L'infarctus du myocarde est une des première cause de mortalité mondiale et l'amélioration de la prise en charge et des techniques de reperfusion ont permis une amélioration de la survie des patients. Les méthodes de cardioprotection se sont développées afin de limiter la taille d'infarctus après l'épisode d'ischémie reperfusion dans le but de limiter les effets délétères de l'infarctus du myocarde, tels que le remodelage ventriculaire et l'insuffisance cardiaque.Dans notre étude, nous nous sommes particulièrement focalisés sur le rôle majeur de la mitochondrie dans les phénomènes de mort cellulaire associés à l'ischémie reperfusion. Au sein de la mitochondrie, notre cible principale était la sirtuine 3 (SIRT3), dont les modifications post-traductionnelles associées ont été montrées comme ayant un rôle potentiel dans la modulation de la mort cellulaire liée à l'ischémie reperfusion. Ainsi, dans la première partie de notre travail, nous avons pu mettre en évidence (1) la nécessité de la SIRT3 dans les mécanismes de cardioprotection chez les souris jeunes et (2) l'importance de la déacétylation par la SIRT3 de la cyclophiline D (CypD) dans la réussite de la cardioprotection.Récemment, de nombreuses études précliniques ont mis en avant de nouvelles techniques de cardioprotection efficace chez différents modèles animaux, qui n'ont pourtant pas fait leur preuve lors de la transposition en étude clinique. Dans une seconde partie de notre travail, nous nous sommes attachés à comprendre une des raisons de ces différents échec cliniques, en nous appuyant sur le simple constat que les études précliniques sont réalisées sur des animaux jeunes, alors que l'infarctus du myocarde est une pathologie des personnes sénescentes. Nous avons ainsi étudié l'impact du vieillissement sur différentes méthodes de cardioprotection utilisées au laboratoire, et avons mis en évidence (3) des modifications mitochondriales impactant la déacétylation de la CypD en réponse aux techniques de cardioprotection chez les souris âgées. Cette étude nous a permis de soulever un problème majeur des études précliniques, à savoir l'âge des modèles animaux utilisés par rapport à la pathologie étudiée.Ce travail a donc permis de déterminer le rôle crucial de la déacétylation de la CypD et de la SIRT3 dans la cardioprotection, mais aussi de soulever la question de l'âge des modèles animaux avant de possibles transferts des avancées thérapeutiques en clinique humaine / Myocardial infarction is one of the leading causes of global mortality and improved management and reperfusion techniques have improved patient survival. Cardioprotection methods have been developed to limit the infarct size after ischemia reperfusion episode in order to limit the deleterious effects of myocardial infarction, such as ventricular remodeling and heart failure.In our study, we focused particularly on the major role of mitochondria in cell death phenomena associated with ischemia reperfusion. Within the mitochondria, our main target was sirtuin 3 (SIRT3), whose associated post-translational modifications have been shown to have a potential role in modulating ischemia-related reperfusion cell death. Thus, in the first part of our work, we were able to highlight (1) the need for SIRT3 in cardioprotection mechanisms in young mice and (2) the importance of SIRT3 deacetylation of cyclophilin D (CypD) in the success of cardioprotection.Recently, numerous preclinical studies have highlighted new techniques of effective cardioprotection in different animal models, which have not yet proved their worth after transposition in clinical study. In a second part of our work, we have endeavored to understand one of the reasons for these different clinical failures, based on the simple observation that preclinical studies are carried out on young animals, while myocardial infarction is a pathology of senescent people. We studied the impact of aging on various cardioprotection methods used in the laboratory, and demonstrated (3) mitochondrial changes impacting the deacetylation of CypD in response to cardioprotection techniques in aged mice. This study allowed us to raise a major problem of preclinical studies, namely the age of animal models used in relation to the pathology studied.This work has thus made it possible to determine the crucial role of deacetylation of CypD and SIRT3 in cardioprotection, but also to raise the question of the age of animal models before possible transfer of therapeutic advances in human clinical practice

