Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La gestación, en todas las especies, es apoyada por una estructura que permite que el nuevo ser pueda desarrollarse y crecer adecuadamente dentro del vientre materno: la placenta. El transporte de solutos a través de ella se realiza, específicamente, a través de una célula epitelial multinucleada: el sinciciotrofoblasto (hSTB). Al ser un epitelio continuo, todo soluto debe atravesar, obligatoriamente, tanto su membrana apical como su membrana basal (BM). La membrana apical del hSTB se divide en dos subdominios diferentes entre sí: membrana apical pesada (MVM) y membrana apical liviana (LMVM). Para desarrollar el modelo de transporte transplacentario, es necesario identificar las vías conductivas existentes en las membranas del hSTB. Existen numerosos estudios acerca de canales iónicos y transportadores en ellas, sin embargo, en particular, los canales de K+ (principal ión intracelular) han sido pobremente descritos. Un estudio preliminar demostró la existencia funcional de corrientes de K+ en LMVM de hSTB. El objetivo del presente estudio, fue caracterizar funcional y estructuralmente que tipo de canales de K+ son los que subyacen las corrientes identificadas previamente en LMVM de hSTB de placentas humanas normales. Experimentos de Inmunohistoquímica revelaron la presencia de TREK-1 en membrana apical del hSTB y de BKCa en el citoplasma del sinciciotrofoblasto. Adicionalmente, mediante Immunoblotting, se detectó la presencia de KIR2.1, KV2.1, TASK-1 y TREK-1 en ambos subdominios de membrana apical, mientras que la expresión de BKCa fue, principalmente, en BM. La detección funcional de los canales de K+ que demostraron estar presentes en LMVM (KIR2.1, KV2.1, TASK-1 y TREK-1) por Immunoblotting, fue realizada utilizando la técnica de Patch-Clamp en configuración parche escindido (116 sellos de 16 placentas independientes). Se utilizaron bloqueos diferenciales para poder disecar corrientes con diferentes características. Se obtuvieron corrientes de K+ muy sensibles al bloqueo por BaCl2 (69,82%) de manera reversible. Adicionalmente, se obtuvieron registros de corrientes con sensibilidad a MgCl2 y CsCl2 (29% y 25%, respectivamente). Estas corrientes son características del canal KIR2.1. Por otro lado, se obtuvieron corrientes que demostraron tener un gran sensibilidad al bloqueador TEA a concentraciones milimolares (79,86%), las que corresponderían al canal KV2.1. En contraste, se obtuvieron corrientes que no presentaron efectos a los bloqueadores mencionados y que sin embargo, mostraron diferentes respuestas a la acidificación del medio. Es así como, un canal que pudiese corresponder a TASK-1 se obtuvo al registrar corrientes bloqueadas a pH 6,1 (bloqueo de un 28,92%) y una corriente que mostró una fuerte activación a pH 6,6 (63,08% de aumento sobre la corriente inicial), cuyo candidato más probable es TREK-1. Estos experimentos demostraron, en base a su farmacología y respuesta a cambios del medio, la presencia de cuatro canales de K+ (KIR2.1, KV2.1, TASK-1 y TREK-1) en LMVM del hSTB lo que se correlaciona directamente con lo observado mediante Western blots

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is a Gram positive opportunistic bacterium that is a primary cause of pneumonia in young children and immunocompromised individuals. This microorganism colonizes the nasopharynx of all age groups and health levels and is easily transmitted through respiratory droplets or aerosols. While capsule-based vaccines are available, these are becoming more obsolete as S. pneumoniae strains are undergoing serotype replacement, thus evading detection, and antibiotic resistant strains are increasing in prevalence. This study has taken a different approach by identifying immunogenic proteins that elicit antibodies which block attachment of bacteria to host epithelial cells. Proteins with the most potential were assessed by analyzing the reactivities of human sera with varying degrees of colonization blockage. Proteins which reacted with the primary protective antibody in mucosal sites, IgA, were prioritized. Identification of those proteins through mass spectrometry will be crucial in creating more effective, long-term protection against S. pneumoniae infections.

