No capitulo I desta tese estudamos pacientes em remissão cirúrgica da doença de Cushing (DC) e seu comportamento em relação aos níveis de cortisol no período pósoperatório. Níveis baixos de cortisol no período pós-operatório estão claramente relacionados com a remissão cirúrgica da DC. Entretanto, alguns pacientes em remissão apresentam elevado pico de cortisol sérico durante as primeiras 48 horas (h) da avaliação após a cirurgia transesfenoidal e muitas vezes apresentam queda mais tardia do cortisol no período pós-operatório. O objetivo principal deste estudo foi caracterizar este grupo de pacientes para melhor compreensão do comportamento do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal destes casos. Pela possibilidade de pacientes com menor gravidade da DC apresentarem menor supressão dos corticotrofos peritumorais, foram avaliados os critérios clínicos e laboratoriais relacionados ao hipercortisolismo no momento do diagnóstico da doença objetivando confirmar a hipótese de que os pacientes com uma forma mais leve da DC teriam maiores picos de cortisol nas primeiras 48 h da avaliação pós-operatória. Foram avaliados 70 pacientes em remissão cirúrgica da DC, acompanhados em média por 6 anos, procedentes de uma coorte em acompanhamento regular no ambulatório de Neuroendocrinologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Foi observado que menores níveis de cortisol livre urinário de 24 h no período pré-operatório foram associados a maiores picos do cortisol sérico no período pós-operatório. O ponto de corte definido para Cushing leve foi o cortisol livre urinário de 24 h abaixo de três vezes o limite superior da normalidade para o método utilizado (n=39). Outros critérios bioquímicos envolvidos na avaliação do comprometimento do eixo hipotálamo hipófise adrenal no momento do diagnóstico da síndrome de Cushing e da DC foram igualmente avaliados, entre eles: a intensidade de supressão do cortisol sérico após 1 mg de dexametasona overnight ou após 8mg de dexametasona, níveis de cortisol sérico à meia-noite, de ACTH plasmático e de sulfato de dehidroepiandrosterona, entretanto nenhum deles foi capaz de identificar diferentes picos de cortisol sérico durante as primeiras 24-48 h do período pós-operatório. Estes 39 pacientes, também possuíam menor comprometimento da função sexual e menor prevalência de fragilidade capilar no momento da investigação da DC. Em 10-12 dias ou mesmo em 30 dias após a cirurgia transesfenoidal os níveis de cortisol sérico foram semelhantes entre pacientes com ou sem DC leve e foram compatíveis com remissão da DC. No capitulo II foi estudado o comportamento da pressão arterial (PA) sistêmica de pacientes com acromegalia. O método utilizado foi a monitorização ambulatorial de 24h (MAPA). O artigo retrata 37 pacientes que fazem parte da coorte de pacientes com acromegalia em acompanhamento no ambulatório de Neuroendocrinologia do HCPA. O objetivo foi determinar a homeostase pressórica destes pacientes, sua associação com critérios bioquímicos de atividade da acromegalia e parâmetros ecocardiográficos. Os pacientes foram estratificados em doença em remissão, controlada por medicamentos ou ativa. Foi realizada a aferição da PA sistêmica durante as consultas ambulatoriais, a MAPA, e a avaliação de parâmetros metabólicos (perfil lipídico, níveis glicêmicos, aferição do peso e altura corporal e a medida do índice de massa corporal). Devido à elevada prevalência de síndrome de apneia do sono ou hipopneia em pacientes com acromegalia e sua possibilidade de interferência nos níveis pressóricos, esta alteração também foi investigada. Foi observado que a medida da PA sistêmica de consultório superestimou a prevalência de hipertensão nesta coorte. A PA aferida pela MAPA classificou 23% dos indivíduos analisados como hipertensos, enquanto a pressão de consultório classificou 32% deles como portadores de hipertensão. Além disto, as medidas de pressão realizadas pela MAPA foram associadas com os parâmetros de atividade da acromegalia, seja com os níveis de fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF1, do inglês Insulin-like growth factor type 1) seja com os níveis de hormônio de crescimento humano (GH, do inglês Growth hormone). Os níveis pressóricos aferidos pela MAPA, especialmente PA sistólica noturna, foram associados a parâmetros ecocardiográficos de cardiomiopatia. Além disto, a ausência de descenso noturno da PA sistólica foi associada positivamente a maiores níveis de GH e à presença de hipertrofia ventricular esquerda. Conclusões: Os dados destes dois estudos acrescentam importantes contribuições para o entendimento destas patologias. No estudo 1, pacientes com níveis de cortisolúria de 24 h < 3 x acima do limite superior da normalidade do método utilizado para esta medida, apresentaram maior pico de cortisol nas primeiras 24 h de pós-operatório, demonstrando maior resposta ao estresse cirúrgico dos corticotrofos peri-tumorais. Estes pacientes com cortisolúria de 24 h < 3 x o limite superior da normalidade foram classificados como portadores de DC leve. Estes pacientes podem necessitar aguardar entre 10 dias a 1 mês para a completa definição da remissão da DC após o procedimento cirúrgico. No estudo 2, demonstrou-se que a utilização da MAPA em pacientes com acromegalia é uma ferramenta útil para o entendimento da homeostase pressórica, e ainda observou-se associação de hipertrofia relativa do ventrículo esquerdo a níveis de PA sistólica noturna, mesmo após o ajuste para fatores de risco classicamente associados com hipertrofia ventricular esquerda.