Dans la Maladie d'Alzheimer, les neurones meurent par un processus de mort cellulaire programmée, appelé apoptose. Des études in vivo, ont montré que cette étape de destruction somatique, tardive, est précédée de phénomènes précoces de dysfonctionnements synaptiques et de dégénérescences axonales. Néanmoins, en l'absence d'outils appropriés, leurs modalités et leurs mécanismes moléculaires demeurent encore mal connus. Nous nous proposons d'aborder cette problématique en utilisant un nouveau système de culture primaire de neurones appelé " microfluidique " permettant la compartimentalisation efficace des axones et des somas de neurones issus du système nerveux central. Grâce à cet outil nous mettons en évidence qu'un stress appliqué uniquement au niveau du corps cellulaire est suffisant pour induire une dégénérescence axonale. Il semble donc qu'un signal de dégénérescence se soit propagé dans l'axone depuis le soma. D'un point de vue moléculaire, la map kinase JNK impliquée dans les phases précoces de l'apoptose est ici le premier signal observé dans l'axone, contrôlant la fission des mitochondries et l'activation des caspases, qui sont les effecteurs moléculaires de la phase d'exécution de l'apoptose. De plus, nous avons démontré que le NAD+, un élément clef dans la bioénergétique du neurone, était lui aussi impliqué. Ainsi nos résultats suggèrent que le NAD+ et le programme apoptotique peuvent ensemble participer au devenir de l'axone. En conclusion, ce travail s'intègre dans la compréhension des mécanismes de la dégénérescence axonale observée dans les maladies neurodégénératives telle que la Maladie d'Alzheimer

Sirt3, une des sept sirtuines chez les mammifères, est une déacétylase mitochondriale NAD+-dépendante qui joue un rôle dans le contrôle des facteurs clés de plusieurs voies métaboliques. Sirt3 déacétyle et active un grand nombre d'enzymes mitochondriales impliquées dans l'activité de la chaîne respiratoire, la production d'ATP, le cycle de Krebs, ainsi que le cycle de l'urée. Parallèlement à son rôle dans le métabolisme énergétique, l'activité mitochondriale intervient également dans l'induction de l'apoptose ainsi que dans la régulation de la prolifération et la différenciation cellulaires. En particulier les travaux du laboratoire ont montré qu'il existe une véritable régulation de la différenciation myogénique par l'activité mitochondriale. Comme Sirt3 régule l'activité mitochondriale, nous nous sommes intéressés à étudier l'implication de cette sirtuine dans la différenciation des myoblastes. Dans une première partie, nous avons évalué l'expression endogène de Sirt3 au cours de la différenciation des myoblastes murins C2C12, puis étudié l'effet de son inhibition sur le processus de différenciation et sur l'activité mitochondriale. Nous avons montré que l'expression de Sirt3 endogène augmente après induction de la différenciation des C2C12. Une inhibition stable de l'expression de Sirt3 par interférence (Short hairpin Sirt3, shSirt3) entraîne : 1) un blocage de la différenciation terminale des C2C12 reflété par une chute significative de l'index de fusion ainsi que de l'expression des marqueurs myogéniques MyoD, Myogénine et troponine T ; 2) une diminution de l'activité mitochondriale reflétée par une altération de l'expression de PGC-1alpha, VDAC et citrate synthase, et une diminution des activités enzymatiques des complexes de la chaîne respiratoire et de la respiration maximale des myoblastes ; 3) une augmentation de la production de DROs. Ces résultats suggèrent un rôle important de Sirt3 dans la différenciation des myoblastes, en relation avec son influence sur l'activité mitochondriale.Dans une seconde partie, nous avons évalué l'importance de Sirt3 in vivo sur le développement et le métabolisme du tissu musculaire en étudiant le phénotype de souris surexprimant l'isoforme courte (MCK-SIRT3M3) ou l'isoforme longue (MCK-SIRT3M1) de Sirt3 spécifiquement dans le muscle squelettique. Nos premiers résultats obtenus à l'âge de 3 mois montrent que la capacité oxydative des souris MCK-SIRT3M1 est plus faible et celle des souris MCK-SIRT3M3 plus élevée par rapport aux souris sauvages. Les souris MCK-SIRT3M3 présentent une atrophie musculaire dès l'âge de trois mois alors que la capacité musculaire et l'activité mitochondriale dans les muscles de ces souris ne sont pas modifiées. Avec l'âge, le phénotype des souris surexprimant l'isoforme M3 dans le muscle est plus marqué : l'atrophie s'accentue, le nombre de mitochondries augmente, et l'expression de la myosine de type 1 augmente alors que l'expression des myosines de type II diminue. Ces données indiquent que l'isoforme courte de Sirt 3 aurait une influence dans le développement et le métabolisme du muscle squelettique de souris. / Sirt3, one of the seven mammalian sirtuins, is a mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)-dependent deacetylase, and has been shown to control multiple key metabolic pathways. Sirt3 deacetylates and activates a large number of mitochondrial enzymes implicated in the activity of respiratory chain and ATP production, TCA and