The use of food supplements containing natural chemopreventive compounds increased in recent years. Some of the most popular chemopreventive compounds are flavonoids. Due to their natural origin, flavonoids are generally accepted as safe compounds. They exert antioxidant, anti-cancer and anti-inflammatory properties. However, flavonoids should be considered as foreign compounds (xenobiotics). Flavonoids interact with many enzymes, among the most important belong cytochromes P450 (CYPs), key enzymes of the first phase of biotransformation of xenobiotics (e.g. drugs, carcinogens). CYPs catalyze reactions leading mainly to detoxification of xenobiotics. However, some CYPs are involved in the activation of carcinogens, particularly CYP1A1 and CYP1A2 activate e.g. heterocyclic amines. Flavonoids might enhance the activation of carcinogens via induction of these CYPs or stimulation of their activities and hence, increase the risk of a cancer development. The thesis is focused on the influence of flavonoids and food carcinogens on the induction and activity of CYP1A1 and CYP1A2 in liver and small intestine of rats. For the purpose of this study, the small intestine was dissected into three parts: proximal (nearest to stomach), middle and distal. Western blotting was used for the evaluation of CYP...

Apesar das recomendações da Organização Mundial da Saúde, na reunião ministerial realizada em Amsterdam, Holanda em 2000, a tuberculose continua em ritmo crescente, atingindo principalmente os países em desenvolvimento e pessoas com o sistema imunológico comprometido, principalmente as infectadas pelo vírus da imunodeficiência adquirida. Os métodos utilizados no diagnóstico continuam os mesmos utilizados por muitos anos, cujas limitações impedem a ação rápida dos programas de saúde que buscam interromper a cadeia de transmissão da doença. Continuando uma linha de pesquisa do Laboratório de Soroepidemiologia e Imunobiologia do IMTSP, utilizando o método do Western Blotting, procuramos neste trabalho ampliar os conhecimentos da resposta imunológica de anticorpos em pacientes com tuberculose pulmonar, clinica e laboratorialmente definida, avaliando a participação das imunoglobulinas IgG, IgA e IgM, subclasses de IgG (IgG1 e IgG3) e a avidez da imunoglobulina IgG em amostras de soros colhidas no início e no final do tratamento. Nossos resultados mostraram que o melhor marcador imunológico foi a imunoglobulina IgG por apresentar melhor desempenho diagnóstico quando comparada com os resultados dos métodos microbiológicos e de dosagem de interferon gama, Quantiferon TB Gold. As frações protéicas que apresentaram melhor desempenho diagnóstico foram as de 38 e 30 KDa / Despite the recommendations of the World Health Organization, during the Ministerial meeting held in Amsterdam, Holland in 2000, tuberculosis continues at an important increasing rate, affecting mostly developing countries and people with severe compromised immune systems, especially those infected with human acquired immunodeficiency virus. The methods used for diagnosis are the same used for many years, whose limitations prevent the rapid action of countries health programs that seek to stop the chain of disease transmission. Continuing a line of research of the Laboratory of Seroepidemiology and Immunobiology of IMTSP using the method of Western blotting, in this study we tried to broaden the knowledge of the immune response of antibodies in patients with pulmonary tuberculosis, clinical and laboratory defined by evaluating the participation of IgG, IgA and IgM, IgG subclasses (IgG1 and IgG3) and immunoglobulin IgG avidity in serum samples collected in the beginning and end of treatment. Our results showed that the immunoglobulin IgG was best immunological marker when compared with the results of microbiological methods and determination of interferon gamma, QuantiFERON TB Gold. The proteins fractions that showed better diagnosis performance were 38 and 30 KDa

Este estudo teve como objetivo investigar incialmente o efeito do pHf na qualidade da carne, nas concentrações de HSP27 e HSP70, bem como no perfil proteômico da carne (Longissimus thoracis) de bovinos cruzados - 1/2 (Simental Sul Africano x Nelore) de forma a contribuir para a predição de biomarcadores que poderão ser agregados em programas de melhoramento genético. Foram avaliados 415 bovinos (180 fêmeas e 235 machos imunocastrados) terminados em confinamento. As carcaças foram classificadas de acordo com pHf, mensurados 48 horas após o abate, em dois grupos: normal (pHf ≤ 5,80) e intermediário (pHf = 5,81 - 6,19). Os parâmetros físico-químicos pH, cor (L*, a* e b*), perda de água por cocção (PAC, %) e força de cisalhamento (FC, kg), foram mensurados para avaliar a qualidade da carne em dois tempos de maturação (1 e 14 dias). Para a quantificação de HSP27 e HSP70 foram selecionadas 38 amostras em função dos grupos de pHf, dentro de cada tempo de maturação, totalizando 76 amostras. Para a realização das