A soja é uma cultura de grande importância na economia mundial. No Brasil, o complexo da soja (grão, farelo e óleo) é responsável por uma parcela significativa das exportações. No entanto, o sucesso da produção é dependente de muitos fatores bióticos e abióticos. A ocorrência de déficit hídrico talvez seja hoje, e mais ainda no futuro, o principal desafio das culturas produtoras de grãos. Sendo assim, a obtenção de cultivares de soja tolerantes à desidratação é de grande interesse. Por ser de caráter poligênico, a tolerância à seca é difícil de ser trabalhada no melhoramento genético clássico. Sendo assim, o uso da engenharia genética apresenta-se como caminho para alcançar este atributo. A regulação transcricional de genes endógenos e a busca da precisão no controle de transgenes são as bases das estratégias de engenharia genética, que apostam nos fatores de transcrição e nos promotores induzíveis para desenvolver plantas tolerantes a estresses abióticos. As proteínas WRKY formam uma grande família de fatores de transcrição que está envolvida em processos fisiológicos e bioquímicos importantes nos vegetais, entre eles, a resposta das plantas ao déficit hídrico. A determinação do perfil de expressão de genes da família WRKY em condição de seca e a avaliação da atividade de seus promotores são os objetivos deste trabalho. Dez genes WRKY induzidos em situação de seca foram selecionados para o estudo: Glyma15g11680, Glyma09g37470, Glyma01g31920, Glyma07g02630, Glyma08g23380, Glyma05g36970, Glyma05g20710, Glyma05g29310, Glyma09g41050, Glyma08g15050. A análise in silico da sequência promotora desses genes revelou a presença de cis-elementos relacionados à resposta da planta a estresses. O perfil de expressão determinado por RT-qPCR mostrou que os genes Glyma15g11680, Glyma07g02630, Glyma05g36970, Glyma08g15050 e Glyma08g23380 são expressos diferencialmente entre os genótipos tolerante e suscetível e também entre folhas e raízes. Para fins de caracterização funcional dos promotores, fragmentos de 500bp e 2000bp a montante do sítio de início da transcrição dos genes Glyma05g36970, Glyma08g15050 e Glyma15g11680 foram clonados em vetores apropriados para transformação genética de plantas. Foram obtidas plantas de tabaco transformadas pelo sistema Agrobacterium tumefaciens. / Soybean is a crop of great importance for the world economy. In Brazil, the soybean complex (beans, meal and oil) is responsible for a significant portion of exports. However, the successful production is influenced by biotic and abiotic factors. The occurrence of drought is today, and perhaps even more in the future, the main challenge of grain crops. Thus it is of great interest to obtain soybean cultivars tolerant to desiccation. The drought tolerance trait is difficult to obtain through classical breeding due to its polygenic basis. In this context, genetic engineering is presented as a way to achieve this attribute. The transcriptional regulation of endogenous genes and the precise control of transgenes are the foundations of genetic engineering strategies that use transcription factors and inducible promoters to develop plants tolerant to abiotic stresses. The WRKY proteins form a large family of transcription factors that are involved in important physiological and biochemical processes in plants, including the response to water deficit. The goals of this work are the determination of the expression profile of WRKY genes under drought conditions and the evaluation of its promoters activity. Ten WRKY genes which are induced by drought were selected for this study: Glyma15g11680, Glyma09g37470, Glyma01g31920, Glyma07g02630, Glyma08g23380, Glyma05g36970, Glyma05g20710, Glyma05g29310, Glyma09g41050 and Glyma08g15050. The in silico analysis of these gene promoter sequences revealed the presence of cis - elements related to plant stress responses. The expression pattern determined by RT- qPCR showed that Glyma15g11680, Glyma07g02630, Glyma05g36970, Glyma08g15050 and Glyma08g23380 genes are differentially expressed between tolerant and susceptible genotypes and between leaves and roots. For the functional characterization of the promoters, 500 and 2000 bp fragments upstream of the transcription start site of Glyma05g36970, Glyma08g15050 and Glyma15g11680 genes were cloned into appropriate vectors for plant genetic transformation. Tobacco plants transformed by Agrobacterium tumefaciens system were obtained.

