment in these cell lines. Otherwise, SKBR3 showed a predominant effect of rapamycin since its association with doxorubicin caused a G0/G1 arrest after exposure to 30 nM of doxorubicin. The viability assays showed that the combined treatment was 20% more effective in inhibiting cell growth than doxorubicin alone in the three cell lines, which was associated with a reduction in the IC50 of doxorubicin by 2-fold. For each cell line, microarray data were analyzed using SAM (FDR 5%) to compare doxorubicin, rapamycin and the combined treatment to the respective untreated cells. Considering only C5.2 and SKBR3 cells, Gene Ontology (GO) annotations of the genes modulated by the combined treatment showed altered genes related to RNA splicing. Moreover, genes exclusively modulated by the combined treatment showed altered functions related to intracellular trafficking whereas HER-2-mediated response to the combined treatment included changes in the ubiquitin-proteasome pathway, glycolysis and electron transport chain. Altogether, our results seemed to affect important molecular pathways related to tumor survival in HER-2- overexpressing cell lines, which was associated to a 2-fold suppression in the IC50 of doxorubicin. These findings highlight the clinical relevance of the rapamycin/doxorubicin combination therapy in HER-2 context, since this association could be able to decrease toxicity of patients undergoing chemotherapy

A resistência à quimioterapia, a qual se constitui em um dos maiores desafios a serem superados durante o tratamento do cancer de mama, pode ser modulada por várias cascatas de sinalização cellular que levam ao aumento da sobrevivência celular. A via PI3K/Akt/mTOR é uma importante reguladora desse processo, visto que ela pode favorecer o crescimento tumoral após sua ativação por diversos receptores de fatores de crescimento, incluindo os receptores HER-2. Assim, nossa proposta foi investigar se a inibição dessa via poderia aumentar a sensibilidade de linhagens epiteliais mamárias humanas ao agente quimioterápico doxorrubicina. Também decidimos analisar o perfil de expressão gênica gerado por essa abordagem com o objetivo de compreender os mecanismos moleculares associados à resposta biológica. A rapamicina (um inibidor de mTOR) e a doxorrubicina foram utilizadas individualmente ou em combinação no tratamento de três linhagens epiteliais mamárias humanas: HB4a, C5.2 e SKBR3. A linhagem HB4a, uma linhagem derivada de epitélio mamário normal, expressa níveis basais do receptor HER-2. As outras duas linhagens expressam altos níveis desse receptor: a linhagem SKBR3 (derivada de adenocarcinoma mamário), expressa constitutivamente esse receptor e a linhagem C5.2 foi derivada da linhagem HB4a pela transfecção com o cDNA full-lenght do gene HER-2. A células foram tratadas com 20 nM de rapamicina associada ou não a doses de 30 nM a 1000 nM de doxorrubicina por 24, 48 e 72 horas. Após 24 horas, os resultados de citometria de fluxo mostraram que, enquanto as linhagens SKBR3 e C5.2 apresentaram indução de parada na fase G0/G1 do ciclo celular, a linhagem HB4a não demonstrou alterações significativas na distribuição do ciclo celular pelo tratamento com rapamicina. Esses resultados sugeriram que as linhagens SKBR3 e C5.2 foram mais sensíveis à rapamicina quando comparadas à linhagem HB4a. A doxorrubicina, por sua vez, induziu parada na fase S-G2/M do ciclo celular, a qual foi maior na linhagem HB4a comparada com as demais. De forma similar ao tratamento com doxorrubicina sozinha, o tratamento combinado também induziu parada em S-G2/M nas linhagens HB4a e C5.2. Assim, os efeitos da doxorrubicina foram predominantes aos da rapamicina na distribuição do ciclo celular no tratamento combinado nessas linhagens. Por outro lado, a linhagem SKBR3 mostrou um efeito proeminente da rapamicina, visto que sua associação com doxorrubicina induziu parada na fase G0/G1 do ciclo celular após exposição a 30 nM de doxorrubicina. Os ensaios