O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de fatores de crescimento responsáveis pelo processo vasculogênico durante o desenvolvimento e involução do timo em cães. Para este propósito, timos de fetos de cães (30, 40 50 e 60 dias de desenvolvimento), cães jovens (6 meses de idade) e cães adultos (1 ano de idade) foram coletados. Os tecidos foram analisados estereológicamente e submetidos à imunohistoquímica, PCR tempo real e western blot para os componentes do sistema VEGF (VEGF-A, VEGF-C, Flt-1, KDR e Flt-4) e endocrine gland-derived (EG)-VEGF. Pela estereologia, observamos um aumento no número dos vasos durante o desenvolvimento do órgão e uma diminuição durante a involução (p<0.05). Todos os componentes do sistema VEGF e do EG-VEGF foram detectados em todos os estágios durante o desenvolvimento e involução. As proteínas correspondentes foram localizadas nas células endoteliais e células epiteliais da região cortical e medular, sendo que o EG-VEGF foi observado apenas nas células epiteliais da região medular. A expressão do RNAm do sistema VEGF e do EG-VEGF apresentou um perfil tempo-dependente durante o desenvolvimento e involução. O sistema VEGF apresentou uma expressão constante durante o desenvolvimento e um aumento progressivo durante a involução, com exceção do KDR que se mostrou crescente durante todo o período de desenvolvimento e involução e do VEGF-C que apresentou alta expressão durante a involução. A expressão do RNAm do EG-VEGF foi crescente durante as fases estudadas, já a expressão da sua proteína foi alta no início do desenvolvimento do timo e diminui na involução, onde permanece praticamente constante durante todo o período. Nossos resultados sugerem que o sistema VEGF e o EG-VEGF possuem atividades biológicas similares nas glândulas endócrinas e diferentes papéis durante o desenvolvimento e involução, o qual pode ser especificado em estudos futuros. Possíveis funções incluem um efeito modulatório na vasculogênese tímica e microambiente, influenciando na diferenciação e proliferação de timócitos, maturação de células T, interação célula-célula e secreção de hormônios tímicos. / The aim this study was therefore to evaluate the expression of growth factors responsible for the vasculogenic process throughout development and initial involution of the canine thymus. For that purpose, thymuses from fetuses (30, 40, 50 and 60 days), juvenile (6 months) and adult (1 year) dogs were collected. The tissues were examined stereologically and subjected to immunohistochemistry, Real Time PCR and western blot for components of the VEGF-system (VEGF-A, VEGF-C, Flt-1, KDR and Flt-4) and endocrine gland-derived (EG)-VEGF. By means of stereology, the total number of blood vessels increased during development and decreased during involution. These changes were statistically significant (p<0.05). All components of the VEGF-system and EG-VEGF were detected in all stages during development and involution. The corresponding proteins were localized in endothelial and epithelial cells of cortical and medullar regions, and EG-VEGF was detected only in epithelial cells of medular region. The VEGF-system and EG-VEGF protein and mRNA expression showed a specific time-dependent profile during development and involution. The VEGF system showed a constant expression during development and a progressive increase during involution, except KDR that showed increased during all development and involution and VEGF-C that showed high expression during involution. The EG-VEGF RNAm expression was increased during development and involution, but protein expression was high in early thymus development and decreased in involution, and remains constant during all period. Our results suggest that VEGF-system and EG-VEGF have similar biological activities in endocrine glands and different roles during thymus development and involution which have to be specified in further studies. Possible functions include a modulatory effect on thymic vasculogenesis and microenvironment, influencing thymocyte proliferation and differentiation, T-cell maturation, cell-cell interaction and thymic hormonal secretion.