No capitulo I desta tese estudamos pacientes em remissão cirúrgica da doença de Cushing (DC) e seu comportamento em relação aos níveis de cortisol no período pósoperatório. Níveis baixos de cortisol no período pós-operatório estão claramente relacionados com a remissão cirúrgica da DC. Entretanto, alguns pacientes em remissão apresentam elevado pico de cortisol sérico durante as primeiras 48 horas (h) da avaliação após a cirurgia transesfenoidal e muitas vezes apresentam queda mais tardia do cortisol no período pós-operatório. O objetivo principal deste estudo foi caracterizar este grupo de pacientes para melhor compreensão do comportamento do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal destes casos. Pela possibilidade de pacientes com menor gravidade da DC apresentarem menor supressão dos corticotrofos peritumorais, foram avaliados os critérios clínicos e laboratoriais relacionados ao hipercortisolismo no momento do diagnóstico da doença objetivando confirmar a hipótese de que os pacientes com uma forma mais leve da DC teriam maiores picos de cortisol nas primeiras 48 h da avaliação pós-operatória. Foram avaliados 70 pacientes em remissão cirúrgica da DC, acompanhados em média por 6 anos, procedentes de uma coorte em acompanhamento regular no ambulatório de Neuroendocrinologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Foi observado que menores níveis de cortisol livre urinário de 24 h no período pré-operatório foram associados a maiores picos do cortisol sérico no período pós-operatório. O ponto de corte definido para Cushing leve foi o cortisol livre urinário de 24 h abaixo de três vezes o limite superior da normalidade para o método utilizado (n=39). Outros critérios bioquímicos envolvidos na avaliação do comprometimento do eixo hipotálamo hipófise adrenal no momento do diagnóstico da síndrome de Cushing e da DC foram igualmente avaliados, entre eles: a intensidade de supressão do cortisol sérico após 1 mg de dexametasona overnight ou após 8mg de dexametasona, níveis de cortisol sérico à meia-noite, de ACTH plasmático e de sulfato de dehidroepiandrosterona, entretanto nenhum deles foi capaz de identificar diferentes picos de cortisol sérico durante as primeiras 24-48 h do período pós-operatório. Estes 39 pacientes, também possuíam menor comprometimento da função sexual e menor prevalência de fragilidade capilar no momento da investigação da DC. Em 10-12 dias ou mesmo em 30 dias após a cirurgia transesfenoidal os níveis de cortisol sérico foram semelhantes entre pacientes com ou sem DC leve e foram compatíveis com remissão da DC. No capitulo II foi estudado o comportamento da pressão arterial (PA) sistêmica de pacientes com acromegalia. O método utilizado foi a monitorização ambulatorial de 24h (MAPA). O artigo retrata 37 pacientes que fazem parte da coorte de pacientes com acromegalia em acompanhamento no ambulatório de Neuroendocrinologia do HCPA. O objetivo foi determinar a homeostase pressórica destes pacientes, sua associação com critérios bioquímicos de atividade da acromegalia e parâmetros ecocardiográficos. Os pacientes foram estratificados em doença em remissão, controlada por medicamentos ou ativa. Foi realizada a aferição da PA sistêmica durante as consultas ambulatoriais, a MAPA, e a avaliação de parâmetros metabólicos (perfil lipídico, níveis glicêmicos, aferição do peso e altura corporal e a medida do índice de massa corporal). Devido à elevada prevalência de síndrome de apneia do sono ou hipopneia em pacientes com acromegalia e sua possibilidade de interferência nos níveis pressóricos, esta alteração também foi investigada. Foi observado que a medida da PA sistêmica de consultório superestimou a prevalência de hipertensão nesta coorte. A PA aferida pela MAPA classificou 23% dos indivíduos analisados como hipertensos, enquanto a pressão de consultório classificou 32% deles como portadores de hipertensão. Além disto, as medidas de pressão realizadas pela MAPA foram associadas com os parâmetros de atividade da acromegalia, seja com os níveis de fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF1, do inglês Insulin-like growth factor type 1) seja com os níveis de hormônio de crescimento humano (GH, do inglês Growth hormone). Os níveis pressóricos aferidos pela MAPA, especialmente PA sistólica noturna, foram associados a parâmetros ecocardiográficos de cardiomiopatia. Além disto, a ausência de descenso noturno da PA sistólica foi associada positivamente a maiores níveis de GH e à presença de hipertrofia ventricular esquerda. Conclusões: Os dados destes dois estudos acrescentam importantes contribuições para o entendimento destas patologias. No estudo 1, pacientes com níveis de cortisolúria de 24 h < 3 x acima do limite superior da normalidade do método utilizado para esta medida, apresentaram maior pico de cortisol nas primeiras 24 h de pós-operatório, demonstrando maior resposta ao estresse cirúrgico dos corticotrofos peri-tumorais. Estes pacientes com cortisolúria de 24 h < 3 x o limite superior da normalidade foram classificados como portadores de DC leve. Estes pacientes podem necessitar aguardar entre 10 dias a 1 mês para a completa definição da remissão da DC após o procedimento cirúrgico. No estudo 2, demonstrou-se que a utilização da MAPA em pacientes com acromegalia é uma ferramenta útil para o entendimento da homeostase pressórica, e ainda observou-se associação de hipertrofia relativa do ventrículo esquerdo a níveis de PA sistólica noturna, mesmo após o ajuste para fatores de risco classicamente associados com hipertrofia ventricular esquerda.

No capitulo I desta tese estudamos pacientes em remissão cirúrgica da doença de Cushing (DC) e seu comportamento em relação aos níveis de cortisol no período pósoperatório. Níveis baixos de cortisol no período pós-operatório estão claramente relacionados com a remissão cirúrgica da DC. Entretanto, alguns pacientes em remissão apresentam elevado pico de cortisol sérico durante as primeiras 48 horas (h) da avaliação após a cirurgia transesfenoidal e muitas vezes apresentam queda mais tardia do cortisol no período pós-operatório. O objetivo principal deste estudo foi caracterizar este grupo de pacientes para melhor compreensão do comportamento do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal destes casos. Pela possibilidade de pacientes com menor gravidade da DC apresentarem menor supressão dos corticotrofos peritumorais, foram avaliados os critérios clínicos e laboratoriais relacionados ao hipercortisolismo no momento do diagnóstico da doença objetivando confirmar a hipótese de que os pacientes com uma forma mais leve da DC teriam maiores picos de cortisol nas primeiras 48 h da avaliação pós-operatória. Foram avaliados 70 pacientes em remissão cirúrgica da DC, acompanhados em média por 6 anos, procedentes de uma coorte em acompanhamento regular no ambulatório de Neuroendocrinologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Foi observado que menores níveis de cortisol livre urinário de 24 h no período pré-operatório foram associados a maiores picos do cortisol sérico no período pós-operatório. O ponto de corte definido para Cushing leve foi o cortisol livre urinário de 24 h abaixo de três vezes o limite superior da normalidade para o método utilizado (n=39). Outros critérios bioquímicos envolvidos na avaliação do comprometimento do eixo hipotálamo hipófise adrenal no momento do diagnóstico da síndrome de Cushing e da DC foram igualmente avaliados, entre eles: a intensidade de supressão do cortisol sérico após 1 mg de dexametasona overnight ou após 8mg de dexametasona, níveis de cortisol sérico à meia-noite, de ACTH plasmático e de sulfato de dehidroepiandrosterona, entretanto nenhum deles foi capaz de identificar diferentes picos de cortisol sérico durante as primeiras 24-48 h do período pós-operatório. Estes 39 pacientes, também possuíam menor comprometimento da função sexual e menor prevalência de fragilidade capilar no momento da investigação da DC. Em 10-12 dias ou mesmo em 30 dias após a cirurgia transesfenoidal os níveis de cortisol sérico foram semelhantes entre pacientes com ou sem DC leve e foram compatíveis com remissão da DC. No capitulo II foi estudado