de viabilidade celular mostraram que o tratamento combinado foi 20% mais eficiente na inibição do crescimento celular quando comparado à doxorrubicina sozinha nas três linhagens celulares, o que foi associado a uma redução de 2 vezes no IC50 da doxorrubicina. Para cada linhagem, os dados de microarray foram analisados usando o SAM (FDR 5%) para comparar os tratamento com doxorrubicina, rapamicina e o tratamento combinado aos seus respectivos controles. Considerando apenas as linhagens C5.2 e SKBR3, a anotação funcional dos genes modulados pelo tratamento combinado mostrou que os genes relacionados ao tratamento combinado estavam relacionados ao rearranjo de RNAs (splicing). Além disso, genes exclusivamente modulados pelo tratamento combinado mostrou funções associadas ao transporte intracellular enquanto que a resposta mediada por HER-2 no tratamento combinado incluiu alterçãoes na via do ubiquitina-proteossomo, glicólise e cadeia trasnportadora de elétrons. Em conjunto, nossos resultados pareceram afetar vias moleculares importantes relacionadas à sobrevivência tumoral em linhagens caracterizadas pela superexpressão de HER-2, o que foi associado a uma supressão de 2 vezes no IC50 da doxorrubicina. Esses dados ressaltam a relevância clínica da terapia combinada no contexto do HER-2, visto que essa associação pode ser capaz de reduzir a toxicidade dos pacientes submetidos à quimioterapia / Chemotherapy resistance, which is the major challenge to be overcome during breast cancer treatment, can be modulated by several signaling cascades that lead to increased cell survival. The PI3K/Akt/mTOR pathway is an important regulator of this process, as it can favour the tumor growth after its activation by several growth factor receptors, including HER-2 receptors. Thus, we proposed to investigate whether the inhibition of this pathway could improve the sensitivity of human HER-2-overexpressing breast epithelial cell lines to the chemotherapeutic agent doxorubicin. We also decided to analyze the gene expression profile generated by this approach to better understand the molecular mechanisms associated with the biological response. Rapamycin (a mTOR inhibitor) and doxorubicin were used individually or in combination on three human breast epithelial cell lines: HB4a, C5.2 e SKBR3. The HB4a cell, a normal mammary epithelial cell line, expresses basal levels of HER-2. The two other cell lines express high levels of this receptor: the SKBR3 cell (derived from a mammary adenocarcinoma) expresses constitutively this receptor.and the C5.2 cell was derived from HB4a cells transfected with the cDNA-full length of HER-2. The cells were treated with 20 M of rapamycin with or without 30nM to 1000nM of doxorubicin for 24, 48 and 72 hours. After 24 hours, the flow citometry results showed that while SKBR3 and C5.2 were arrested in G0/G1 phase, HB4a demonstrated no alterations in the cell cycle distribution after rapamycin treatment. These results showed that SKBR3 and C5.2 cells were more sensitive to rapamycin compared to HB4a. Doxorubicin, in turn, led the cells to a S-G2/M arrest which was greater in HB4a cells compared to SKBR3 and C5.2. Similarly to doxorubicin alone, the combined treatment also caused an increase of S-G2/M arrest in HB4a and C5.2 cells. So, doxorubicin effects were predominant to the rapamycin effects on the cell cycle distribution of the combined treatment in these cell lines. Otherwise, SKBR3 showed a predominant effect of rapamycin since its association with doxorubicin caused a G0/G1 arrest after exposure to 30 nM of doxorubicin. The viability assays showed that the combined treatment was 20% more effective in inhibiting cell growth than doxorubicin alone in the three cell lines, which was associated with a reduction in the IC50 of doxorubicin by 2-fold. For each cell line, microarray data were analyzed using SAM (FDR 5%) to compare doxorubicin, rapamycin and the combined treatment to the respective untreated