análises proteômicas foram selecionadas três amostras de cada grupo de pHf nos dois tempos de maturação, totalizando doze amostras. Observou-se interação (p<0,05) entre os grupos de pHf e os tempos de maturação para a cor e FC. A concentração de HSP27 foi maior (p<0,05) em pHf intermediário e com 1 de maturação, para a HSP70 só foi possível observar maior concentração (p<0,05) aos 14 dias de maturação, as correlações indicam que as HSPs modulam a qualidade da carne. Foram identificadas 13 proteínas diferencialmente expressas (p<0,05) envolvidas com funções metabólicas (triosefosfato isomerase - TPI1; fosfoglicerato mutase 2 - PGAM2; malato desidrogenase - MDH1; piruvato quinase - PKM2; e adenalato quinase isoenzima 1 - AK1), estrutural (troponina I tipo 2 - TTNI2; tropomiosina cadeia beta - TPM2; troponina C tipo 2 - TNNC2; e cofilina 2 - CFL2) e defesa em resposta ao estresse (proteína deglicase DJ-1 - PARK7; αβ-cristalina - CRYAB; proteína do choque térmico 27 - HSPB1; e peroxirredoxina 1 - PRDX1). As correlações demonstraram que essas proteínas estão envolvidas na determinação do pHf e dos demais atributos da qualidade da carne. A bioinformática permitiu observar que essas proteínas estão envolvidas nas três categorias de ontologia gênica, sendo 18 termos de componentes celulares, 1 termo de função molecular e 61 termos dos processos biológicos, foram identificadas também 6 vias metabólicas. A proteína MDH1, esteve associada a mecanismos de produção de energia, confirmando o potencial desta como um biomarcador para a determinação do pHf assim como para a cor da carne, enquanto que a TPI1 foi relacionada somente no estabelecimento do pHf. Outras proteínas como a PKM2, com função metabólica, e a PARK7, com função protetora, estiveram associadas aos atributos maciez e cor da carne, respectivamente. Os resultados obtidos são de grande relevância no âmbito das ciências da carne e do melhoramento genético animal, por permitir a identificação de possíveis biomarcadores que poderão ser utilizados na seleção animal. / The objective of this study was to investigate the effect of pHf on meat quality, on the concentrations of HSP27 and HSP70, as well as on the proteomic profile in beef (Longissimus thoracis) of crossbreed cattle - 1/2 (South African Simmental x Nellore) - in order to explore the contribute to the prediction of biomarkers that can be added to the process of animal selection in breeding programs. Were evaluated 415 cattle (180 females and 235 immunocastrated males) feedlot-finished. Carcasses were classified according to pHu, measured 48 hours after slaughter, in two groups: normal (pHu ≤ 5.80) and intermediate (pHu = 5.81 - 6.19). The physical-chemical parameters pH, color values (L *, a * and b *), cooking loss (CL,%) and shear force (SF, kg) were measured to evaluate the meat quality in two aging times (1 and 14 days). For quantification of HSP27 and HSP70, 38 samples were selected according to the pHu groups, and aging time, totaling 76 samples. To perform the proteomic analysis were selected three samples from each group and aging time, totaling twelve samples. Color and SF meat quality attributes showed interaction (p<0.05) between pHu groups and aging times. The concentration of HSP27 was higher (p<0.05) at intermediate pHu and at 1 day of aging. It was only possible to observe a higher concentration (p<0.05) for HSP70 at 14 days of aging. Correlations analysis indicate that HSPs modulate the quality of meat. Thirteen differentially expressed proteins (p<0.05) were identified as involved with metabolic (triosephosphate isomerase - TPI, phosphoglycerate mutase 2 - PGAM2; malate dehydrogenase, cytoplasmic - MDH1; pyruvate kinase - PKM2; and adenylate kinase isoenzyme 1- AK1), structural (troponin I type 2 - TTNI2; tropomyosin beta chain - TPM2; troponin C type 2 - TNNC2; and cofilin 2 - CFL2) and defense in response to stress functions (protein deglycase DJ-1- PARK7; αβ-cristallin - CRYAB; heat shock protein 27 - HSPB1; and peroxiredoxin 1 - PRDX1). Correlations analysis showed that these proteins are involved in the determination of pHu and other attributes of meat quality. Using bioinformatics it was possible to observe that these proteins are involved in three gene ontology categories, which were 18 cellular components terms, 1 molecular function term and 61 biological processes terms. Other six metabolic pathways have also been identified. The MDH1 protein was associated with energy production mechanisms, confirming its potential as a biomarker for the determination of pHu as well as meat color, while TPI was related to the establishment of pHu only. Other proteins such as PKM2, with metabolic function, and PARK7, with protective function, were associated with the attributes of meat tenderness and color, respectively. The obtained results are of great relevance in the field of meat science and animal breeding genetic, it allows the identification of biomarkers that can be used in animal selection.