Com o intuito de investigar se a hipóxia representa um dos desencadeadores da regressão luteínica em cadelas não prenhes, o presente estudo foi delineado para analisar a expressão do fator transcricional indutível por hipóxia HIF1A e a de seus genes-alvo relacionados à angiogênese, como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGFA) e à captação de glicose, como as proteínas transportadoras facilitadoras GLUT1/SLC2A1 e GLUT4/SLC2A4 no corpo lúteo canino ao longo do diestro (dias 10 a 70 após a ovulação). Para tal, utilizou-se imuno-histoquímica e western blotting para localizar e quantificar as proteínas do HIF1A, GLUT1 e GLUT4 e PCR em tempo real para quantificar a expressão do RNAm de HIF1A, SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 e KDR. Além disso, células luteínicas nas fases inicial (dia 10), média (dia 30) e final (dia 60) foram submetidas ao tratamento com cloreto de cobalto (CoCl2) a 500 &micro;M para avaliar os efeitos da hipóxia sobre a expressão gênica dos fatores acima citados, bem como sobre a produção de progesterona e 17&beta;-estradiol. Nossos resultados demonstraram que o HIF1A é expresso pelo corpo lúteo canino de maneira tempo-dependente ao longo do diestro, e que a expressão de seu RNAm está diretamente correlacionada a expressão gênica de SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 e KDR e com as concentrações de progesterona periférica. No cultivo primário de células luteínicas, a hipóxia induzida pelo CoCl2 diminuiu a produção de progesterona e de 17&beta;-estradiol e estimulou significativamente a expressão de HIF1A, SLC2A1, SLC2A4 e VEGFA. Esses resultados sugerem que o HIF1A constitui um dos fatores regulatórios da função do corpo lúteo canino participando da modulação de processos como esteroidogêne, angiogênese e da captação de glicose, atuando como fator luteolítico. / This study was designed to investigate if hypoxia is one of the triggers of luteal regression in non-pregnant bitches. For that, we analyzed the hypoxia- inducible factor (HIF1A) expression as well as the expression of its target genes related to angiogenesis (vascular endothelial growth factor VEGFA) and to glucose uptake (glucose transporters GLUT/SLC2A 1 and 4) in canine corpus luteum throughout diestrus (days 10 to 70 after ovulation). We used immunohistochemistry and western blotting to localize and quantify the protein expression of HIF1A, GLUT1 and GLUT4, respectively, and real time PCR to analyze HIF1A, SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 and KDR gene expression. Moreover, luteal cells from early (day 10), mid (day 30) and late luteal phase (day 60) were submitted to 500 &micro;M cobalt chloride (CoCl2) treatment to verify hypoxia effects on gene expression of the above cited genes and on progesterone and 17&beta;-estradiol production. Our results showed that luteal cells expressed HIF1A in a time-dependent manner over diestrus and that its expression was directly correlated to both SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 and KDR gene expression and progesterone production. The protein expression of the studied genes also changed over diestrus and was correlated with the respective gene expression. In primary luteal cells culture, cobalt chloride-induced hypoxia downregulated progesterone and 17&beta;-estradiol production, but upregulated HIF1A, SLC2A1, SLC2A4 and VEGFA gene expression. These findings suggest that HIF1A is one of the factors regulating canine luteal function by modulating important process as steroidogenesis, angiogenesis and glucose uptake, acting as a pro-survival factor.

A família dos VEGFs é a principal responsável pela angiogênese aumentando a neovascularização e a permeabilidade da interface endometrial/placentária. O estudo comparativo da distribuição temporal do sistema VEGF na placenta de cães e de bovinos, que apresentam diferenças tanto na sua estrutura como na sua função, pode contribuir para esclarecer o papel deste sistema ao longo da gestação. Amostras da cinta placentária de cadelas (nos dias 20, 40 e 60 de gestação) foram coletadas assim como amostras de placentomas bovinos (dias 90, 150, 210 e 270 da gestação). As amostras foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em -80ºC até serem homogeneizadas, ou fixadas em solução de formol tamponado e embebidas em paraplast usando os procedimentos convencionais. Foi realizado Western Blotting para a quantificação do sistema VEGF utilizando-se anticorpos específicos combinados com um sistema amplificador de quimio-luminescência: ECL®. A imuno-histoquímica para a localização do Flt-4 canino foi realizada de acordo com o método ABC, utilizando o Nova Red® como cromógeno. Na placenta bovina, o VEGF apresentou uma alta expressão no início