Em sementes, os lipídeos de reserva são compostos, principalmente, por triacilglicerídeos (TAG), os quais se acumulam durante a fase de maturação do embrião ou endosperma e, durante a germinação da semente são catabolizados, fornecendo energia para o estabelecimento e desenvolvimento da plântula. Na presente tese buscamos, primeiramente, contribuir para um melhor entendimento do processo de síntese de ácidos graxos e TAGs em plantas e algas, por meio de um estudo comparativo das diferentes rotas envolvidas na produção e acúmulo de lipídeos de reserva nestes grupos de organismos. As principais rotas de biossíntese de ácidos graxos e TAGs em algas são análogas às apresentadas em plantas e, ao contrário de plantas, as algas acumulam quantidades significativas de lipídeos na forma de TAGs apenas sob condições desfavoráveis de crescimento ou de estresse. Posteriormente, passamos às análises acerca do fator de transcrição eucariótico NF-Y (Nuclear Factor of Y box), o qual participa da regulação de processos como maturação, síntese e acúmulo de lipídeos em sementes. NF-Y é um complexo hetero-oligomérico formado por três subunidades (NF-YA, NF-YB e NF-YC). Análises filogenéticas mostraram que a diversificação em todas as subunidades do fator de transcrição NF-Y é resultado de diversos eventos de duplicação ao longo da evolução e diversificação das plantas, muitos dos quais ocorridos após a divergência entre mono e dicotiledôneas. O estudo detalhado dos genes que codificam a subunidade NF-YB, sugere um modelo no qual uma subclasse de genes denominados tipo LEC1 (LEAFY COTYLEDON1) teria se originado em plantas vasculares através de processos de neofuncionalização e/ou subfuncionalização. Análises de expressão e de interação proteína-proteína demonstraram a existência de diferentes parceiros NF-YC para LEC1 e L1L, indicando que os genes do tipo LEC1 em mamona não são redundantes e podem ter evoluído para desempenhar diferentes papéis durante o desenvolvimento da semente de mamona. Por fim, realizamos a identificação dos genes alvo diretos de LEC1 nos estágios cotiledonar e de início da maturação da semente de soja (Glycine max). Nossos resultados demonstraram que LEC1 apresenta uma grande quantidade de genes alvo comuns às duas fases de desenvolvimento da semente analisadas, mas também apresenta enriquecimento em diferentes processos metabólicos nos estágios cotiledonar e de início da maturação. Além disso, LEC1 se liga não somente a promotores alvo enriquecidos na sequência canônica CCAAT como também a outras sequências, com destaque para motivos de ligação de fatores de transcrição do tipo bZIP, o que pode indicar que tais fatores de transcrição podem estar relacionados com a regulação do desenvolvimento e maturação da semente exercida por LEC1. / In seeds, lipids of storage are composed mainly of triacilglicerídeos (TAG), which accumulate during the maturation phase of embryo or endosperm, and during seed germination are catabolized, providing energy for the establishment and seedling development . In this thesis, first of all, we focused on the understanding of fatty acid and TAG biosynthesis in plants and algae, through a comparative study of the different pathways involved with lipid production and accumulation in these organisms. The main pathways for fatty acids and TAG biosynthesis in algae are analogous to those demonstrated in higher plants and, in contrast with plants, algae accumulate high levels of TAGs only under unfavorable growth or stress conditions. We also analyzed the NF-Y (Nuclear Factor of Y box) eukaryotic transcription factor, which is involved in the regulation of maturation, lipid biosynthesis and accumulation in seeds. NF-Y is an oligotrimer complex composed by three subunits (NF-YA, NF-YB and NF-YC). Phylogenetic analysis showed that the gene diversification observed for all NF-Y subunits likely resulted from several duplication events along evolution and diversification of plants, some of them occurred after the divergence of monocots and eudicots. The study of the NF-YB subunit encoding genes suggested a model in which LEC1 (LEAFY COTYLEDON1) type gene family originated in vascular plants through a process of neofunctionalization and/or subfunctionalization. Expression analysis and protein interaction experiments demonstrated that are different NF-YC partners for LEC1 and L1L, indicating that LEC1-type genes in castor bean are not redundant and could have evolved to play different roles during castor seed development. Finally, we identified the direct targets of LEC1 in the cotyledon and early maturation stages during soybean seed development (Glycine max). We observed that LEC1 has a high number of common direct targets to both stages of soybean seed development, but also presents enrichment in different metabolic process in cotyledon and early maturation stages. Besides that, LEC1 bind not only the promoter regions enriched in CCAAT binding sequences but also other sequences, especially bZIP binding sites, which can indicate that bZIP transcription factor could be related with the regulation of seed development and maturation performed by LEC1.