o comportamento da pressão arterial (PA) sistêmica de pacientes com acromegalia. O método utilizado foi a monitorização ambulatorial de 24h (MAPA). O artigo retrata 37 pacientes que fazem parte da coorte de pacientes com acromegalia em acompanhamento no ambulatório de Neuroendocrinologia do HCPA. O objetivo foi determinar a homeostase pressórica destes pacientes, sua associação com critérios bioquímicos de atividade da acromegalia e parâmetros ecocardiográficos. Os pacientes foram estratificados em doença em remissão, controlada por medicamentos ou ativa. Foi realizada a aferição da PA sistêmica durante as consultas ambulatoriais, a MAPA, e a avaliação de parâmetros metabólicos (perfil lipídico, níveis glicêmicos, aferição do peso e altura corporal e a medida do índice de massa corporal). Devido à elevada prevalência de síndrome de apneia do sono ou hipopneia em pacientes com acromegalia e sua possibilidade de interferência nos níveis pressóricos, esta alteração também foi investigada. Foi observado que a medida da PA sistêmica de consultório superestimou a prevalência de hipertensão nesta coorte. A PA aferida pela MAPA classificou 23% dos indivíduos analisados como hipertensos, enquanto a pressão de consultório classificou 32% deles como portadores de hipertensão. Além disto, as medidas de pressão realizadas pela MAPA foram associadas com os parâmetros de atividade da acromegalia, seja com os níveis de fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF1, do inglês Insulin-like growth factor type 1) seja com os níveis de hormônio de crescimento humano (GH, do inglês Growth hormone). Os níveis pressóricos aferidos pela MAPA, especialmente PA sistólica noturna, foram associados a parâmetros ecocardiográficos de cardiomiopatia. Além disto, a ausência de descenso noturno da PA sistólica foi associada positivamente a maiores níveis de GH e à presença de hipertrofia ventricular esquerda. Conclusões: Os dados destes dois estudos acrescentam importantes contribuições para o entendimento destas patologias. No estudo 1, pacientes com níveis de cortisolúria de 24 h < 3 x acima do limite superior da normalidade do método utilizado para esta medida, apresentaram maior pico de cortisol nas primeiras 24 h de pós-operatório, demonstrando maior resposta ao estresse cirúrgico dos corticotrofos peri-tumorais. Estes pacientes com cortisolúria de 24 h < 3 x o limite superior da normalidade foram classificados como portadores de DC leve. Estes pacientes podem necessitar aguardar entre 10 dias a 1 mês para a completa definição da remissão da DC após o procedimento cirúrgico. No estudo 2, demonstrou-se que a utilização da MAPA em pacientes com acromegalia é uma ferramenta útil para o entendimento da homeostase pressórica, e ainda observou-se associação de hipertrofia relativa do ventrículo esquerdo a níveis de PA sistólica noturna, mesmo após o ajuste para fatores de risco classicamente associados com hipertrofia ventricular esquerda.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-03T12:11:54Z No. of bitstreams: 1 RAFAEL CARVALHO TORRES.pdf: 4075176 bytes, checksum: 19fc00e0161a371b5fb7c118bba5a10a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-03T12:11:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RAFAEL CARVALHO TORRES.pdf: 4075176 bytes, checksum: 19fc00e0161a371b5fb7c118bba5a10a (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O estado diabético está associado à redução no número e ao comprometimento da funcionalidade de mastócitos. A partir disso, este trabalho foi realizado com intuito de investigar o papel do receptor ativado por proliferadores de peroxissomos (PPAR)- na redução do número e reatividade de mastócitos em ratos diabéticos. O efeito da ativação do PPAR-γ sobre a apoptose dos mastócitos também foi avaliada. A diabetes foi induzida através de uma injeção única de aloxana (40 mg/Kg) em animais que se encontravam em jejum. Após três dias da indução da diabetes, o ligante agonista de PPAR-γ rosiglitazona (0,5 mg/Kg) e/ou o antagonista específico do mesmo receptor GW9662 (0,5 mg/Kg) foram administrados uma vez ao dia durante 18 dias consecutivos. A taxa de apoptose dos mastócitos e os níveis hormonais foram determinados pela análise da fragmentação de DNA e por radioimunoensaio, respectivamente. O tratamento com rosiglitazona restaurou o número de mastócitos na cavidade torácica e no tecido mesentérico dos ratos diabéticos. Além disso, o tratamento dos animais diabéticos com rosiglitazona restabeleceu a liberação normal de histamina dos mastócitos após estimulação antigênica in vitro, avaliada por fluorimetria. O aumento da apoptose dos mastócitos em animais diabéticos foi inibida com a rosiglitazona. Observamos ainda que o aumento nos níveis circulantes de corticosterona associado com a disfunção mastocitária em ratos diabéticos é sensível ao tratamento com o agonista de PPAR-γ. Em adição, o bloqueio do receptor PPAR-γ com GW9662 suprimiu a capacidade da rosiglitazona em normalizar os níveis de glicocorticóides bem como restaurar o número de mastócitos. Utilizando imunohistoquímicas, constatamos que a ativação do PPAR-γ no eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) de animais diabéticos reduziu a expressão do receptor do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) MC2-R, bem como do receptor de glicocorticóides (GR), nas adrenais e hipófise, respectivamente, desses animais. Finalmente, nós mostramos que o aumento nos níveis de ACTH no plasma dos animais diabéticos foi reduzido pelo tratamento com rosiglitazona. Como conclusão, nossos achamos mostram que a rosiglitazona restaura o número e reatividade dos mastócitos de animais diabéticos, acompanhado pela redução da apoptose dessas células, em paralelo com a atenuação da elevada secreção de glicocorticóides, indicando que o PPAR-γ tem um papel importante nesse fenômeno. Palavras chave: Receptores ativados por proliferadores de peroxissomos-γ, diabetes, mastócitos, apoptose, glicocorticóides, eixo HPA. / Mast cell function and survival have been shown to be down-regulated under diabetic conditions. This study was undertaken in order to investigate the role of the peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)- in the reduction of mast cell number and reactivity in diabetic rats. The effect of PPAR-γ activation on mast cell apoptosis was also evaluated. Diabetes was induced by a single intravenous injection of alloxan (40 mg/Kg) into fasted rats and PPAR- agonist rosiglitazone (0.5 mg/Kg) and/or specific antagonist GW9662 (0.5 mg/Kg) were administered after 3 days of diabetes induction, once daily for 18 consecutive days. Mast cell apoptosis and hormone levels were evaluated by analyses of DNA fragmentation and radioimmunoassay, respectively. Treatment with rosiglitazone restored mast cell numbers in the thoracic cavity and in mesenteric tissue of diabetic rats. Rosiglitazone treatment also significantly reversed the diabetes-induced reduction in histamine release by mast cells following activation with antigen in vitro, as measured by fluorescence. Increased apoptosis in mast cells from diabetic rats were inhibited by rosiglitazone. Moreover, we noted that the increase in plasma corticosterona levels associated with mast cell dysfunction in diabetic rats was inhibited by rosiglitazone administration. In addition, PPAR- γ blockade with GW-9662 abolished the ability of rosiglitazone to restore baseline levels of mast cells and plasma corticosterone in diabetic rats. Activation of PPAR-γ on the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis was able to reduce the expression of both adrenocorticotropic hormone (ACTH) receptor MC2-R and glucocorticoid receptor GR on the adrenals and pituitary, respectively, of the diabetic rats, attested by immunohistochemistry. Finally, we showed that the increase in plasma ACTH levels in diabetic rats was reduced by rosiglitazone treatment. In conclusion, our findings showed that rosiglitazone restored the number and reactivity of mast cells in diabetic rats, accompanied by suppression of apoptosis, in parallel with attenuation of alloxan-induced hypercorticolism, indicating that PPAR- has an important role in these phenomena.