da gestação seguida por queda que se manteve deste até o termo. O Flt-1, o KDR e o Flt-4 demonstraram uma alta expressão no início e no meio da gestação, e um declínio em sua expressão ao final da mesma. Na placenta canina, a proteína do VEGF e do Flt-1 apresentaram uma elevada expressão no início da gestação, a qual diminuiu na metade e assim se manteve até o final da gestação, enquanto o KDR demonstrou uma alta expressão no início e no meio da gestação, e um decréscimo em sua expressão próximo ao termo. A proteína do Flt-4 foi localizada nas regiões do labirinto placentário, do corion frouxo e do alantocorion e sua expressão variou nos diferentes compartimentos ao longo da gestação. A expressão similar do sistema VEGF e do Flt-4 em ambas as espécies estudadas sugere que estas proteínas apresentem funções similares tanto na placenta bovina como canina. / The VEGF family is known to be responsible for the angiogenesis increasing blood vessels number and permeability in the endometrial/placentary interface. A comparative study of VEGF system temporal distribution in canine and bovine placentas, which present very well described differences in structure and function, will contribute to better define the role of this system along pregnancy. Samples from placental belt of pregnant bitches (on days 20, 40 and 60) were collected as well as bovine placentomes samples (from days 90, 150, 210, 270 of gestation). All samples were frozen in liquid nitrogen and stored at -80º C until processed, or fixed in buffered formalin solution and embedded in paraplast using conventional procedures. Western Blotting for VEGF system quantification was carried out using specific antibodies combined to an amplification quimio-luminescence system: ECL®. Immunohistochemistry for canine Flt-4 demonstration was performed according to the ABC method using NovaRed® as chromogen. In the bovine placenta, VEGF demonstrate a higher expression in early gestation, which decreased at mid-gestation and remained so until term. Flt-1, KDR and Flt-4 demonstrated a constant expression in early and mid-gestation, and a decrease in the end of pregnancy. In the dog placenta, VEGF and Flt-1 proteins show an increased expression in early gestation, and a decreased expression at mid and late gestation; while KDR demonstrated an increased expression at early and mid-gestation, and a decreased expression near term. Flt-4 protein is localized in placental labyrinth, chorion and allantochorion. Similar expressions of these proteins in both species, that present considerable differences in placenta structure and function, suggest that VEGF system and Flt-4 play similar roles in the bovine and canine placenta.

A família dos VEGFs é a principal responsável pela angiogênese aumentando a neovascularização e a permeabilidade da interface endometrial/placentária. O estudo comparativo da distribuição temporal do sistema VEGF na placenta de cães e de bovinos, que apresentam diferenças tanto na sua estrutura como na sua função, pode contribuir para esclarecer o papel deste sistema ao longo da gestação. Amostras da cinta placentária de cadelas (nos dias 20, 40 e 60 de gestação) foram coletadas assim como amostras de placentomas bovinos (dias 90, 150, 210 e 270 da gestação). As amostras foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em -80ºC até serem homogeneizadas, ou fixadas em solução de formol tamponado e embebidas em paraplast usando os procedimentos convencionais. Foi realizado Western Blotting para a quantificação do sistema VEGF utilizando-se anticorpos específicos combinados com um sistema amplificador de quimio-luminescência: ECL®. A imuno-histoquímica para a localização do Flt-4 canino foi realizada de acordo com o método ABC, utilizando o Nova Red® como cromógeno. Na placenta bovina, o VEGF apresentou uma alta expressão no início da gestação seguida por queda que se manteve deste até o termo. O Flt-1, o KDR e o Flt-4 demonstraram uma alta expressão no início e no meio da gestação, e um declínio em sua expressão ao final da mesma. Na placenta canina, a proteína do VEGF e do Flt-1 apresentaram uma elevada expressão no início da gestação, a qual diminuiu na metade e assim se manteve até o final da gestação, enquanto o KDR demonstrou uma alta expressão no início e no meio da gestação, e um decréscimo em sua expressão próximo ao termo. A proteína do Flt-4 foi localizada nas regiões do labirinto placentário, do corion frouxo e do alantocorion e sua expressão variou nos diferentes compartimentos ao longo da gestação. A expressão similar do sistema VEGF e do Flt-4 em ambas as espécies estudadas sugere que estas proteínas apresentem funções similares tanto na placenta bovina como canina. / The VEGF family is known to be responsible for the