A inoculação de rizóbios em espécies leguminosas já é bastante conhecida e levou o Brasil a um avanço na produção de soja. Para garantir a qualidade desses produtos inoculantes é necessário o desenvolvimento de metodologias específicas. A detecção das estirpes constantes na embalagem no produto comercial e em solo e planta inoculada é uma forma de fiscalizar a qualidade do produto. Para tanto os objetivos deste trabalho foram detectar a presença das estirpes de bradirrizóbios recomendadas para a cultura da soja SEMIA 5079 e 5080 (Bradyrizobium japonicum) e SEMIA 587, 5019 (Bradyrizobium elkanii), que devem estar presentes nas formulações de inoculante comerciais, usando-se a técnica de REP- PCR. Detectar a presença destas estirpes em nódulos de plantas de soja inoculadas e em solo de área cultivada. Foi instalado um experimento com soja em vasos, na casa de vegetação. A soja foi inoculada com as estirpes de Bradyrhizobium e com inoculantes comerciais. Os nódulos foram utilizados para a extração de DNA. Também foi realizada extração de DNA de amostras de solo cultivado com soja e de nódulos de soja coletados do campo e de estirpes puras e produto inoculante. As extrações foram realizadas com os Kits: Wizard DNA Purification® (Promega corp., Madison, USA) e Power Soil. Após foi realizada a amplificação do DNA genômico utilizando-se a técnica de REP - PCR com o primer iniciador BOX A1 e com o primer ERIC 1 e ERIC2. O perfil de bandas da amplificação do DNA genômico da mistura de estirpes pela PCR com os oligonucleotideos iniciadores ERIC e BOX A possibilitou a diferenciação de produtos contendo misturas de estirpes diferentes. Nas condições deste trabalho, a técnica de amplificação pela PCR com BOXA1 ou ERIC do DNA de nódulos de plantas inoculadas não se mostra adequada para a identificação das estirpes de rizóbios que induziram a formação destes nódulos em plantas de soja cultivada em casa de vegetação.Não ocorreu a amplificação do DNA extraído de amostras de solo cultivado com soja pela reação em cadeia da polimerase com os oligonucleotídeos iniciadores BOX A e ERIC. A amplificação pela PCR com BOXA1 do DNA extraído de nódulos de plantas cultivadas a campo apresenta baixa similaridade com os obtidos das amostras de produtos inoculantes comerciais utilizados e não permite a identificação da mistura de estirpes que foram inoculadas nas plantas. / Inoculation of rhizobia in legume species is very well known and led Brazil to advance in soybean production. To ensure the quality of these inoculant products is necessary to develop specific methodologies. The detection of strains contained in packaging of the commercial product and in soil and plant inoculated is a way to monitor the quality of the product. Therefore the objectives of this study were to detect the presence of “bradirrizóbios” strains recommended for soybean SEMIA 5079 and 5080 (Bradyrizobium japonicum) and SEMIA 587, 5019 (Bradyrizobium elkanii) that must be present in the formulations of commercial inoculant, by using the technique of REP-PCR. To detect the presence of these strains in inoculated nodules of soybean plants into soil and cultivated area, an experiment was set up with soybeans in pots in a greenhouse. Soybeans were inoculated with the strains of Bradyrhizobium and commercial inoculants. The nodules were used for DNA extraction. Additionally it was carried out DNA extraction from soil cultivated with soybeans and soybean nodules collected from the field and pure strains and inoculant product. The extractions were performed with the following kits: Wizard DNA Purification® (Promega corp., Madison, USA) and Power Soil. Afterwards was performed the amplification of the genomic DNA using the technique of REP - PCR primer with the starting primer A1 and with the primer ERIC1 and ERIC2. The profile of the bands’ amplification of the genomic DNA from the mixture of strains by PCR with primer ERIC and BOX A allowed to differentiate products containing mixtures of different strains. In this study conditions, the technique of PCR amplification with the BOXA 1 or ERIC of DNA from nodules of inoculated plants, is inadequate for the identification of strains of rhizobia, which induced the formation of nodules on soybean plants grown in greenhouse. It was not observed amplification of DNA extracted from soil samples cultivated with soybeans by PCR with primer BOX A and ERIC. Amplification by PCR with BOXA 1 of the DNA extracted from plants’ nodules grown in a field has low similarity with the product samples obtained from commercial inoculants used and it does not allow the identification of the mixture of strains that were inoculated in the plants.