Diversas alterações genéticas estão associadas à patogênese do carcinoma epidermoide (CE), a neoplasia maligna mais comum de cabeça e pescoço. Algumas dessas alterações comprometem proteínas pertencentes à via de sinalização do AKT, envolvida em diferentes fenômenos celulares. Este projeto teve como objetivo estudar a expressão da proteína pAKT em linhagens celulares de carcinomas epidermoides de cabeça e pescoço, de forma a verificar possíveis alterações na expressão dessas moléculas em células de CE tratadas com Curcumina e Celecoxib. Foram utilizadas duas linhagens celulares de CE de cabeça e pescoço e uma linhagem de queratinócitos que foram divididas em quatro grupos: a. grupo controle não tratado; b. células tratadas com Curcumina, c. células tratadas com Celecoxib d. células tratadas com Curcumina e Celecoxib. A proliferação celular foi monitorada através do teste de viabilidade celular. A análise da expressão da proteína foi realizada através da técnica do Western Blot. Desta forma, foi possível entender em maior profundidade a ação do Celecoxib, da Curcumina e sua associação na via do AKT em carcinomas epidermoides de cabeça e pescoço. A associação de Curcumina com Celecoxib foi o tratamento que apresentou melhores resultados na redução da viabilidade celular. A linhagem SCC9 não apresentou expressão de pAKT após o tratamento com Curcumina e com a associação desta com o Celecoxib. A linhagem HaCat apresentou maior estabilidade na expressão de pAKT nos dois tempos de tratamento no grupo tratado com a associação das substâncias. A combinaçãoo da Curcumina com o Celecoxib mostrou resultados satisfatórios e promissores. / Several genetic changes are associated with the squamous cell carcinoma\'s (SCC) pathogenesis, the most common malignant head and neck tumor. Some of these changes compromise proteins that belong to the AKT signaling pathway, involved in different cellular\'s phenomena. The aim of this project was to study the expression of pAKT in head and neck SCC cell lines in order to investigate possible alterations in these molecules\'s expression in cells treated with Curcumin and Celecoxib. Two head and neck SCC cell lines and a line of keratinocytes was divided into four groups: a. control group: untreated; b. cells treated with Curcumin, c. cells treated with Celecoxib d. cells treated with Curcumin and Celecoxib. Cell proliferation was monitored by cell viability test. Analysis of the protein\'s expression was performed using the Western blot technique. Then was possible to understand the action of Curcumin, Celecoxib and its association in the AKT pathway in head and neck SCC. Curcumin\'s association with Celecoxib was the treatment that showed best results in cell viability reduction. The SCC9 cell line not presented pAKT expression after the treatment with Curcumin and its association with Celecoxib. The cell line HaCat showed greater stability in pAkt expression during the treatment period with the association of substances. The association of Curcumin and Celecoxib showed satisfactory and promising results.