angiogenesis increasing blood vessels number and permeability in the endometrial/placentary interface. A comparative study of VEGF system temporal distribution in canine and bovine placentas, which present very well described differences in structure and function, will contribute to better define the role of this system along pregnancy. Samples from placental belt of pregnant bitches (on days 20, 40 and 60) were collected as well as bovine placentomes samples (from days 90, 150, 210, 270 of gestation). All samples were frozen in liquid nitrogen and stored at -80º C until processed, or fixed in buffered formalin solution and embedded in paraplast using conventional procedures. Western Blotting for VEGF system quantification was carried out using specific antibodies combined to an amplification quimio-luminescence system: ECL®. Immunohistochemistry for canine Flt-4 demonstration was performed according to the ABC method using NovaRed® as chromogen. In the bovine placenta, VEGF demonstrate a higher expression in early gestation, which decreased at mid-gestation and remained so until term. Flt-1, KDR and Flt-4 demonstrated a constant expression in early and mid-gestation, and a decrease in the end of pregnancy. In the dog placenta, VEGF and Flt-1 proteins show an increased expression in early gestation, and a decreased expression at mid and late gestation; while KDR demonstrated an increased expression at early and mid-gestation, and a decreased expression near term. Flt-4 protein is localized in placental labyrinth, chorion and allantochorion. Similar expressions of these proteins in both species, that present considerable differences in placenta structure and function, suggest that VEGF system and Flt-4 play similar roles in the bovine and canine placenta.

Com o intuito de investigar se a hipóxia representa um dos desencadeadores da regressão luteínica em cadelas não prenhes, o presente estudo foi delineado para analisar a expressão do fator transcricional indutível por hipóxia HIF1A e a de seus genes-alvo relacionados à angiogênese, como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGFA) e à captação de glicose, como as proteínas transportadoras facilitadoras GLUT1/SLC2A1 e GLUT4/SLC2A4 no corpo lúteo canino ao longo do diestro (dias 10 a 70 após a ovulação). Para tal, utilizou-se imuno-histoquímica e western blotting para localizar e quantificar as proteínas do HIF1A, GLUT1 e GLUT4 e PCR em tempo real para quantificar a expressão do RNAm de HIF1A, SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 e KDR. Além disso, células luteínicas nas fases inicial (dia 10), média (dia 30) e final (dia 60) foram submetidas ao tratamento com cloreto de cobalto (CoCl2) a 500 &micro;M para avaliar os efeitos da hipóxia sobre a expressão gênica dos fatores acima citados, bem como sobre a produção de progesterona e 17&beta;-estradiol. Nossos resultados demonstraram que o HIF1A é expresso pelo corpo lúteo canino de maneira tempo-dependente ao longo do diestro, e que a expressão de seu RNAm está diretamente correlacionada a expressão gênica de SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 e KDR e com as concentrações de progesterona periférica. No cultivo primário de células luteínicas, a hipóxia induzida pelo CoCl2 diminuiu a produção de progesterona e de 17&beta;-estradiol e estimulou significativamente a expressão de HIF1A, SLC2A1, SLC2A4 e VEGFA. Esses resultados sugerem que o HIF1A constitui um dos fatores regulatórios da função do corpo lúteo canino participando da modulação de processos como esteroidogêne, angiogênese e da captação de glicose, atuando como fator luteolítico. / This study was designed to investigate if hypoxia is one of the triggers of luteal regression in non-pregnant bitches. For that, we analyzed the hypoxia- inducible factor (HIF1A) expression as well as the expression of its target genes related to angiogenesis (vascular endothelial growth factor VEGFA) and to glucose uptake (glucose transporters GLUT/SLC2A 1 and 4) in canine corpus luteum throughout diestrus (days 10 to 70 after ovulation). We used immunohistochemistry and western blotting to localize and quantify the protein expression of HIF1A, GLUT1 and GLUT4, respectively, and real time PCR to analyze HIF1A, SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 and KDR gene expression. Moreover, luteal cells from early (day 10), mid (day 30) and late luteal phase (day 60) were submitted to 500 &micro;M cobalt chloride (CoCl2) treatment to verify hypoxia effects on gene expression of the above cited genes and on progesterone and 17&beta;-estradiol production. Our results showed that luteal cells expressed HIF1A in a time-dependent manner over diestrus and that its expression was directly correlated to both SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 and KDR gene expression and progesterone production. The protein expression of the studied genes also changed over diestrus and was correlated with the respective gene expression. In primary luteal cells culture, cobalt chloride-induced hypoxia downregulated progesterone and 17&beta;-estradiol production, but upregulated HIF1A, SLC2A1, SLC2A4 and VEGFA gene expression. These findings suggest that HIF1A is one of the factors regulating canine luteal function by modulating important process as steroidogenesis, angiogenesis and glucose uptake, acting as a pro-survival factor.