Um dos grandes desafios da pesquisa agrícola atual é desenvolver estratégias para obtenção de plantas mais tolerantes, portanto, continuar ampliando o conhecimento sobre os mecanismos pelos quais as plantas respondem à seca, é essencial para a identificação de rotas metabólicas envolvidas no processo de defesa e o desenvolvimento de genótipos cada vez mais adaptados. Neste trabalho, para a obtenção de plantas de soja tolerantes à seca, a construção RD29A:AtDREB1A a qual confere tolerância ao déficit hídrico foi inserida em cultivares de soja e a biossegurança alimentar da proteína DREB1A/CBF3 de A. thaliana foi avaliada. Também, os extratos protéicos das plantas submetidas ao estresse hídrico foram comparados para a identificação de proteínas de soja diferencialmente expressas que podem estar envolvidas nas respostas à seca. A avaliação de biossegurança alimentar da proteína AtDREB1A in silico mostrou que a proteína não possui características de toxicidade, alergenicidade, antinutricionais, ou sítios de N-glicosilação, assim como, de atividade hemolítica sob eritrócitos de humanos atestado com a proteína AtDREB1A produzida in vitro, indicando ausência de efeitos adversos. A inserção da construção RD29A:AtDREB1A e RD29A:GUS em soja, demonstrou que o promotor RD29A e o fator de transcrição AtDREB1A de A. thaliana são ativados aumentando a tolerância ao déficit hídrico em soja. Vinte linhagens transgênicas foram obtidas por biobalística e apresentaram estabilidade do transgene. Análises histoquímicas confirmaram a indução do promotor RD29A em condições de desidratação e o aumento de expressão de genes de soja GmPip1 GmGols regulados pela proteína DREB1A também foi confirmado por RT-qPCR. Diferenças anatômicas significativas não foram observadas. Em média, os parâmetros fisiológicos foram superiores nas linhagens transgênicas, quando comparadas à sua isolinha BR16. Embora características agronômicas mais adaptativas relacionadas à produção não foram evidentes em casa de vegetação, há uma boa indicação de que a estratégia pode melhorar a tolerância à seca em plantas de soja. Para isso, experimentos a campo já estão sendo conduzidos para uma melhor caracterização agronômica e fisiológica. Na busca por ampliar os conhecimentos sobre os eventos envolvidos nas respostas à seca, a comparação dos extratos protéicos de soja BR16 não transgênica e BR16(P58) geneticamente modificada (GM) com a construção RD29A:AtDREB1A em condições controle e sob déficit hídrico, possibilitou a identificação de “spots” comuns aos dois tratamentos assim como de “spots” diferencialmente expressos, através da metodologia de 2-DE. Nos tratamentos de déficit hídrico, 25 “spots” foram identificados em BR16 não GM e 34 “spots” em P58 GM, entretanto, análises de espectrometria de massa ainda estão em andamento e pesquisas em bancos dados serão fundamentais para a identificação das proteínas diferencialmente expressas em resposta ao déficit hídrico. / One of the challenges in agriculture is to develop strategies to obtain plants with higher drought tolerance. Therefore, the identification of metabolic pathways and understanding of the mechanisms by which plants respond to drought is an essential tool for the development of more adapted genotypes. In this work, the RD29A:AtDREB1A genetic construct which was reported to confer water deficit tolerance was inserted into soybean cultivars, and the food safety of Arabidopsis thaliana AtDREB1A/CBF3 protein was evaluated. Also, protein extracts from soybean plants submitted to water stress conditions were compared to identify differentially expressed soybean proteins involved in drought responses. The in silico evaluation of AtDREB1A protein showed that the protein has no evidence of toxicity, allergenicity, antinutritional features or N-glycosylation sites. No hemolytic activity on human erythrocytes assayed in vitro with AtDREB1A protein