A kisspeptina, codificada pelo gene KISS1, é um neuropeptídeo crucial na regulação do início da puberdade. A kisspeptina estimula a secreção hipotalâmica do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) após se ligar ao seu receptor GPR54. Mutações inativadoras do GPR54 são atualmente consideradas como uma causa rara de hipogonadismo hipogonadotrófico isolado (HHI) normósmico. Recentemente, uma mutação ativadora no receptor GPR54 foi implicada na patogênese da puberdade precoce dependente de gonadotrofinas (PPDG). Com base nesses achados, levantamos a hipótese de que alterações no gene KISS1 poderiam contribuir para a patogênese de distúrbios puberais centrais. O objetivo do presente estudo foi investigar a presença de variantes no gene KISS1 em pacientes com PPDG e HHI. Sessenta e sete crianças brasileiras com PPDG (63 meninas e 4 meninos) e 61 pacientes com HHI (40 homens e 21 mulheres) foram selecionados, incluindo casos esporádicos e familiares em ambos os grupos. A população controle consistiu de 200 indivíduos com história de desenvolvimento puberal normal. A região promotora e os 3 exons do gene KISS1 foram amplificados e submetidos a sequenciamento automático. Duas novas variantes no gene KISS1, p.P74S e p.H90D, foram identificadas em duas crianças não relacionadas, portadoras de PPDG idiopática. Ambas as variantes estão localizadas na região amino-terminal da kisspeptina-54 e estavam ausentes em 400 alelos controles. A variante p.P74S foi identificada em heterozigose em um menino que desenvolveu puberdade com um ano de idade. Sua mãe e avó materna, que apresentavam história de desenvolvimento puberal normal, eram portadoras da mesma variante em heterozigose, sugerindo penetrância incompleta e/ou herança sexo-dependente. A variante p.H90D foi identificada em homozigose em uma menina com PPDG, que desenvolveu puberdade aos seis anos de idade. Sua mãe, com história de menarca aos dez anos de idade, era portadora da mesma variante em heterozigose. Células transfectadas estavelmente com GPR54 foram estimuladas com concentrações crescentes de kisspeptina-54 (kp-54) humana selvagem ou contendo as mutações (kp-54 H90D e kp-54 P74S) e o acúmulo de fosfato de inositol (IP) foi medido. Nos estudos in vitro, a kp-54 P74S apresentou uma capacidade de ativação do receptor GPR54 semelhante à kp-54 selvagem. A kp-54 p.H90D mostrou uma ativação da sinalização do receptor significativamente mais potente que a kp-54 selvagem, sugerindo que essa é uma mutação ativadora. No grupo de HHI, uma nova variante (c.588-589insT) foi identificada em heterozigose na região 3 não traduzida do gene KISS1 em um paciente do sexo masculino. O papel dessa variante no fenótipo de HHI permanece indeterminado. Em conclusão, duas mutações no gene KiSS1 foram descritas pela primeira vez em associação com PPDG. / Kisspeptin, encoded by the KISS1 gene, is an important regulator of puberty onset. After binding to its receptor GPR54, kisspeptin stimulates gonadotropin-releasing hormone secretion by the hypothalamic neurons. Inactivating GPR54 mutations are a rare cause of normosmic isolated hypogonadotropic hypogonadism (IHH). Recently, a unique GPR54 activating mutation was implicated in the pathogenesis of gonadotropin dependent precocious puberty (GDPP). Based on these observations, we hypothesized that mutations in the KISS1 gene might be associated with central pubertal disorders. The aim of this study was to investigate KISS1 mutations in idiopathic GDPP and normosmic IHH. Sixty-seven Brazilian children (63 girls and 4 boys) with idiopathic GDPP and 61 patients with normosmic IHH (40 men and 21 women) were selected. Familial and sporadic cases were included in both groups. The control population consisted of 200 individuals who had normal timing of puberty. The promoter region and the 3 exons of the KISS1 gene were amplified and automatically sequenced. Two novel KISS1 missense mutations, p.P74S and p.H90D, were identified in two unrelated children with idiopathic GDPP. Both mutations were absent in 400 control alleles and are located in the amino-terminal region of kisspeptin-54. The p.P74S mutation was identified in the heterozygous state in a boy who developed puberty at 1 yr of age. His mother and maternal grandmother, who had normal pubertal development, were also heterozygous for the p.P74S mutation, suggesting incomplete penetrance and/or sex-dependent inheritance. The p.H90D mutation was identified in the homozygous state in a girl with GDPP, who developed puberty at 6 yr of age. Her mother, who had menarche at 10 yr of age, carried the p.H90D mutation in the heterozygous state. CHO cells stably transfected with GPR54 were stimulated with different concentrations of synthetic human wild type or mutant kisspeptin-54 (KP54) and inositol phosphate (IP) accumulation was measured. In vitro studies revealed that the capacity of the p.P74S mutant KP54 to stimulate IP production was similar to the wild type. The p.H90D kisspeptin-54 showed a significantly more potent activation of GPR54 signaling in comparison to the wild type in vitro, suggesting a gain-of-function mutation. In the IHH group, a heterozygous variant in the 3 UTR of the KISS1 gene (c.588-589insT) was identified. The role of this variant in the IHH phenotype remains to be determined. In conclusion, two KiSS1 mutations were described for the first time in association with GDPP.