Apesar da Organização Mundial de Saúde (OMS) ter adotado medidas de controle, a hanseníase permanece como um problema social e de saúde pública em muitos países. O diagnóstico clínico e a baciloscopia permanecem como as principais ferramentas utilizadas para a classificação dos pacientes e definição da terapêutica a ser instituída. A identificação de novos antígenos de M. leprae, o desenvolvimento de novos métodos laboratoriais e melhorar o desempenho de testes sorológicos já existentes são prioridades para tentar atingir as metas da OMS programadas para o período de 2011-2015. Neste estudo avaliamos o desempenho diagnóstico dos antígenos glicolipídeo sintético ND-O-BSA para pesquisa de anticorpos totais e recombinante LID-1, para pesquisa anticorpos IgG por ELISA; e o perfil de reatividade de anticorpos IgG contra proteínas nativas de M. leprae por Western Blotting, em amostras de soros de pacientes de área endêmica com diferentes formas clínicas da doença. Nossos resultados mostraram que os testes ELISA ND-O-BSA e LID-1 auxiliaram na detecção de 70% dos pacientes multibacilares com baciloscopia negativa. O valor preditivo negativo foi de 94% para ambos os testes. A análise do Western Blotting mostrou que pacientes multibacilares possuem anticorpos IgG para a fração de 38kDa e região de 3,5kDa, esta reatividade não foi observada no grupo controle. Nosso estudo sugere a utilização do ELISA, com antígenos recombinante e sintético, na rotina diagnóstica; e que a fração de 38kDa e região de 3,5kDa, de antígeno nativo de M. leprae, são bons marcadores no diagnóstico de hanseníase e no prognóstico de pacientes com as formas borderline e indeterminada da doença. / Although several control measures have been adopted by the World Health Organization, (WHO) leprosy continues to be a social and public health problem in many countries. Clinical diagnosis and acid-fast bacilli skin smear are the main tools used to classify patients and define therapy. According to the WHO program for 2011-2015, the identification of new Mycobacterium leprae antigens, the development of new laboratory methods and improved serological tests are the priorities. In the present study, we evaluated the diagnostic performance of the synthetic glycolipid antigen, ND-O-BSA, to detect total antibodies and the recombinant antigen LID-1 to detect IgG antibodies by ELISA and the IgG reactivity profile against native M. leprae proteins by Western blot in serum samples from leprosy patients classified in the wide spectrum of the disease. Our results showed that ND-O-BSA and LID-1 ELISA are able to detect the disease in 70% of multibacillary patients with negative skin smears. The negative predictive values were 94% for both tests. The Western blot analysis revealed that most multibacillary patients had IgG antibodies against the 38 kDa and 3.5 kDa regions; this reactivity was not observed in the control group. Our study suggests the use of ELISA, with recombinant or synthetic antigens, in routine diagnosis and that the 38 kDa fraction and the 3.5 kDa region, from native M leprae antigen, are good markers for the diagnosis of leprosy and its prognosis as shown for the borderline and indeterminate forms of the disease.

No hipotálamo, centro regulador de uma variedade de comportamentos inclusive o reprodutivo, são produzidos diversos peptídeos moduladores, dentre eles o hormônio concentrador de melanina [MCH]. Já foi observada presença do MCH também em tecidos periféricos, incluindo os testículos. Por isso buscamos sua presença no ovário de ratas nas fases do ciclo estral, gestantes e lactantes. Para a determinação da presença do peptídeo foram utilizados os métodos de imuno-histoquímica e western blotting, para a detecção do RNAm, a hibridização in situ e RT-PCR, e ensaio imunoenzimático para determinação de níveis séricos hormonais de progesterona, prolactina e MCH. Nossos experimentos indicam a presença do RNAm do ppMCH no ovário, bem como do peptídeo em todas as fases do ciclo reprodutivo, no corpo lúteo e na medula ovariana, resultado quantificado pela técnica de western blotting. Além do mais, observamos que os níveis séricos de MCH são constantes nas fases analisadas e que a contribuição do ovário nesses níveis é significativa. / In the hypothalamus, the regulatory center of a variety of behaviors, including reproductive behavior, several peptides modulating these functions are produced, among them the melanin-concentrating hormone [MCH]. In addition to the brain tissue, its presence in several peripheral tissues, including the testis, has been observed. Therefore, we used rats to investigate the presence of MCH in the estrous cycle phase, during gestation and lactation periods. In order to determine the presence of the peptide, immunohistochemistry and western blotting methods were used. To detect the preproMCH RNAm, we used in situ hybridization and RT-PCR, and immunoenzymatic assay to determine serum levels of progesterone, prolactin and MCH. Our findings demonstrated the presence of ppMCH mRNA in ovary, as well as the peptide, and it was localized in the corpus luteum and ovarian marrow. Furthermore, we observed that serum MCH levels are constant in the analyzed phases and that the contribution of the ovary at these levels is significant.