was detected, indicating no adverse effects. The insertion of RD29A:AtDREB1A and RD29A:GUS constructs in soybean showed that the RD29A stress-inducible promoter and the AtDREB1A transcription factor were activated and improved drought tolerance in soybean. Using bioballistic transformation, we obtained twenty stably transformed soybean lines. Histochemical analysis confirmed the induction of the RD29A promoter under dehydration conditions and increased expression of two soybean genes activated by AtDREB1A GmPip1 and GmGols were confirmed by RTqPCR. No anatomical differences were observed. On average, physiological parameters were superior in the transgenic line BR16(P58) when compared to the isoline BR16. Although agronomic traits related to higher adaptive production were not evident in greenhouse, there is a good indication that the strategy can improve drought tolerance in soybean. To establish trait efficacy, field experiments are already being conducted to obtain relevant agronomic and physiological data. To better understand the molecular events involved in drought responses, a comparison using protein extracts from genetically modified (GM) BR16(P58) and non-GM soybean BR16 in watered control conditions and under water deficit treatment allowed the identification of common proteins to both treatments as well as of proteins that are differentially expressed between treatments using 2-dimension gel electrophoresis (2-DE). In the water deficit treatment 25 differentially expressed protein spots were identified in non-GM isoline BR16 and 34 spots in BR16(P58). Subsequent analysis of these spots using mass spectrometry is still been conducted and peptide information in available public databases will be essential for identification of differentially expressed proteins.

Neste trabalho realizou-se o estudo da conversão de óleo de soja, fritura e linhaça em biodiesel em função do tempo reacional. Foram avaliados dois processos de transesterificação, por catálise básica e a por metodologia TDSP (Transesterification Double Step Process). A TDSP consiste em uma etapa de catálise básica seguida por uma catálise ácida no mesmo meio reacional. As amostras obtidas foram caracterizadas através da determinação de parâmetros físico-químicos e a conversão foi determinada por espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H). Os melhores resultados de conversão, tanto para transesterificação via catálise básica quanto para a metodologia TDSP, foram de 98%, 96% e 90% para os óleos de soja, fritura e linhaça, respectivamente. Um sistema de instrumentação foi proposto para a planta piloto de produção de biodiesel, disponível no CECOM, que produz biodiesel segundo a metodologia TDSP. Para avaliar o sistema proposto foi realizada a simulação de um programa de supervisão em automação para esta planta, através do software Elipse Scada®, baseado nos parâmetros determinados pelos experimentos em escala laboratorial. / In this work a study of the conversion of soybean, waste cooking and linseed oil to biodiesel as function of reaction time was done Two procedures were performed: the transesterification reaction through basic catalysis and via the TDSP methodology (Transesterification Double Step Process). The TDSP consist of a homogeneous basic catalysis step followed by an acidic catalysis. Hydrogen Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy was applied to characterize the samples. Conversions of 98%, 96% and 90% were reached for soybean oil, waste cooking oil and linseed oil, respectively. An instrumentation system was proposed for the biodiesel pilot plant, available at CECOM, which produces biodiesel according to the TDSP methodology. To evaluate the proposed system, a supervisory program simulation for automation of this plant was done with the Elipse SCADA® software, based on the parameters obtained by the experiments on laboratory scale.