A puberdade é um processo biológico complexo do desenvolvimento sexual que tem início no final da infância e se caracteriza pela maturação do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal, pelo desenvolvimento dos caracteres sexuais secundários, aceleração do crescimento e finalmente pela capacidade reprodutiva. Nos últimos anos, o peptídeo kisspeptina e seu receptor KISS1R têm sido fortemente envolvidos na regulação da secreção pulsátil do GnRH hipotalâmico e, portanto, com o início da puberdade humana. Mutações nos genes KISS1R e KISS1 foram identificadas em crianças brasileiras com puberdade precoce central (PPC). Estudos em famílias e em irmãs gêmeas estimaram que 50-70% da variação na idade de menarca pode ser hereditária, porém, até pouco tempo atrás, não se tinha conhecimento de variantes genéticas comuns que influenciassem no tempo de puberdade. Recentemente, quatro estudos independentes de associação ampla do genoma estabeleceram que marcadores genéticos próximos ou dentro do gene LIN28B estavam relacionados com a idade da menarca em mulheres normais. Além disso, mutações recessivas no gene lin28 levaram ao desenvolvimento precoce no C. elegans. Camundongos que superexpressam Lin28a apresentaram um retardo no desenvolvimento sexual. Com base nesses achados, investigamos a presença de variantes conhecidas ou novas nos genes KISS1, KISS1R e LIN28B em um grupo de crianças portadoras de PPC idiopática com o intuito de estabelecermos a prevalência dessas mutações na etiologia do desenvolvimento sexual prematuro em humanos. Cento e sete crianças com PPC (101 meninas e 6 meninos) foram selecionados, incluindo casos esporádicos e familiares. A população controle consistiu de 200 indivíduos adultos com história de desenvolvimento puberal normal em idade apropriada. A região promotora e os três exons do gene KISS1, os cinco exons do gene K1SS1R e os quatro exons do gene LIN28B foram amplificados e submetidos à sequenciamento automático. Uma variante em homozigose no gene KISS1, descrita anteriormente por pesquisadores do nosso laboratório, p.H90D, foi identificada em mais três crianças não relacionadas, portadoras de PPC idiopática. Essa variante está localizada no exon 3 do KISS1, levando a substituição de uma histidina por um ácido aspártico na posição 90 da kisspeptina-1 (p.H90D), correspondendo à região amino-terminal da kisspeptina-54 e estava ausente em 200 controles brasileiros. Estudos prévios in vitro com a variante p.H90D não revelaram alterações na capacidade de ligação ou ativação do KISS1R e na resistência a degradação. As mutações ativadoras p.R386P do KISS1R e p.P74S da kisspeptina, previamente descritas em puberdade precoce central, não foram identificadas no estudo atual. Uma nova e rara variante em heterozigose no gene LIN28B, p.H199R, foi identificada em uma menina brasileira com PPC idiopática. Essa variante está localizada no exon 4 do LIN28B, levando a substituição de uma histidina conservada por uma arginina na posição 199 da proteína (p.H199R) e estava ausente em 200 controles brasileiros. O pai da paciente, que apresentou desenvolvimento puberal normal, era portador da mesma variante em heterozigose. Estudos in vitro revelaram que a variante p.H199R não afeta a função de LIN28B na regulação da expressão do miRNA let-7. Outra variante alélica no gene LIN28B foi identificada numa menina com PPC. Essa variante estava localizada no íntron 2 do gene e uma análise computacional demonstrou que ela não altera o sítio de splicing no RNA maduro. Em conclusão, observamos que mutações nos genes KISS1 e KISS1R têm uma baixa prevalência em crianças com puberdade precoce central idiopática. Descrevemos uma nova e rara variante no gene LIN28B (p.H199R) numa menina com puberdade precoce central e os estudos funcionais do LIN28B selvagem ou contendo a variante p.H199R sugeriram que essa variante não está relacionada ao fenótipo de puberdade precoce / Puberty is a complex biological process of sexual development that begins in the late childhood and it is characterized by the maturation of the hipothalamic-pituitary-gonadal axis, secondary sexual characteristics development, growth acceleration and acquisition of the reproductive capacity. Over the last years, the kisspeptin peptide and its receptor KISS1R have been envolved in the regulation of the pulsatile hipothalamic GnRH secretion and consequently with the beginning of the puberty human. Researchers from our laboratory identified mutations in the KISS1R and KISS1 genes in Brazilian children with central precocious puberty (CPP). Studies performed in families and twins estimated that 50%-70% of the variation in the menarce age can be hereditary, however, until last years, we did not have knowledgment of the influence of commun genetic variants in the puberty time. Recently, four independent Genome-Wide Association Studies established that genetic markers near or inside of LIN28B gene were related with the menarce age in normal women. Furthermore, recessive mutations in the LIN28B gene caused a precocious develpment in C. elegans. Interestingly, mouse that overexpress Lin28a exhibited a sexual development delay. Accordingly with these datas investigated the presence of known or new variants in the KISS1, KISS1R and LIN28B genes in a larger cohort of children with CPP to establish the prevalence of these mutations in the etiology of premature sexual development in humans. 107 children with CPP (101 girls and 6 boys) were selected, including sporadic and familial cases. The control population consisted of 200 adults with normal pubertal development. The promoter region and the three exons of KISS1 gene, five exons of KISS1R and four exons of LIN28B were amplified and automatically sequenced. A homozygous variant previously described by researchers from our laboratory in the KISS1 gene, p.H90D, was identified in more 3 no related children with CPP idiophatic. This variant is located in exon 3 of KISS1, resulting in substitution of a histidine to an aspartic acid at position 90 of kisspeptin-1 (p.H90D), in the amino-terminal region of the protein-54 and was absent in 200 Brazilian controls. Previous studies in vitro with the p.H90D variant did not show alterations in the binding or activation capacity and in the resistance to degradation. The activating mutations p.R386P of the KISS1R and p.P74S of the kisspeptin, previously described in central precocious puberty, were not identified in the present study. A new and rare heterozygous variant in the LIN28B gene, p.H199R, was identified in a Brazilian girl with CPP idiophatic. This variant is located in exon 4 of the LIN28B, resulting in substitution of a histidine to an arginine at position 199 of protein (p.H199R) and was absent in 200 Brazilian controls. Her father, which had normal pubertal development, carried the same heterozygous variant. Studies in vitro revealed p.H199R did not affect the function of Lin28B in the regulation of let-7 miRNA expression. Another allelic variant in the LIN28B gene was identified in a girl with CPP. This variant was located in intron 2 of the gene and an in silico analysis showed that it does not change the splicing site in mature RNA. In conclusion, we observed that mutations in the KISS1 and KISS1R genes have a low prevalence in children with idiopathic central precocious puberty. We described a new and rare variant in LIN28B gene (p.H199R) in a girl with central precocious puberty and functional studies of the wild LIN28B or containing p.H199R variant suggested that p.H199R variant of the LIN28B is not related to the precocious puberty phenotype

Contexto: As oscilações hormonais ao longo da vida estão associadas às variações de humor em mulheres normais. O estrógeno (E) parece estar associado aos níveis de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em voluntárias saudáveis. No entanto, essa associação não foi investigada em pacientes com transtorno bipolar (TB). Sabe-se que os episódios de humor do TB estão associados a alterações dos níveis de BDNF; entretanto, não está claro o papel dos hormônios femininos. Objetivo: investigar a existência de uma possível associação entre os níveis de BDNF e os níveis de hormônios do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal em mulheres com TB, incluindo pacientes durante o período reprodutivo e também na pós-menopausa. Métodos: Mulheres eutímicas (HAM-D e YMRS com escores menores que 8) com transtorno bipolar I(TB I), II (TB II) ou transtorno bipolar sem outra especificação (TB SOE) foram incluídas. As pacientes em idade reprodutiva tinham ciclos menstruais regulares (CMR) e não faziam uso de nenhum tipo de contracepção hormonal (CH); e as na pós-menopausa não estavam em uso de terapia de reposição hormonal (TRH). Condições endócrinas instáveis foram consideradas um fator de exclusão. Todas as pacientes estavam em tratamento farmacológico, associado ou não a intervenções psicossociais. Amostras de sangue foram retiradas para as medidas de BDNF, estrogênio (E), progesterona (P), LH e FSH, sendo coletadas nas fases folicular (FF) e lútea (FL) do ciclo menstrual, e uma única vez nas mulheres na pós-menopausa. Os diagnósticos foram confirmados através de entrevista clínica estruturada para o DSM-IV Transtornos do Eixo I (SCID-I), administrado por investigadores treinados. Resultados: Foram avaliadas 96 pacientes com TB. Destas, 64 não preenchiam critérios de inclusão ou apresentavam fatores de exclusão. Foram estudadas 32 mulheres com idades entre 22 e 69 anos (média = 52,78 anos). Considerando toda a amostra, o BDNF apresentou uma correlação positiva com os níveis de estradiol (r = 0,36, p = 0,043). Nas pacientes em período reprodutivo, na fase lútea(FL), houve uma correlação negativa entre o BDNF e o FSH (r = 0,831, p = 0,040). Um resultado semelhante foi encontrado com os níveis de LH (r = 0,908, p= 0,012) nessa mesma fase do ciclo menstrual. Conclusão: Os resultados encontrados na amostra de mulheres com TB foram semelhantes aos descritos na literatura em indivíduos saudáveis, que também apresentam correlação entre E e BDNF (Begliuomini et al., 2007). Estes achados indicam que o estímulo estrogênico pode ser importante na manutenção de s níveis fisiológicos de BDNF. A partir desses resultados novas vias devem ser incluídas na investigação na fisiopatologia das alterações de humor relacionadas a variações hormonais, bem como ao tratamento do TB. Além disso, ressalta a importância de incluir as variações hormonais femininas na equação diagnóstica e prognóstica do TB. / Background: Background: Hormonal oscilations across lifetime have been associated with mood variations in healthy women. Oestrogen (E) seems to be associated with Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) levels in healthy volunteers. This assictaion was not studied in women with Bipolar Disorder (BD). Mood episodes of BD are associated with reductions in BDNF levels, although the role of feminine hormones in pathophysiology of BD hás not been completely studied. Objective: To investigate the association between BDNF levels and hormones involved in hypothalamus-pituitary-gonadal axis in women with BD, comparing a group during reproductive years with a menopausal group. In addition, differences across the two phases of menstrual cycle were also evaluated in the group during reproductive years. Methods: Women euthymic (HAM-D and YMRS scoring less than 8) with bipolar I, II or bipolar disorder not otherwise specified were included. Patients of reproductive age had regular menstrual cycles (RMC) and did not use any type of hormonal contraception (CH) and postmenopausal were not using hormone replacement therapy (HRT). Endocrine instable conditions were considered an exclusion factor. All patients were on pharmacotherapy, associed or not with psychosocial interventions. Blood samples withdrawn for measures of BDNF, oestrogen (E), progesterone (P), LH and FSH levels, being collected in the follicular phase (FP) and luteal (FL) of the menstrual cycle, menopausal women were held only one blood sample. Diagnoses were assessed using structured clinical interview for DSM-IV Axis I Disorders (SCID-I), administered by certified investigators. Results: Ninety six patients with BD were evaluated, of these, 64 did not meet inclusion criteria or met exclusion factors. The sample was constituted by 32 women with BD aged 22 to 69 years (mean = 52.78 years). Considering the whole sample, the BDNF was significantly correlated with estradiol levels (r = 0.36, p = 0.043). In patients in reproductive period, in the luteal phase, there was a negative correlation with FSH (r = 0.831, p = 0.040). A similar result was found with levels o LH (r = 0.908, p = 0.012) in the same menstrual cycle phase. Conclusion: The results found in the sample of women with TB were similar to those previously reported in healthy subjects, which also show a correlation between E and BDNF (Begliuomini et al., 2007). These findings indicate that estrogenic stimulation may be important in maintaining physiological BDNF levels. From these results, new avenues should be included in research on the pathophysiology of mood swings related to hormonal changes as well as the treatment of TB. Furthermore, the importance of including female hormonal changes in the equation of TB diagnostic and.

Contexto: As oscilações hormonais ao longo da vida estão associadas às variações de humor em mulheres normais. O estrógeno (E) parece estar associado aos níveis de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em voluntárias saudáveis. No entanto, essa associação não foi investigada em pacientes com transtorno bipolar (TB). Sabe-se que os episódios de humor do TB estão associados a alterações dos níveis de BDNF; entretanto, não está claro o papel dos hormônios femininos. Objetivo: investigar a existência de uma possível associação entre os níveis de BDNF e os níveis de hormônios do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal em mulheres com TB, incluindo pacientes durante o período reprodutivo e também na pós-menopausa. Métodos: Mulheres eutímicas (HAM-D e YMRS com escores menores que 8) com transtorno bipolar I(TB I), II (TB II) ou transtorno bipolar sem outra especificação (TB SOE) foram incluídas. As pacientes em idade reprodutiva tinham ciclos menstruais regulares (CMR) e não faziam uso de nenhum tipo de contracepção hormonal (CH); e as na pós-menopausa não estavam em uso de terapia de reposição hormonal (TRH). Condições endócrinas instáveis foram consideradas um fator de exclusão. Todas as pacientes estavam em tratamento farmacológico, associado ou não a intervenções psicossociais. Amostras de sangue foram retiradas para as medidas de BDNF, estrogênio (E), progesterona (P), LH e FSH, sendo coletadas nas fases folicular (FF) e lútea (FL) do ciclo menstrual, e uma única vez nas mulheres na pós-menopausa. Os diagnósticos foram confirmados através de entrevista clínica estruturada para o DSM-IV Transtornos do Eixo I (SCID-I), administrado por investigadores treinados. Resultados: Foram avaliadas 96 pacientes com TB. Destas, 64 não preenchiam critérios de inclusão ou apresentavam fatores de exclusão. Foram estudadas 32 mulheres com idades entre 22 e 69 anos (média = 52,78 anos). Considerando toda a amostra, o BDNF apresentou uma correlação positiva com os níveis de estradiol (r = 0,36, p = 0,043). Nas pacientes em período reprodutivo, na fase lútea(FL), houve uma correlação negativa entre o BDNF e o FSH (r = 0,831, p = 0,040). Um resultado semelhante foi encontrado com os níveis de LH (r = 0,908, p= 0,012) nessa mesma fase do ciclo menstrual. Conclusão: Os resultados encontrados na amostra de mulheres com TB foram semelhantes aos descritos na literatura em indivíduos saudáveis, que também apresentam correlação entre E e BDNF (Begliuomini et al., 2007). Estes achados indicam que o estímulo estrogênico pode ser importante na manutenção de s níveis fisiológicos de BDNF. A partir desses resultados novas vias devem ser incluídas na investigação na fisiopatologia das alterações de humor relacionadas a variações hormonais, bem como ao tratamento do TB. Além disso, ressalta a importância de incluir as variações hormonais femininas na equação diagnóstica e prognóstica do TB. / Background: Background: Hormonal oscilations across lifetime have been associated with mood variations in healthy women. Oestrogen (E) seems to be associated with Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) levels in healthy volunteers. This assictaion was not studied in women with Bipolar Disorder (BD). Mood episodes of BD are associated with reductions in BDNF levels, although the role of feminine hormones in pathophysiology of BD hás not been completely studied. Objective: To investigate the association between BDNF levels and hormones involved in hypothalamus-pituitary-gonadal axis in women with BD, comparing a group during reproductive years with a menopausal group. In addition, differences across the two phases of menstrual cycle were also evaluated in the group during reproductive years. Methods: Women euthymic (HAM-D and YMRS scoring less than 8) with bipolar I, II or bipolar disorder not otherwise specified were included. Patients of reproductive age had regular menstrual cycles (RMC) and did not use any type of hormonal contraception (CH) and postmenopausal were not using hormone replacement therapy (HRT). Endocrine instable conditions were considered an exclusion factor. All patients were on pharmacotherapy, associed or not with psychosocial interventions. Blood samples withdrawn for measures of BDNF, oestrogen (E), progesterone (P), LH and FSH levels, being collected in the follicular phase (FP) and luteal (FL) of the menstrual cycle, menopausal women were held only one blood sample. Diagnoses were assessed using structured clinical interview for DSM-IV Axis I Disorders (SCID-I), administered by certified investigators. Results: Ninety six patients with BD were evaluated, of these, 64 did not meet inclusion criteria or met exclusion factors. The sample was constituted by 32 women with BD aged 22 to 69 years (mean = 52.78 years). Considering the whole sample, the BDNF was significantly correlated with estradiol levels (r = 0.36, p = 0.043). In patients in reproductive period, in the luteal phase, there was a negative correlation with FSH (r = 0.831, p = 0.040). A similar result was found with levels o LH (r = 0.908, p = 0.012) in the same menstrual cycle phase. Conclusion: The results found in the sample of women with TB were similar to those previously reported in healthy subjects, which also show a correlation between E and BDNF (Begliuomini et al., 2007). These findings indicate that estrogenic stimulation may be important in maintaining physiological BDNF levels. From these results, new avenues should be included in research on the pathophysiology of mood swings related to hormonal changes as well as the treatment of TB. Furthermore, the importance of including female hormonal changes in the equation of TB diagnostic and.