A proteína ligada à vitamina D (VDBP) é a principal responsável pelo transporte dos metabólitos da vitamina D e a sua presença na urina pode indicar lesão tubulointersticial, conforme observado em ratos e humanos. A determinação urinária da proteína ligada ao retinol (RBP), responsável por carrear o retinol do fígado para os tecidos periféricos, por sua vez, está associada à fibrose intersticial dos rins. A albuminúria pode estar relacionada a lesões glomerulares e/ou tubulares (não reabsorção). A proteína de Tamm-Horsfall (THP) normalmente é observada na urina, sendo sintetizada exclusivamente pelas células epiteliais da alça de Henle e do túbulo contornado distal, entretanto quando não detectada, pode indicar lesão nestes segmentos do néfron e/ou diminuição do número de néfrons. Em cães, há poucos estudos sobre as referidas proteínas na urina, especialmente nos casos de doença renal crônica (DRC). A hipótese deste estudo seria de que a avaliação da razão proteína:creatinina urinária (RPC) em cães com DRC per si não forneceria informações suficientes, pois não identificaria os segmentos dos néfrons comprometidos, mas que a determinação de proteínas específicas, pela análise conjunta da eletroforese e do Western blotting, sinalizariam a presença de lesões glomerulares e/ou tubulares, e que a THP poderia estar ausente ou presente em menor intensidade nos estágios avançados da DRC, indicando lesão tubular distal e/ou perda importante do número de néfrons. O presente estudo objetivou avaliar a presença de albumina, VDBP, RBP e THP na urina de cães com DRC, nos estágios 1 ao 4 (IRIS), pela análise conjunta da eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e Western blotting. O total de 49 cães compuseram os grupos: grupo C clinicamente normal (n= 9), grupo E1 (estágio 1; n=10), grupo E2 (estágio 2; n=10), grupo E3 (estágio 3; n=10) e grupo E4 (estágio 4; n=10). Houve o predomínio de bandas de proteínas de baixo peso molecular (PM <60kDa) em todos os grupos de cães com DRC (E1, E2, E3 e E4), e especificamente para o grupo E4 que apresentava média da RPC de 4,37 e, portanto, esperar-se-ia o predomínio de proteínas de alto PM (PM> 60kDa). Neste grupo, além da imunodetecção da albumina, também foi identificada, em grande intensidade, proteínas de baixo PM (VDBP e RBP). No grupo E3 também foram imunodetectadas a VDBP e RBP, com média da RPC de 1,51 e de 3 a 7 bandas de proteínas de baixo PM. Ainda, a imunodetecção da VDBP e RBP foi constatada nos estágios inicias (E1 e E2) da DRC frente a valores da RPC normais (não proteinúricos), sendo este achado considerado como marcador precoce de lesão renal. A VDBP e RBP não foram identificadas em cães clinicamente normais. A menor intensidade de imunodetecção da THP nos estágios mais avançados pode sugerir mau prognóstico. Conclui-se que o valor da RPC per si não foi capaz de indicar a origem da proteinúria, se glomerular e/ou tubular, sendo necessário, portanto, a análise conjunta da eletroforese (PM) e do Western blotting (albumina, VDBP, RBP e THP) e que, assim, permitiu identificar o segmento do néfron comprometido que acarretou na perda ou na diminuição urinária de proteínas. / Vitamin D-binding protein (VDBP) is the main carrier of the Vitamin D metabolites and its presence in urine is associated with the development of tubulointersticial injury, according to previous studies in rats and humans. Retinol-binding protein (RBP) carries retinol from liver to peripheral tissues, and its urinary detection is also associated with tubulointersticial injury. Albuminuria suggests glomerular lesion, but also may indicate tubular dysfunction (impairment of reabsorption). The presence of Tamm-Horsfall protein (THP) is expected in the urine of clinically normal people and animals, because it is synthesized exclusively by the epithelial cells of the distal segment of nephron, and when it is not detected it may indicate distal tubular injury and/or massive nephrons loss. However in dogs, there are few studies about these urinary proteins especially in cases of chronic kidney disease (CKD). The hypothesis of the present study was to investigate that not only urinary protein-to-creatinine ratio (UPC) measurements would be enough to localize properly the injury to