O advento de técnicas de sequenciamento de alta eficiência possibilitou o estudo mais aprofundado de pequenos RNAs, como os microRNAs (miRNAs), a classe melhor caracterizada, e a identificação de novas classes como a dos transfer RNA-derived Fragments (tRFs). Os pequenos RNAs podem atuar como reguladores negativos da expressão gênica do seu transcrito alvo. Este mecanismo, denominado Silenciamento Gênico Pós-Transcricional (PTGS) ou RNA interferência (RNAi), pode ocorrer pela indução da clivagem do transcrito alvo, ou pela repressão da tradução do mesmo. Em soja, ainda não foram descritos miRNAs atuantes na germinação da semente, os quais foram abordados no primeiro capítulo desta tese. Utilizando duas bibliotecas de sequenciamento de alta eficiência, uma relativa a sementes maduras e outra composta de uma combinação de sementes em germinação (3, 5 e 7 dias), foram identificados um total de 178 microRNAs, sendo 36 inéditos. Dos 178, 8 miRNAs com alvos potencialmente relacionados à germinação da semente, às rotas de auxina, giberelina, metabolismo lipídico, de nitrogênio e homeostase de potencial redox, foram validados por análise de degradoma. O segundo capítulo aborda a caracterização de tRFs em Arabidopsis associados com proteínas Argonauta (AGO), as quais são essenciais ao RNAi. Foram utilizadas 26 bibliotecas de sequenciamento de argonautas imunoprecipitadas (AGO-IP), relativas às AGOs 1, 2, 4, 5, 7 e 9, além de 3 bibliotecas de degradoma. O mapeamento destas sequências nos tRNAs de Arabidopsis revelou que estes pequenos RNAs são majoritariamente associados a AGO1 e 2, sendo a classe 5' de 19 nucleotídeos de comprimento a mais comum. Contudo, estes não obedecem aos critérios de direcionamento a proteínas AGO relativos ao primeiro nucleotídeo do pequeno RNA, como ocorre com miRNAs. Foram identificados quatro transcritos alvos, validados por análise do degradoma, os quais possivelmente sofrem PTGS via tRFs. Ambos os capítulos apresentam uma robusta caracterização in silico de pequenos RNAs em plantas inferindo suas possíveis funções. Contudo, mais experimentos devem ser efetuados para confirmação de seus papeis em soja e Arabidopsis. / The advent of the deep sequencing approach enabled a better characterization of small RNAs, such as microRNAs (miRNAs), the well-known small RNA class, and the identification of new classes like the transfer RNA-derived Fragments (tRFs). The small RNAs can act as negative regulators of gene expression of their target transcript. This mechanism, known as Post Transcriptional Gene Silencing (PTGS), involves dicing of the target transcript, or translational repression. In soybean, the microRNAs acting on seed germination are unknown. These miRNAs were described in the first chapter of this thesis. Using two deep sequencing libraries, relative to the mature seeds and a combination of germinating seeds (3, 5 and 7 days). A total of 178 miRNAs were identified, including 36 new ones. Eight miRNAs had targets potentially related to seed germination including some acting on auxin and gibberellin pathways, lipid and nitrogen metabolism and redox homeostasis, and were validated by degradome analysis. The second chapter showed the characterization of Argonaut (AGO) associated tRFs in Arabidopsis. AGO is an essential protein for PTGS. A total of 26 deep sequencing libraries from immunoprecipitated Argonauts (AGO-IP), relative to the AGO 1, 2, 4, 7, and 9, plus 3 degradome libraries were used. The tRFs were mainly associated with AGO1 and 2, and the 5' class of 19 nucleotides in length was the most common one. However the tRFs did not follow the rule for AGO loading, were the first nucleotide lead the microRNA to a specific AGO. We identified four tRF target transcripts validated by degradome analysis, which possibly undergo the PTGS pathway. Both chapters present a robust in silico characterization of small RNAs in plants, inferring their possible functions. However, more experiments should be performed to confirm their roles in soybean and Arabidopsis.

A soja é um grão rico em proteínas e a sua inclusão na alimentação das pessoas possibilita uma maior fonte de proteína que alimentos comuns como o arroz e o feijão. Entretanto, para possibilitar o armazenamento e transporte sem afetar a qualidade dos grãos, há a necessidade de um processo de secagem que normalmente é otimizado para produção de óleo de soja, e não há preocupação em preservar a parte proteica dos grãos. Tratamentos térmicos aplicados a alimentos, como a secagem, podem modificar a funcionalidade das proteínas. Logo, torna-se necessário estudar as melhores condições da utilização do processo de secagem que possibilitem minimizar a desnaturação proteica dos grãos de soja. Neste estudo foram realizados, inicialmente, experimentos de secagem de grãos de soja variando o tipo de secador, a altura de camada da amostra, assim como a velocidade e a temperatura do ar de secagem, para avaliar o processo em função da redução do teor de umidade. Com os resultados obtidos nestes experimentos, foi avaliado o ajuste de modelos matemáticos retirados da literatura através da análise do percentual do erro médio relativo (EMR) e do coeficiente de determinação (R2) obtidos via regressão nãolinear. Para os dois secadores avaliados (secador piloto e estufa de secagem), o modelo que melhor se ajustou às curvas de secagem obtidas foi o modelo da Aproximação da difusão. A partir dos resultados obtidos nestes experimentos, outros foram realizados para assim avaliar como a secagem influencia na