Urea cycles. We have previously shown that mitochondrial activity is importantly involved in the regulation of myoblast differentiation. Since Sirt3 modulates mitochondrial activity, we have investigated its influence on myoblast differentiation. First, we have evaluated endogen Sirt3 expression during C2C12 myoblast differentiation and then we examined the effect of its inhibition on the differentiation processes and on mitochondrial activity. We have shown that Sirt3 protein expression increased after the induction of myoblast differentiation. A stable inhibition of Sirt3 expression, using short hairpin Sirt3 (shSirt3) in C2C12 myoblasts resulted in: 1) abrogation of terminal differentiation reflected by a sharp decrease of the fusion index and a significant decrease of Myogenin, MyoD and Troponin T protein expression; 2) a decrease in mitochondrial activity reflected by alterations in PGC1-alpha, VDAC and citrate synthase expression, and a decrease in respiratory chain complexes activity and myoblast maximal respiration, 3) an increase in ROS production. These data suggest that Sirt3 plays an important role in the regulation of myoblast differentiation through its influence on mitochondrial activity.In a second part, to investigate the role of Sirt3, in vivo, in myogenesis and in mitochondrial activity, we have studied the effect of Sirt3 isoforms (short and long, MCK-SIRT3M3 and MCK-SIRT3M1 respectively) overexpression exclusively in skeletal muscle tissue of transgenic mice. We show that basal metabolism is lower MCK-SIRT3M1 mice and higher in MCK-SIRT3M3 compared to WT mice at 3 months of age. In 3 month-old MCK-SIRT3M3 mice, skeletal muscle is atrophied while muscle capacity and mitochondrial activity are not altered. Skeletal muscle phenotype evolves with age, in MCK-SIRT3M3 mice : increase in muscle atrophy, mitochondrial content. These data suggest that Sirt3 short isoform plays an important role in skeletal muscle development and metabolism in mice.

Dans les pays industrialisés, les rétinopathies ischémiques proliférantes telles que la rétinopathie diabétique et la rétinopathie du prématuré sont les principales causes de cécité chez les individus en âge de travailler et la population pédiatrique. Ces pathologies sont caractérisées par une dégénérescence microvasculaire initiale suivie d’une hyper-vascularisaton compensatoire disproportionnée et pathologique. Les sirtuines constituent une importante famille de protéines impliquées dans le métabolisme et la réponse au stress. Plus particulièrement, sirtuine 3 (SIRT3) est une déacétylase mitochondriale primordiale qui agit au cœur du métabolisme énergétique et de l’activation de nombreuses voies métaboliques oxydatives. Nos résultats démontrent pour la première fois qu’une déficience en SIRT3 diminue la sévérité des lésions vasculaires dans le modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR). En plus de stimuler l’angiogénèse, l’absence de SIRT3 est aussi associée à une augmentation de la glycolyse, possiblement en activant la famille de gènes 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase (PFKFB). Nous suggérons que le manque de SIRT3 est impliqué dans l’effet Warburg et procure ainsi un avantage prolifératif et protecteur dans l’OIR. La présente étude propose SIRT3 comme nouvelle cible thérapeutique potentielle dans la rétinopathie du prématuré, une maladie dont les complications désastreuses persistent tout au long de la vie. / Proliferative ischemic retinopathies such as proliferative diabetic retinopathy and retinopathy of prematurity (ROP) are the leading causes of blindness in working age and pediatric populations in industrialized countries. These pathologies are characterized by an initial microvascular degeneration followed by a disproportionate compensatory but pathological hyper-vascularization mounted by the hypoxic and energy deficient retina in an attempt to reinstate metabolic equilibrium. Sirtuins are an important family of protein involved in metabolism and stress response. Sirtuin 3 (SIRT3) in particular is a major mitochondrial deacetylase central to energy metabolism and the regulation of many oxidative pathways. For the first time, our results show that a lack of SIRT3 decreases the severity of vascular lesions in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Deficiency in SIRT3 not only stimulates angiogenesis, but also increases glycolysis, possibly through indirect activation of the gene family 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase (PFKFB). We suggest that a lack of SIRT3 is involved in the Warburg effect and therefore confers a proliferative advantage that is protective in OIR. The present study puts forward SIRT3 as a new potential therapeutic target for ROP, a disease leading to life-long vision complications.