A puberdade é um processo biológico complexo do desenvolvimento sexual que tem início no final da infância e se caracteriza pela maturação do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal, pelo desenvolvimento dos caracteres sexuais secundários, aceleração do crescimento e finalmente pela capacidade reprodutiva. Nos últimos anos, o peptídeo kisspeptina e seu receptor KISS1R têm sido fortemente envolvidos na regulação da secreção pulsátil do GnRH hipotalâmico e, portanto, com o início da puberdade humana. Mutações nos genes KISS1R e KISS1 foram identificadas em crianças brasileiras com puberdade precoce central (PPC). Estudos em famílias e em irmãs gêmeas estimaram que 50-70% da variação na idade de menarca pode ser hereditária, porém, até pouco tempo atrás, não se tinha conhecimento de variantes genéticas comuns que influenciassem no tempo de puberdade. Recentemente, quatro estudos independentes de associação ampla do genoma estabeleceram que marcadores genéticos próximos ou dentro do gene LIN28B estavam relacionados com a idade da menarca em mulheres normais. Além disso, mutações recessivas no gene lin28 levaram ao desenvolvimento precoce no C. elegans. Camundongos que superexpressam Lin28a apresentaram um retardo no desenvolvimento sexual. Com base nesses achados, investigamos a presença de variantes conhecidas ou novas nos genes KISS1, KISS1R e LIN28B em um grupo de crianças portadoras de PPC idiopática com o intuito de estabelecermos a prevalência dessas mutações na etiologia do desenvolvimento sexual prematuro em humanos. Cento e sete crianças com PPC (101 meninas e 6 meninos) foram selecionados, incluindo casos esporádicos e familiares. A população controle consistiu de 200 indivíduos adultos com história de desenvolvimento puberal normal em idade apropriada. A região promotora e os três exons do gene KISS1, os cinco exons do gene K1SS1R e os quatro exons do gene LIN28B foram amplificados e submetidos à sequenciamento automático. Uma variante em homozigose no gene KISS1, descrita anteriormente por pesquisadores do nosso laboratório, p.H90D, foi identificada em mais três crianças não relacionadas, portadoras de PPC idiopática. Essa variante está localizada no exon 3 do KISS1, levando a substituição de uma histidina por um ácido aspártico na posição 90 da kisspeptina-1 (p.H90D), correspondendo à região amino-terminal da kisspeptina-54 e estava ausente em 200 controles brasileiros. Estudos prévios in vitro com a variante p.H90D não revelaram alterações na capacidade de ligação ou ativação do KISS1R e na resistência a degradação. As mutações ativadoras p.R386P do KISS1R e p.P74S da kisspeptina, previamente descritas em puberdade precoce central, não foram identificadas no estudo atual. Uma nova e rara variante em heterozigose no gene LIN28B, p.H199R, foi identificada em uma menina brasileira com PPC idiopática. Essa variante está localizada no exon 4 do LIN28B, levando a substituição de uma histidina conservada por uma arginina na posição 199 da proteína (p.H199R) e estava ausente em 200 controles brasileiros. O pai da paciente, que apresentou desenvolvimento puberal normal, era portador da mesma variante em heterozigose. Estudos in vitro revelaram que a variante p.H199R não afeta a função de LIN28B na regulação da expressão do miRNA let-7. Outra variante alélica no gene LIN28B foi identificada numa menina com PPC. Essa variante estava localizada no íntron 2 do gene e uma análise computacional demonstrou que ela não altera o sítio de splicing no RNA maduro. Em conclusão, observamos que mutações nos genes KISS1 e KISS1R têm uma baixa prevalência em crianças com puberdade precoce central idiopática. Descrevemos uma nova e rara variante no gene LIN28B (p.H199R) numa menina com puberdade precoce central e os estudos funcionais do LIN28B selvagem ou contendo a variante p.H199R sugeriram que essa variante não está relacionada ao fenótipo de puberdade precoce / Puberty is a complex biological process of sexual development that begins in the late childhood and it is characterized by the maturation of the hipothalamic-pituitary-gonadal axis, secondary sexual characteristics development, growth acceleration and acquisition of the reproductive capacity. Over the last years, the kisspeptin peptide and its receptor KISS1R have been envolved in the regulation of the pulsatile hipothalamic GnRH secretion and consequently with the beginning of the puberty human. Researchers from our laboratory identified mutations in the KISS1R and KISS1 genes in Brazilian children with central precocious puberty (CPP). Studies performed in families and twins estimated that 50%-70% of the variation in the menarce age can be hereditary, however, until last years, we did not have knowledgment of the influence of commun genetic variants in the puberty time. Recently, four independent Genome-Wide Association Studies established that genetic markers near or inside of LIN28B gene were related with the menarce age in normal women. Furthermore, recessive mutations in the LIN28B gene caused a precocious develpment in C. elegans. Interestingly, mouse that overexpress Lin28a exhibited a sexual development delay. Accordingly with these datas investigated the presence of known or new variants in the KISS1, KISS1R and LIN28B genes in a larger cohort of children with CPP to establish the prevalence of these mutations in the etiology of premature sexual development in humans. 107 children with CPP (101 girls and 6 boys) were selected, including sporadic and familial cases. The control population consisted of 200 adults with normal pubertal development. The promoter region and the three exons of KISS1 gene, five exons of KISS1R and four exons of LIN28B were amplified and automatically sequenced. A homozygous variant previously described by researchers from our laboratory in the KISS1 gene, p.H90D, was identified in more 3 no related children with CPP idiophatic. This variant is located in exon 3 of KISS1, resulting in substitution of a histidine to an aspartic acid at position 90 of kisspeptin-1 (p.H90D), in the amino-terminal region of the protein-54 and was absent in 200 Brazilian controls. Previous studies in vitro with the p.H90D variant did not show alterations in the binding or activation capacity and in the resistance to degradation. The activating mutations p.R386P of the KISS1R and p.P74S of the kisspeptin, previously described in central precocious puberty, were not identified in the present study. A new and rare heterozygous variant in