desnaturação proteica dos grãos. Utilizou-se o método de Kjeldahl modificado para quantificar as proteínas totais e dispersáveis dos grãos. Por meio dos resultados obtidos, foi possível observar que a temperatura do ar e o tempo de processo são parâmetros primordiais para o processo. Contudo, a melhor condição de secagem não pode ser determinada sem levar-se em consideração o custo energético e o tempo disponível para o processo. Por exemplo, se houver a possibilidade de utilizar um tempo maior para secar os grãos de soja, a temperatura de 60°C mostrou-se como uma boa opção para manter alto o teor de proteína dispersável, 29 kg de proteína dispersável/100 kg de sólidos secos (s. s.), em 30 minutos de secagem. Caso seja economicamente viável, utilizar ar a 100°C também se mostrou como uma boa opção de secagem, sendo obtidos grãos de soja com aproximadamente 29,5 kg de proteína dispersável/100 kg de s. s. em apenas 6 minutos de secagem. Adicionalmente, foram determinadas experimentalmente isotermas de sorção de umidade para os grãos de soja nas temperaturas de 10 e 25ºC. Modelos de isoterma de sorção de umidade foram selecionados da literatura para ajuste aos dados experimentais obtidos, avaliando-se o percentual do erro médio relativo (EMR), coeficiente de determinação (R2) e valor de chi-quadrado (χ2) como indicadores da qualidade do ajuste. Foi observado que o modelo de GAB obteve o melhor ajuste aos dados obtidos (EMR = 4,1643%, R2 = 0,9937 e χ2 = 1,6684). A partir destes resultados, foi determinado o calor total de sorção, onde foi observado que o mesmo diminuiu com o aumento do teor de umidade de equilíbrio dos grãos, atingindo o valor correspondente ao calor de vaporização da água em um teor de umidade dos grãos de soja de aproximadamente 23% (base seca). Por fim, através dos resultados obtidos, é possível afirmar que a temperatura do ar e o tempo de secagem são parâmetros primordiais para o processo de secagem dos grãos de soja visando a produção de proteínas de soja, não permitindo eleger uma melhor condição de secagem sem levar em consideração o custo energético e o tempo disponível para o processo. / Soybean is a grain rich in proteins and their inclusion in the diet of people provides a greater source of protein than common foods like rice and beans. However, to enable storage and transport without affecting grain quality, there is a need for a drying process which is normally optimized for the production of soybean oil, and there is no concern for preserving the protein content of the grains. Heat treatment applied to foods, such as drying, can modify the functionality of the proteins. Therefore, it becomes necessary to study conditions for the best utilization of the drying process, enabling to minimize protein denaturation of the soybean. This study was conducted initially with soybean drying experiments varying the type of dryer, the height of the sample layer as well as the drying air velocity and temperature, evaluating the process according to the reduction of moisture content. With the results of these experiments, it was evaluated the fit of mathematical models taken from the literature by examining the percentage of mean relative deviation (MRD) and the coefficient of determination (R2) obtained using nonlinear regression. For the two dryers evaluated (pilot-scale dryer and oven), the model that best fitted the drying curves obtained was Approximation of diffusion model. Using the results obtained in these experiments, others were conducted so as to evaluate how drying influences protein denaturation of the grains. It was used a modified Kjeldahl method to quantify the total and dispersible protein content of the grains. From the obtained results, it was observed that the air temperature and the process time are essential parameters for the process. However, the best drying condition cannot be determined without taking into account the energy cost and the time available for the process. For example, if there is the possibility of using a longer time to dry soybeans, the temperature of 60°C proved to be a good choice to maintain a high dispersible protein content, 29 kg of dispersible protein /100 kg dry solids (d. s.) in 30 minutes of drying. If economically feasible, using air at 100°C was also a good option for drying, obtaining soybeans with approximately 29.5 kg of dispersible protein /100 kg d. s. within 6 minutes. Additionally, moisture sorption isotherms for soybeans were experimentally determined in the temperatures of 10 and 25°C. Models of moisture sorption isotherms were selected from the literature to fit the experimental data obtained by assessing the percentage of mean relative deviation (MRD), the coefficient of determination (R2) and chi-square value (χ2) as quality indicators of the fitting. It was observed that the GAB model had the best fit to the data obtained (MRD = 4.1643%, R2 = 0.9937 and χ2 = 1.6684). From these results, it was determined the total heat of sorption, where it was observed to decrease with the increase of the equilibrium moisture content of the beans, reaching the value corresponding to the heat of vaporization of water at a moisture content of approximately 23% (dry basis). Finally, from the results obtained, it can be stated that the air temperature and drying time are vital parameters for the process of drying the soybeans in order to produce soy proteins, not being possible however to elect a best drying condition without taking into account the energy costs and the time available for the process.