cells. Considering only C5.2 and SKBR3 cells, Gene Ontology (GO) annotations of the genes modulated by the combined treatment showed altered genes related to RNA splicing. Moreover, genes exclusively modulated by the combined treatment showed altered functions related to intracellular trafficking whereas HER-2-mediated response to the combined treatment included changes in the ubiquitin-proteasome pathway, glycolysis and electron transport chain. Altogether, our results seemed to affect important molecular pathways related to tumor survival in HER-2- overexpressing cell lines, which was associated to a 2-fold suppression in the IC50 of doxorubicin. These findings highlight the clinical relevance of the rapamycin/doxorubicin combination therapy in HER-2 context, since this association could be able to decrease toxicity of patients undergoing chemotherapy

CARVALHO, L. L. Inibição do mTOR agrava a mucosite intestinal induzida por irinotecano. 2016. 118 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-02-06T15:50:42Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_llcarvalho.pdf: 2848340 bytes, checksum: aaf346e9f648dc008eef1d64977af996 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-02-06T15:50:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_llcarvalho.pdf: 2848340 bytes, checksum: aaf346e9f648dc008eef1d64977af996 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-06T15:50:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_llcarvalho.pdf: 2848340 bytes, checksum: aaf346e9f648dc008eef1d64977af996 (MD5) Previous issue date: 2016-10-21 / INTRODUCTION. Colorectal cancer (CRC) is one of the most prevalent neoplasms worldwide, being one of the leading causes of death from cancer. In Brazil, it is the third most frequent cancer in men and second in women. In the last decades new drugs incorporated into the clinical protocols for the treatment of mCRM have provided a significant increase in the survival of patients with this type of malignancy. Among these drugs, irinotecan occupies a prominent place and is commonly used as the first line in the treatment of metastatic RCC. However, since all chemotherapy treatments have a burden, a quarter of patients receiving irinotecan have a severe intestinal mucositis as a more noticeable side effect. Deregulation of cell signaling pathways is certainly one of the main reasons for the development of cancer. The mammalian rapamycin target protein (mTOR) is responsible for cell growth and the PI3K / Akt / mTOR axis is often dysregulated in several types of cancer. Thus, this work focused on investigating the role of mTOR during experimental intestinal mucositis induced by irinotecan. METHODS. C57BL / 6 male mice (n = 6 / group) were given intraperitoneally with saline or irinotecan (75 mg / kg or 45 mg / kg) for four consecutive days and treated with rapamycin or everolimus (mTOR inhibitors, 1.5 mg / Kg and 3 mg / kg, respectively) followed by irinotecan administration. Periodically the body weight variation and scores were evaluated for the degree of diarrhea. After euthanasia of the animals, ileus samples were collected for determination of myeloperoxidase activity (MPO), histopathology and morphometric analysis and cytokine levels measurement [KC (human IL-8 analogue chemokine), IL-1β, TGF-β And IFN-γ]. Gene expression of the mRNA of the PI3K / Akt / mTOR pathway proteins was performed by qRT-PCR. Blood was also collected from the animals to evaluate the total white blood cell count. The ANOVA / Bonferroni or Kruskal-Wallis / Dunn tests were used for statistical analysis. P <0.05 was accepted as significant. The present work was approved by the ethics committee of UFC (protocol number 100/14). RESULTS. Animals injected with irinotecan 75 mg / kg showed an increase in the gene expression of PI3K, Akt and mTOR mRNA evidencing the participation of the pathway in iatrogeny. Irinotecan 75 mg / kg significantly reduced body weight, total leukocyte count, villus / crypt