the LIN28B gene, p.H199R, was identified in a Brazilian girl with CPP idiophatic. This variant is located in exon 4 of the LIN28B, resulting in substitution of a histidine to an arginine at position 199 of protein (p.H199R) and was absent in 200 Brazilian controls. Her father, which had normal pubertal development, carried the same heterozygous variant. Studies in vitro revealed p.H199R did not affect the function of Lin28B in the regulation of let-7 miRNA expression. Another allelic variant in the LIN28B gene was identified in a girl with CPP. This variant was located in intron 2 of the gene and an in silico analysis showed that it does not change the splicing site in mature RNA. In conclusion, we observed that mutations in the KISS1 and KISS1R genes have a low prevalence in children with idiopathic central precocious puberty. We described a new and rare variant in LIN28B gene (p.H199R) in a girl with central precocious puberty and functional studies of the wild LIN28B or containing p.H199R variant suggested that p.H199R variant of the LIN28B is not related to the precocious puberty phenotype

A kisspeptina, codificada pelo gene KISS1, é um neuropeptídeo crucial na regulação do início da puberdade. A kisspeptina estimula a secreção hipotalâmica do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) após se ligar ao seu receptor GPR54. Mutações inativadoras do GPR54 são atualmente consideradas como uma causa rara de hipogonadismo hipogonadotrófico isolado (HHI) normósmico. Recentemente, uma mutação ativadora no receptor GPR54 foi implicada na patogênese da puberdade precoce dependente de gonadotrofinas (PPDG). Com base nesses achados, levantamos a hipótese de que alterações no gene KISS1 poderiam contribuir para a patogênese de distúrbios puberais centrais. O objetivo do presente estudo foi investigar a presença de variantes no gene KISS1 em pacientes com PPDG e HHI. Sessenta e sete crianças brasileiras com PPDG (63 meninas e 4 meninos) e 61 pacientes com HHI (40 homens e 21 mulheres) foram selecionados, incluindo casos esporádicos e familiares em ambos os grupos. A população controle consistiu de 200 indivíduos com história de desenvolvimento puberal normal. A região promotora e os 3 exons do gene KISS1 foram amplificados e submetidos a sequenciamento automático. Duas novas variantes no gene KISS1, p.P74S e p.H90D, foram identificadas em duas crianças não relacionadas, portadoras de PPDG idiopática. Ambas as variantes estão localizadas na região amino-terminal da kisspeptina-54 e estavam ausentes em 400 alelos controles. A variante p.P74S foi identificada em heterozigose em um menino que desenvolveu puberdade com um ano de idade. Sua mãe e avó materna, que apresentavam história de desenvolvimento puberal normal, eram portadoras da mesma variante em heterozigose, sugerindo penetrância incompleta e/ou herança sexo-dependente. A variante p.H90D foi identificada em homozigose em uma menina com PPDG, que desenvolveu puberdade aos seis anos de idade. Sua mãe, com história de menarca aos dez anos de idade, era portadora da mesma variante em heterozigose. Células transfectadas estavelmente com GPR54 foram estimuladas com concentrações crescentes de kisspeptina-54 (kp-54) humana selvagem ou contendo as mutações (kp-54 H90D e kp-54 P74S) e o acúmulo de fosfato de inositol (IP) foi medido. Nos estudos in vitro, a kp-54 P74S apresentou uma capacidade de ativação do receptor GPR54 semelhante à kp-54 selvagem. A kp-54 p.H90D mostrou uma ativação da sinalização do receptor significativamente mais potente que a kp-54 selvagem, sugerindo que essa é uma mutação ativadora. No grupo de HHI, uma nova variante (c.588-589insT) foi identificada em heterozigose na região 3 não traduzida do gene KISS1 em um paciente do sexo masculino. O papel dessa variante no fenótipo de HHI permanece indeterminado. Em conclusão, duas mutações no gene KiSS1 foram descritas pela primeira vez em associação com PPDG. / Kisspeptin, encoded by the KISS1 gene, is an important regulator of puberty onset. After binding to its receptor GPR54, kisspeptin stimulates gonadotropin-releasing hormone secretion by the hypothalamic neurons. Inactivating GPR54 mutations are a rare cause of normosmic isolated hypogonadotropic hypogonadism (IHH). Recently, a unique GPR54 activating mutation was implicated in the pathogenesis of gonadotropin dependent precocious puberty (GDPP). Based on these observations, we hypothesized that mutations in the KISS1 gene might be associated with central pubertal disorders. The aim of this study was to investigate KISS1 mutations in idiopathic GDPP and normosmic IHH. Sixty-seven Brazilian children (63 girls and 4 boys) with idiopathic GDPP and 61 patients with normosmic IHH (40 men and 21 women) were selected. Familial and sporadic cases were included in both groups. The control population consisted of 200 individuals who had normal timing of puberty. The promoter region and the 3 exons of the KISS1 gene were amplified and automatically sequenced. Two novel KISS1 missense mutations, p.P74S and p.H90D, were identified in two unrelated children with idiopathic GDPP. Both mutations were absent in 400 control alleles and are located in the amino-terminal region of kisspeptin-54. The p.P74S mutation was identified in the heterozygous state in a boy who developed puberty at 1 yr of age. His mother and maternal grandmother, who had normal pubertal development, were also heterozygous for the p.P74S mutation, suggesting incomplete penetrance and/or sex-dependent inheritance. The p.H90D mutation was identified in the homozygous state in a girl with GDPP, who developed puberty at 6 yr of age. Her mother, who had menarche at 10 yr of age, carried the p.H90D mutation in the heterozygous state. CHO cells stably transfected with GPR54 were stimulated with different concentrations of synthetic human wild type or mutant kisspeptin-54 (KP54) and inositol phosphate (IP) accumulation was measured. In vitro studies revealed that the capacity of the p.P74S mutant KP54 to stimulate IP production was similar to the wild type. The p.H90D kisspeptin-54 showed a significantly more potent activation of GPR54 signaling in comparison to the wild type in vitro, suggesting a gain-of-function mutation. In the IHH group, a heterozygous variant in the 3 UTR of the KISS1 gene (c.588-589insT) was identified. The role of this variant in the IHH phenotype remains to be determined. In conclusion, two KiSS1 mutations were described for the first time in association with GDPP.