a specific nephron site, but also the evaluation of specifics urinary proteins by electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting could provide information regarding to the presence of glomerular and/or tubular injury; in addition, less excretion of THP, or its absence in urine, could be associated with advanced stages of CKD. The aim of the present study was to evaluate albumin, VDBP, RBP e THP in the urine of 40 CKD dogs, on stages 1 to 4 (IRIS), by using of electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting. Forty-nine dogs were subdivided into: C group healthy dogs (n= 9), E1 group (stage 1; n=10), E2 group (stage 2; n=10), E3 group (stage 3; n=10) e E4 group (stage 4; n=10). The predominance of low molecular weight proteins (MW <60kDa) was detected in all CKD groups, mainly in E4 group that the mean of UPC was 4.37, and then it would be expected high MW proteins findings (MW >60 kDa). In fact, in E4 group, albumin was immunodetected, however low molecular weight proteins (VDBP and RBP) were also detected and in high intensity. VDBP and RBP were also observed in E3 group (mean UPC = 1.51) and 3 to 7 bands of low molecular weight were detected. In the early stages of CKD (E1 and E2 groups), VDBP and RBP were also identified but UPC values were normal (non-proteinuric), which may suggest the role of these proteins as an early marker of renal injury. VDBP and RBP were not detected in healthy dogs. THP was observed in less intensity in the advanced stages of CDK that may suggest bad prognosis. In conclusion, UPC measurement per se was not able to indicate adequately the injury to a specific nephron site (e.g. glomerular and/or tubular), and therefore the additional information of electrophoresis (MW) and Western blotting (VDBP, RBP and THP) testing could allow the identification of the nephron site injured that caused loss (proteinuria) or decrease in urinary proteins.

O sorodiagnóstico da toxocaríase humana é geralmente baseado na detecção de anticorpos IgG anti-Toxocara spp. em amostras de soro pelo teste ELISA utilizando os antígenos de excreção-secreção de larvas de T. canis (TES). No entanto, observa-se uma ocorrência de reatividade cruzada com outras helmintíases nas áreas endémicas de poliparasitismo. Vários estudos têm mostrado que as glicanas presentes nos antígenos dos helmintos podem ser as responsáveis pela reatividade cruzada. Neste estudo, avaliamos o efeito da deglicosilação dos antígenos TES na sensibilidade e especificidade dos testes de ELISA e Western-blotting para detecção de anticorpos IgG, IgM e IgE. Para a deglicosilação dos antígenos TES, estes foram tratados com diferentes concentrações de hidróxido de sódio (NaOH) ou metaperiodato de sódio (NaIO4) e foram testados 58 amostras de soro de pacientes com toxocaríase visceral, 75 amostras de soros de pacientes com outras helmintíases, e 95 amostras de soro de indivíduos saudáveis. Nossos resultados mostraram que os antígenos TES foram totalmente deglicosilados com NaOH 100mM por 4 horas a 37°C (dTES), enquanto que o tratamento com NaIO4 não gerou bons resultados. A sensibilidade e especificidade dos antígenos TES e dTES na detecção de anticorpos IgG pelo teste de ELISA foi de 100%, com menor reatividade cruzada (5,3%) para os antígenos dTES, se comparada com os antígenos TES (13,3%). Todos os pacientes com toxocaríase mostraram anticorpos IgG contra as cinco frações dos antígenos TES (32, 45, 55, 70 e 120 kDa) e contra a única fração de 26kDa dos antígenos dTES, com sensibilidades e especificidades de 100% para ambos os antígenos. A reatividade cruzada, observada com as frações de 70 kDa, 55 kDa e 32 kDa dos antígenos TES, foi eliminada totalmente quando utilizaram-se os antígenos dTES. A detecção de anticorpos IgM pelo teste de ELISA mostrou reatividade inespecífica nos três grupos estudados, com sensibilidades de 39,7% e 34,5% e especificidades de 95,8% e 96,8%, para os antígenos TES e dTES, respectivamente, porém com ocorrência de reatividade cruzada de 24% e 28% para ambos os antígenos. Os três grupos estudados apresentaram reatividade contra quase todas as frações dos antígenos TES e dTES. A detecção de anticorpos IgE apresentou sensibilidades de 63,79% e 62,07% e uma especificidade de 100%, e