ratio and promoted a characteristic intestinal lesion when compared to the saline control group. In addition, inhibition of mTOR with rapamycin or everolimus generally aggravated most of these parameters, such as weight loss, diarrhea, histopathology, neutrophil infiltration, and inflammatory mediators such as TGF-β and IFN-γ. CONCLUSION. Inhibition of mTOR aggravates irinotecan-induced intestinal mucositis probably by increasing the pro-inflammatory response via TGF-β and IFN-γ with important involvement of Paneth's Cells. Financial support: CNPq. / INTRODUÇÃO. O câncer colorretal (CCR) é uma das neoplasias mais prevalentes em todo o mundo, sendo uma das principais causas de óbito por câncer. No Brasil, apresenta-se como o terceiro câncer mais frequente nos homens e segundo nas mulheres. Nas últimas décadas novas drogas incorporadas à protocolos clínicos para o tratamento do CCRm tem proporcionado um aumento significativo na sobrevida de pacientes com esse tipo de malignidade. Dentre estas drogas o irinotecano ocupa lugar de destaque e é comumente utilizado como primeira linha no tratamento do CCR metastático. Entretanto, como todo tratamento quimioterápico há um ônus, um quarto dos pacientes em tratamento com irinotecano apresentam uma grave mucosite intestinal como efeito colateral mais notório. A desregulação de vias de sinalização celular certamente é uma das principais razões para o desenvolvimento do câncer. A proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) é responsável pelo crescimento celular e o eixo compreendido por PI3K/Akt/mTOR está frequentemente desregulada em vários tipos de câncer. Dessa forma, esse trabalho focou em investigar o papel do mTOR durante a mucosite intestinal experimental induzida pelo irinotecano. MÉTODOS. Camundongos machos C57BL/6 (n=6/grupo) foram administrados intraperitonialmente com salina ou irinotecano (75 mg/kg ou 45 mg/kg) durante quatro dias consecutivos e tratados com rapamicina ou everolimo (inibidores de mTOR, 1,5 mg/kg e 3 mg/kg, respectivamente) seguidos da administração de irinotecano. Periodicamente foram avaliados a variação de peso corpóreo e escores para avaliação do grau de diarreia. Após a eutanásia dos animais, amostras de íleo foram coletadas para determinação da atividade de mieloperoxidase (MPO), histopatologia e análise morfométrica e dosagem dos níveis de citocinas [KC (quimiocina análoga da IL-8 humana), IL-1β, TGF-β e IFN-γ]. A expressão gênica do RNAm das proteínas da via PI3K/Akt/mTOR foi realizada por qRT-PCR. Também foi colhido sangue dos animais para avaliação da contagem total de leucócitos. Os testes de ANOVA/Bonferroni ou Kruskal-Wallis/Dunn foram usados para as análises estatísticas. P<0,05 foi aceito como significativo. O presente trabalho foi aprovado pelo comitê de ética da UFC (número de protocolo Nº100/14). RESULTADOS. Os animais injetados com irinotecano 75 mg/kg apresentaram um aumento na expressão gênica do RNAm de PI3K, Akt e mTOR evidenciando a participação da via na iatrogenia. O irinotecano 75 mg/kg reduziu significativamente o peso corpóreo, contagem total de leucócitos, razão vilo/cripta e promoveu uma lesão intestinal que lhe é característico quando comparado ao grupo controle salina. Além disso, de forma geral, a inibição do mTOR com rapamicina ou everolimo agravou a maioria desses parâmetros, tais como perda de peso, diarreia, histopatologia, infiltração de neutrófilos e mediadores inflamatórios como TGF-β e IFN-γ. CONCLUSÃO. A inibição do mTOR agrava a mucosite intestinal induzida por irinotecano provavelmente pelo aumento da resposta pro-inflamatória via TGF-β e IFN-γ com participação importante das Células de Paneth. Apoio financeiro: CNPq.