Les Anthracyclines (ex : Doxorubicine (Dox)) fréquemment utilisées en chimiothérapie anticancéreuse peuvent conduire à une cardiotoxicité aboutissant à de l’insuffisance cardiaque et à une cardiomyopathie dilatée. Au niveau cellulaire, la Dox est connue pour générer un stress oxydant fort, s’intercaler directement entre les brins d’ADN, inhiber les Topoisomérase II (TopII) ou encore provoquer une détresse énergétique conduisant à la mort aussi bien des cellules tumorales que des cardiomyocytes. Néanmoins, les voies de signalisations/mécanismes moléculaires complets ne sont pas identifiés à ce jour. L’objectif de ce travail de thèse consiste donc à mieux comprendre les mécanismes de la cardiotoxicité de la Dox et à identifier de nouvelles cibles cellulaires cardio-protectrices limitant les effets cardiaques délétères de cette Anthracycline. Dans ce but, nous focalisons nos recherches sur le rôle de la protéine EPAC1, un facteur d’échange pour les petites protéines G directement activé par l’AMPc, dans la réponse des cellules cardiaques à la Dox. EPAC1 est une protéine centrale de la voie de signalisation AMPc dans le cardiomyocyte en réponse à une stimulation β-adrénergique. Or, plusieurs études ont récemment montré l’implication de certains acteurs de cette voie (Rac, RhoA) dans la cardiotoxicité induite par la Dox faisant d’EPAC1 une cible thérapeutique potentielle. Nous avons donc étudié in vitro (cultures primaires de cardiomyocytes de rat nouveau-nés (Dox 1µM)) et in vivo (souris sauvages ou invalidées pour EPAC1 (Dox, iv, 12mg/kg total)) les effets de la Dox sur l’expression et l’activité d’EPAC1 et sur les voies de signalisation qu’il régule. In vivo, les souris sauvages traitées à la Dox développent une cardiomyopathie dilatée associée à une altération de l’homéostasie calcique 15 semaines après traitement. In vitro, la Dox induit des modifications de l’expression/activité d’EPAC1 et de l’homéostasie calcique, la formation de complexes TopIIβ/ADN conduisant à des dommages à l’ADN, une dérégulation de la biogénèse et de l’activité de la chaîne respiratoire mitochondriale et finalement à l’apoptose des cardiomyocytes. L’inhibition pharmacologique (Ce3F4, Esi09) ou génétique d’EPAC1 réduit l’ensemble des dommages cellulaires in vitro et empêche le développement de la cardiomyopathie dilatée in vivo. De manière importante, nous montrons que contrairement à ce qui est observé dans les cellules cardiaques, l’inhibition d’EPAC1 augmente la toxicité de la Dox envers les cellules tumorales et en particulier envers les cellules MCF-7 issues de cancer mammaire métastatique, principale indication de la Dox. Nos résultats suggèrent donc que l’inhibition d’EPAC1 semble être une stratégie thérapeutique prometteuse dans la prévention de la cardiomyopathie induite par les traitements anticancéreux à base d’Anthracyclines. / Doxorubicin (Dox) is an Anthracycline commonly used to treat many types of cancer; unfortunately this chemotherapeutic agent often induces side effects such as cardiotoxicity leading to cardiomyocyte death and dilated cardiomyopathy (DCM). This cardiotoxicity has been related to reactive oxygen species generation, DNA intercalation, topoisomerase II inhibition and bioenergetics alterations resulting in DNA damages and ultimately in cardiomyocyte death. Nevertheless, complete molecular mechanisms are not yet identified. Therefore, there is a need for new treatment options and strategies aiming at reducing Dox side effects in the heart. Among these mechanisms, EPAC1 (Exchange Protein directly Activated by cAMP) signaling could be worth investigating as EPAC1 indirectly activates small G proteins (Rac1 and Rho A), which are known to be involved in Dox-induced cardiotoxicity. Therefore, we have investigated the effect of Dox on EPAC1 signaling in both in vivo mice model (C57BL/6 vs EPAC1 KO mice, iv injections, 12mg/kg) and in vitro model (primary culture of neonatal rat cardiomyocytes (NRVM), Dox 1μM). In vivo, Dox-treated mice developed a DCM associated with Ca2+ homeostasis dysfunction. In vitro, Dox induced DNA damages and cell death associated with huge mitochondrial disorders, characterized by a decrease in mitochondrial biogenesis and respiratory chain activity. This cell death is associated with apoptotic features including mitochondrial membrane permeabilization, caspase activation, cell size reduction and relative plasma membrane integrity. We also observed that Dox led to a modification of the protein level and the activity of EPAC1 in the same manner to the cAMP level. By contrast, the inhibition of EPAC1, prevented DNA/TopIIβ complexes, decreased Dox-induced DNA damages, loss of mitochondrial membrane potential, apoptosis and finally cardiomyocyte death. Mitochondrial biogenesis and respiratory chain activity operated normally when EPAC1 was inhibited. These results were confirmed in vivo since Dox-induced cardiotoxicity was prevented in EPAC1 KO mice as evidenced by unaltered cardiac function (no DCM) at 15 weeks post-treatment. Interestingly, the protection conferred by EPAC1 inhibition was not transferred in human cancer cell lines treated by Dox. Inhibition of EPAC1 could thus be a valuable therapeutic strategy to limit Dox-induced cardiomyopathy during cancer chemotherapy.