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de fatores de crescimento responsáveis pelo processo vasculogênico durante o desenvolvimento e involução do timo em cães. Para este propósito, timos de fetos de cães (30, 40 50 e 60 dias de desenvolvimento), cães jovens (6 meses de idade) e cães adultos (1 ano de idade) foram coletados. Os tecidos foram analisados estereológicamente e submetidos à imunohistoquímica, PCR tempo real e western blot para os componentes do sistema VEGF (VEGF-A, VEGF-C, Flt-1, KDR e Flt-4) e endocrine gland-derived (EG)-VEGF. Pela estereologia, observamos um aumento no número dos vasos durante o desenvolvimento do órgão e uma diminuição durante a involução (p<0.05). Todos os componentes do sistema VEGF e do EG-VEGF foram detectados em todos os estágios durante o desenvolvimento e involução. As proteínas correspondentes foram localizadas nas células endoteliais e células epiteliais da região cortical e medular, sendo que o EG-VEGF foi observado apenas nas células epiteliais da região medular. A expressão do RNAm do sistema VEGF e do EG-VEGF apresentou um perfil tempo-dependente durante o desenvolvimento e involução. O sistema VEGF apresentou uma expressão constante durante o desenvolvimento e um aumento progressivo durante a involução, com exceção do KDR que se mostrou crescente durante todo o período de desenvolvimento e involução e do VEGF-C que apresentou alta expressão durante a involução. A expressão do RNAm do EG-VEGF foi crescente durante as fases estudadas, já a expressão da sua proteína foi alta no início do desenvolvimento do timo e diminui na involução, onde permanece praticamente constante durante todo o período. Nossos resultados sugerem que o sistema VEGF e o EG-VEGF possuem atividades biológicas similares nas glândulas endócrinas e diferentes papéis durante o desenvolvimento e involução, o qual pode ser especificado em estudos futuros. Possíveis funções incluem um efeito modulatório na vasculogênese tímica e microambiente, influenciando na diferenciação e proliferação de timócitos, maturação de células T, interação célula-célula e secreção de hormônios tímicos. / The aim this study was therefore to evaluate the expression of growth factors responsible for the vasculogenic process throughout development and initial involution of the canine thymus. For that purpose, thymuses from fetuses (30, 40, 50 and 60 days), juvenile (6 months) and adult (1 year) dogs were collected. The tissues were examined stereologically and subjected to immunohistochemistry, Real Time PCR and western blot for components of the VEGF-system (VEGF-A, VEGF-C, Flt-1, KDR and Flt-4) and endocrine gland-derived (EG)-VEGF. By means of stereology, the total number of blood vessels increased during development and decreased during involution. These changes were statistically significant (p<0.05). All components of the VEGF-system and EG-VEGF were detected in all stages during development and involution. The corresponding proteins were localized in endothelial and epithelial cells of cortical and medullar regions, and EG-VEGF was detected only in epithelial cells of medular region. The VEGF-system and EG-VEGF protein and mRNA expression showed a specific time-dependent profile during development and involution. The VEGF system showed a constant expression during development and a progressive increase during involution, except KDR that showed increased during all development and involution and VEGF-C that showed high expression during involution. The EG-VEGF RNAm expression was increased during development and involution, but protein expression was high in early thymus development and decreased in involution, and remains constant during all period. Our results suggest that VEGF-system and EG-VEGF have similar biological activities in endocrine glands and different roles during thymus development and involution which have to be specified in further studies. Possible functions include a modulatory effect on thymic vasculogenesis and microenvironment, influencing thymocyte proliferation and differentiation, T-cell maturation, cell-cell interaction and thymic hormonal secretion.