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-05-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:18Z : No. of bitstreams: 1 Publico-13256.pdf: 2482735 bytes, checksum: eaf78b153b33731b3ff4250c42b843ae (MD5) / Introdução: não há consenso na literatura a respeito do impacto que angioplastia com implante de stents teria sobre a função endotelial vasomotriz. Inúmeros trabalhos têm mostrado piora da função endotelial após o implante de stents farmacológicos quando comparados aos stents convencionais. Objetivos: o principal objetivo deste trabalho foi avaliar o impacto dos stents convencionais e do Sirolimus, administrado por via oral, sobre a função endotelial vasomotriz. Material e métodos: foram selecionados pacientes em três grupos: grupo 1 - stent convencional com alta dose de Sirolimus (15 mg de ataque seguidos de 6 mg diariamente por 4 semanas); grupo 2 - stents convencionais com baixa dose de Sirolimus (6 mg de dose de ataque seguidos de 2 mg diariamente por 4 semanas) e grupo 3 - stent convencional sem Sirolimus. Modificações na vasomotricidade foram avaliadas com uso de infusão de acetilcolina intracoronariana em doses crescentes. A função vasomotriz independente do endotélio foi avaliada com uso de nitroglicerina. O segmento alvo de análise foram os 15 mm distais à borda do stent. Este segmento também foi avaliado com ultrassonografia intracoronariana. Resultados: os três grupos apresentavam características clínicas e angiográficas semelhantes. A porcentagem de variação do diâmetro foi semelhante em todos os três grupos nos dois momentos da avaliação (4 horas após implante do stent e aos 8 meses de acompanhamento) (p=0,469). Quatro horas após implante dos stents o segmento alvo apresentou disfunção endotelial leve a moderada caracterizada por vasoconstrição em média de -3% que se manteve aos oito meses e foi semelhante entre os grupos. Não houve correlação do volume de placa pela ultrassonografia com o grau de disfunção endotelial nos dois momentos da avaliação. A função vasomotriz independente do endotélio encontrava-se preservada nos dois momentos da avaliação nos três grupos. Conclusão: a disfunção endotelial foi semelhante entre os grupos nos dois momentos da avaliação e não sofreu alteração com implante dos stents e nem com o uso do Sirolimus oral por 4 semanas. Não houve correlação do volume de placa com disfunção endotelial. / Rationale: There is no consensus regarding the impact of stenting on long-term endothelial function. There have been reports of increased endothelial dysfunction with Sirolimus-eluting stents as compared to bare metal stenting (SC). Objectives: This study aims to assess the impact of SC and the effect of oral Sirolimus on endothelial function. Methods: Forty-five patients were randomized into three groups: SC + high-dose oral Sirolimus (initial dose of 15 mg, followed by 6 mg/day during four weeks); SC + lowdose Sirolimus (6 mg followed by 2 mg daily during four weeks); and SC without Sirolimus. Changes in vasoconstriction or vasodilation in a 15 mm segment starting at the distal stent end in response to acetylcholine and nitroglycerin were assessed by quantitative angiography. Results: The groups had similar angiographic characteristics. The percent variation in diameter in response to acetylcholine was similar in all groups at the two time points (p = 0.469). Four hours after stenting, the target segment presented an endothelial dysfunction that was maintained after eight months in all groups. In all groups, endothelium-independent vasomotion in response to nitroglycerin was similar at four hours and eight months, with increased target segment diameter after nitroglycerin infusion (p = 0.001). Conclusions: The endothelial dysfunction was similarly present at the 15 mm segment distal to the treated segment, at 4 hours and 8 months after stenting. Sirolimus administered orally during 4 weeks to prevent restenosis did not affect the status of endothelium-dependent and independent vasomotion. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Os imunossupressores tacrolimo (Tac) e sirolimo (Srl) são amplamente utilizados no transplante renal. Estes medicamentos apresentam estreita faixa terapêutica e estão associados a uma vasta gama de efeitos colaterais. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) parecem ter um impacto significativo sobre a farmacocinética dos imunossupressores. Com o objetivo de avaliar a associação de SNP nos genes PPP3CA e MTOR com a resposta farmacológica dos imunossupressores tacrolimo e sirolimo foram selecionados 156 indivíduos indicados para transplante renal entre os pacientes atendidos no Hospital do Rim e Hipertensão da UNIFESP. Esses indivíduos foram tratados com esquema imunossupressor baseado em tacrolimo ou convertido para sirolimo. Amostras de sangue foram coletadas antes do transplante para extração de DNA. As determinações das concentrações sanguíneas de Tac foram determinadas por chemiluminescent microparticle immunoassay (CMIA) e as concentrações sanguíneas de Srl foram obtidas pela técnica de HPLC (High- Performance Liquid Chromatography). Os polimorfismos do MTOR (c.1437T>C, T c.2997C>T e c.4731G>A) e PPP3CA (c.249G>A) foram identificados por PCR em tempo real. O polimorfismo PPP3CA c.246G>A não foi associado à dose diária de tacrolimo ou sirolimo. Já a concentração sanguínea de tacrolimo foi menor nos portadores do alelo A no terceiro dia e terceiro mês de estudo. Os polimorfismos do MTOR foram relacionados à concentração sanguínea corrigida pela dose de tacrolimo. Os portadores dos alelos raros G, T e C dos polimorfismos c.4731G>A, c.14337T>C e c.2997C>T, respectivamente, apresentaram valores de Co/Do de tacrolimo menores em relação aos não portadores destes alelos. As diferenças significativas ocorreram principalmente nos primeiros três meses de estudo. A concentração sanguínea de tacrolimo foi no geral menor nos portadores dos alelos raros, sendo significativamente menor no décimo quarto dia. Doses maiores de tacrolimo foram associadas aos alelos T do c.14337T>C e C do c.2997C>T. No sexto mês de estudo, os portadores dos alelos raros receberam doses de sirolimo significativamente maiores do que os não portadores. O alelo T do polimorfismo c.1437T>C foi associado a menores valores de Co/Do de sirolimo. Os SNPs c.2997C>T e c.1437T>C do MTOR encontram-se em desequilíbrio de ligação (D\'=0,981; r2=0,690). Nos três primeiros meses de estudo, os portadores do haplótipo TC receberam doses menores de tacrolimo e apresentaram a melhor relação Co/Do. Foi possível observar que após a randomização, o haplótipo TC continuou associado a menores doses de tacrolimo e de sirolimo e manteve a tendência de melhores índices de Co/Do de ambos os fármacos. Os polimorfismos c.1437T>C e c.4731G>A foram associados a parâmetros de função renal no grupo TAC. O alelo G do SNP c.4731G>A relacionou-se a valores menores de ureia no pré-Tx, menor redução de ureia e creatinina entre o pré-Tx e o sexto mês de estudo. O alelo T do SNP c.1437T>C também foi relacionado a menores valores de ureia no pré-Tx e menor redução de creatinina. No grupo TAC, o alelo raro do SNP PPP3CA c.249G>A foi relacionado a menores valores de triglicérides no pré-Tx e no grupo SRL uma menor variação de LDL-colesterol. Os portadores do alelo C do SNP c.2997C>T apresentaram menor aumento de colesterol total e LDL colesterol entre o pré-Tx e o sexto mês de estudo, maiores valores de HDL colesterol no pré-Tx e menores valores de triglicérides no sexto mês de estudo. Os portadores do alelo T do SNP c.1437T>C apresentaram menor aumento de colesterol total, LDL colesterol, VLDL colesterol e triglicérides. No sexto mês de estudo apresentaram menores valores de triglicérides em relação aos não portadores deste alelo. Os portadores do alelo G do SNP c.4731G>A tiveram variação menor de colesterol total, VLDL colesterol e triglicérides. Não foi encontrada relação dos polimorfimos estudados e a rejeição aguda comprovada por biópsia ou com a nefropatia crônica do enxerto. Esses resultados são sugestivos de que os polimorfismos do MTOR e PPP3CA estão associados com a dose e concentração sanguínea dos imunossupressores tacrolimo e sirolimo, assim como um perfil lipídico menos aterogênico. / The immunosuppressant tacrolimus (Tac) and Sirolimus (Srl) are widely used in renal transplantation. These drugs have a narrow therapeutic range and are associated with a wide range of side effects. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) have a significant impact on the pharmacokinetics of immunosuppressants. In order to evaluate the association of SNPs in genes MTOR and PPP3CA with the pharmacological response of immunosuppressive drugs tacrolimus and sirolimus were selected 156 individuals referred for kidney transplantation among patients treated in the Hospital do Rim e Hipertensão, UNIFESP. These individuals were treated with tacrolimus-based immunosuppressive regimen or converted to sirolimus. Blood samples were collected before transplantation for DNA extraction. Determinations of blood concentrations of Tac were determined by Chemiluminescent microparticle immunoassay (CMIA) and blood concentrations Srl were obtained by the technique of HPLC (High-Performance Liquid Chromatography). Polymorphisms of MTOR (c.1437T>C, T c.2997C>T and c.4731G>A) and PPP3CA (c.249G>A) were identified by real-time PCR. The Polymorphism PPP3CA c.246G>A was not associated with the daily dose of tacrolimus or sirolimus. The blood concentration of tacrolimus was lower in carriers of the allele on the third day and third month of study. The Polymorphisms of MTOR were related to blood concentration corrected by the dose of tacrolimus. The carriers of rare alleles G, T and C polymorphisms c.4731G> A, c.14337T> C and c.2997C> T, respectively, had values of Co/Do tacrolimus lower than the non-carriers of these alleles. Significant differences occurred mainly during the first three months of study. The blood concentration of tacrolimus was generally lower in carriers of the rare alleles being significantly lower on the fourteenth day. Higher doses of tacrolimus were associated with alleles c.14337T T>C and C c.2997C>T. In the sixth month of study, the carriers of rare alleles received doses of sirolimus significantly higher than non-carriers. SNPs c.2997C>T and c.1437T>C MTOR are in linkage disequilibrium (D \'= 0.981; r2 = 0.690). In the first three months of study, carriers of the TC haplotype received lower doses of tacrolimus and presented the best value for Co/Do. It was observed that after randomization, the TC haplotype remained associated with lower doses of tacrolimus and sirolimus and continued the trend of higher rates of Co/Do of both drugs. Polymorphisms c.1437T>C and c.4731G>A were associated with renal function parameters in the TAC group. The G allele of SNP c.4731G> A was related to lower levels of urea in the pre-Tx, a smaller reduction of urea and creatinine between the pre-Tx and sixth months of study. The T allele of SNP c.1437T>C was also related to lower levels of urea in the pre-Tx and a smaller reduction of creatinine. In the TAC group, the rare allele of SNP PPP3CA c.249G>A was related to lower levels of triglycerides in the pre-Tx and the SRL group a smaller variation of LDL-cholesterol. The C allele of the SNP c.2997C>T showed a lower increase in total cholesterol and LDL cholesterol between pre-Tx and sixth months of study, higher HDL cholesterol in pre-Tx and lower levels of triglycerides in the sixth month of study. The T allele of SNP c.1437T>C showed a lower increase in total cholesterol, LDL cholesterol, VLDL cholesterol and triglycerides. In the sixth month of the study, they had lower triglyceride levels compared to non-carriers of this allele. The G allele of SNP c.4731G>A change had lower total cholesterol, VLDL cholesterol and triglycerides. There was no relationship between the studied polymorphisms and biopsy-proven acute rejection or chronic allograft nephropathy. These results suggest that MTOR and PPP3CA polymorphisms are associated with dose and blood concentration of immunosuppressants tacrolimus and sirolimus, as well as a less atherogenic lipid profile.