uma reatividade cruzada de 26,6% e 53,3% para ambos os antígenos. A maioria dos pacientes com toxocaríase (74,1%) mostraram anticorpos contra as frações de 32, 55 e 70 kDa, em quanto que não houve reatividade nos pacientes com outras helmintíases ou nos indivíduos saudáveis. Estes resultados mostraram que a deglicosilação dos antígenos TES permite reduzir a ocorrência de reatividade cruzada nos pacientes com outras helmintíases, elevando o valor diagnóstico da detecção de anticorpos IgG. No entanto, este procedimento não permite melhorar a sensibilidade e especificidade na detecção de anticorpos IgM e não permite elevar a sensibilidade na detecção de anticorpos IgE pelo teste de ELISA. Por outro lado, os resultados discordantes na especificidade do Western-blotting para a detecção de anticorpos IgG, IgM e IgE sugerem a presença de epítopos conformacionais presentes no estado nativo dos antígenos TES que estariam implicados na reação cruzada observada no teste de ELISA / Serodiagnosis of human toxocariasis is usually based on the detection of anti-Toxocara spp. IgG antibodies in serum samples by ELISA test using T.canis larvae excretory-secretory (TES) antigens. However, a cross-reactivity occurrence is observed in endemic areas of polyparasitism. Many studies have shown that the glycan structures, present in helminth antigens, can be the responsible for the cross-reactivity. In this study, we evaluated the deglycosylation of the TES antigens on the sensitivity and specificity of both the ELISA and Western-blotting for the detection of IgG, IgM, and IgE antibodies. For the deglycosylation of the TES antigens, they were treated with different concentrations of sodium hydroxide (NaOH) or sodium metaperiodate (NaIO4), and 58 serum samples of 58 patients with visceral toxocariasis, 75 serum samples of patients with other helminth infections, and 95 serum samples of healthy individuals. Our results show that the TES antigens were totally deglycosylated with 100 mM NaOH for 4 hours at 37°C (dTES), whereas not good results were obtained with sodium metaperiodate. The sensitivity and specificity of both TES and dTES antigens were 100% in detecting IgG antibodies by ELISA; the cross-reactivity observed with TES antigens (13.3%) was reduced (5.3%) when dTES antigens were used. All toxocariasis patients showed IgG antibodies against the five fractions of TES antigens (32, 45, 55, 70, and 120 kDa), but also with the 26-kDa single fraction of dTES antigens, with sensitivities and specificities of 100% for both antigens. The occurrence of cross-reactivity, observed mainly with the 32-, 55-, and 70 kDa fractions of the TES antigens, was totally eliminated when the dTES antigens were used. The detection of IgM antibodies by ELISA test showed unspecific reactivity in all studied groups, with sensitivities of 39.7% and 34.5%, and specificities of 95.8% and 96.8% for both antigens; the occurrence of cross-reactivity for both antigens were 24% and 28%, respectively. All studied groups have IgM antibodies against almost all fractions of TES antigens and the single fraction of dTES. The detection of IgE antibodies by ELISA test showed sensitivities of 63.8% and 62%, specificities of 100%, and occurrence of reactivity of 26.6% and 53.3% for TES and dTES antigens, respectively. The majority of the toxocariasis patients (74.1%) showed IgE antibodies against the 32-, 55-, and 70 kDa fractions of the TES antigens, whereas there was not reactivity in sera from patients with other helminth infections or healthy individuals. These results showed that the deglycosylation of the TES antigens reduces the occurrence of cross-reactivity in patients with other helminth infections, increasing the diagnostic value for the detection of IgG antibodies. However, this procedure does not improve the sensitivity nor reduces the occurrence of cross-reactivity in the detection of IgM antibodies. Likewise, this procedure does not improve the sensitivity in the detection of IgE antibodies by the ELISA test. On the other hand, the high specificity obtained in the detection of IgG, IgM, and IgE by Western-blotting suggest that conformational epitopes of the TES antigens may also be the responsible for the cross-reactivity in the ELISA test