L’hémostase primaire est un processus permettant la formation d’un clou plaquettaire qui sera stabilisé par un réseau de fibrine. Ce caillot est également consolidé grâce à des phases tardives de l’hémostase primaire résultant des fonctions plaquettaires ; il s’agit principalement de la rétraction qui diminue la taille du caillot afin de le stabiliser. Cette phase est déclenchée par une signalisation « outside-in », consécutive à l’activation de l’intégrine αIIbβ3 et à l’agrégation plaquettaire, et est dépendante d’une réorganisation du cytosquelette. Le premier objectif de ce travail a été d’étudier la signalisation impliquée dans la rétraction, et en particulier l’implication des protéines ROCK, MLCK, Rac-1 et de l’actine dans l’activité de la chaine légère de la myosine (MLC) . MLC est en effet une protéine clé de la réorganisation du cytosquelette. Nous avons mis en évidence une phosphorylation biphasique de MLC dont le deuxième pic, corrélé à la rétraction, est dépendant de Rac1 et de la polymérisation de l’actine. Cette étude a été appliquée à une pathologie, le syndrome de Lowe. Il s’agit d’une maladie génétique rare, également appelée OCRL (Oculo cérébro rénal de Lowe) en référence aux organes majoritairement touchés. Suite à l’observation d’événements hémorragiques per et postopératoires suggérant une instabilité du caillot et l’observation dans une étude précédente d’un temps d’occlusion allongé au PFA100®, nous avons mis en place une étude sur 15 patients et 15 témoins pour lesquels nous avons étudié les différentes phases de l’hémostase primaire. Outre une anomalie et un retard de maturation des mégacaryocytes, nous avons mis en évidence pour la première fois chez ces patients un défaut de la voie « outside-in » responsable d’une anomalie de l’étalement plaquettaire et de la rétraction du caillot. Ce défaut de rétraction, dû à un défaut d’activation de MLC, pourrait être en partie responsable des événements hémorragiques observés chez ces patients. / Primary hemostasis is a mechanism allowing platelet clot formation that is thereafter stabilized by a fibrin network. Fibrin clot is also consolidated following post occupancy events, mainly clot retraction that decrease clot size and thus strengthen it. This phase is triggered by « outside-in » signaling. It is consecutive to αIIbβ3 integrin activation and platelet aggregation, dependent on cytoskeleton organization. Our first objective was to investigate signaling events underlying retraction, and particularly the involvement of ROCK, MLCK, Rac-1, and actin in MLC (Myosin Light Chain) phosphorylation. Indeed, MLC, involved in cytoskeleton rearrangement, is a key protein of this mechanism. We described a MLC biphasic phosphorylation profile, which second peak was dependent of Rac1 and actin polymerization. In a second part, we studied clot retraction signaling in patients with the Lowe syndrome. It is a rare genetic disease, caused by absence of OCRL (oculo cerebro renal of Lowe) protein in reference to the majority of affected organs. The rationale of this study was a previous observation of hemorrhagic events during and after surgeries, suggesting clot instability. A thrombopathy was suggested by a closure time lengthening in the PFA-100 system. The study enrolled 15 patients and 15 controls. Besides a defect of megakaryocyte maturation, we described a defect of « outside-in » signaling responsible for spreading and clot retraction abnormality. This retraction defect, caused by a MLC activity defect, could be partly responsible for hemorrhagic events reported in these patients.