O setor agropecuário exerce grande participação no aumento das concentrações de gases de efeito estufa (GEE) na atmosfera. A adoção de sistemas de produção como integração lavoura-pecuária (ILP) pode representar uma importante estratégia mitigadora das emissões desses gases do solo, desde que manejada de forma adequada. Foram realizados dois estudos com o objetivo de avaliar a emissão de GEE de um solo sob sistema ILP e assim contribuir para análise do potencial mitigador de GEE desse sistema. Ambos estudos foram realizados em um Argissolo sob ILP no Sul do Brasil. No estudo I, avaliou-se o efeito de dois métodos de pastoreio (contínuo e rotacionado) e de duas intensidades de pastejo (baixa e moderada) sobre as emissões de óxido nitroso (N2O) e metano (CH4) em um solo sob sistema de integração de ovinos em pastagem de azevém e soja no verão no período de um ano agrícola (2012/2013). No estudo II foi avaliado o efeito da aplicação de doses crescentes de urina de ovinos em pastagem de azevém submetidos à diferentes regimes hídricos (excesso de chuva e chuva normal do período) nas emissões de N2O bem como no fator de emissão (FE) de N2O da urina. No estudo II os teores de carbono orgânico dissolvido (COD), nitrogênio mineral (NH4+ e NO3-) e a porosidade do solo preenchida por água (PPA) foram monitorados durante o período de avaliação. As amostras de gás foram coletadas através do método de câmaras estáticas e analisadas por cromatografia gasosa em ambos estudos. Quanto ao estudo I, o solo sob ILP apresentou menores fluxos de emissão na fase da cultura de verão do que na fase de pastagem do sistema. A menor emissão média acumulada de N-N2O foi observada no tratamento pastejo continuo com intensidade moderada (717,68 g N-N2O ha-1) e a maior, observada no tratamento pastejo rotacionado com intensidade baixa (1020,14 g N-N2O ha-1). No estudo II, a emissão de N2O foi positivamente correlacionada com a (PPA) e teores de COD e amônio (NH4+). O fator médio de emissão de N2O para urina foi de 0,11 ± 0,04 % do N aplicado. O valor para o FE de N2O da urina de ovino encontrado no estudo II é bem inferior ao proposto pelo IPCC (1%). / Agriculture and livestock activities contribute to the increase of greenhouse gases (GHG) in the atmosphere. Alternative production systems, such as crop-livestock integration, may be an important strategy to mitigate soil GHG emissions if properly managed. Two studies were conducted to evaluate soil GHG emissions from crop-livestock integration under different management strategies. Both studies were established on an Oxisoil in Humid Subtropical climate of southern Brazil. In both studies, air samples for GHG flux determination were collected using the static closed chamber method, and analyzed by gas chromatography. The first study determined the effects two grazing systems (continuous and intermittent) and two grazing intensities (low and moderate) on soil nitrous oxide (N2O) and methane (CH4) emissions during one year. Ryegrass (Lolium multiflorum L.) pasture is grazed by sheep during the winter months, while soybean is grown during the summer. The second study quantified soil N2O emissions and N2O emission factor (EF) of sheep urine following the application of different doses of sheep urine under two simulated precipitation condition (historical average and above average) on a ryegrass pasture. Dissolved organic carbon (DOC), and mineral N (ammonium-NH4+ and nitrate-NO3-) soil contents, and water filled pore space (WFPS) were determined at each air sampling event to correlate those soil variables with soil N2O flux. Soil GHG emissions were lower during the summer soybean (Glycine max L.) growing season than during the winter ryegrass pasture season. The first study showed that the lowest accumulated soil N2O emission was observed in the continuous and moderate intensity grazing treatment combination (717.68 g N-N2O ha-1), whereas the intermittent and low intensity grazing treatment combination resulted in greatest accumulated soil N2O emissions (1020.14 g N-N2O ha-1). In the second study, soil N2O flux was positively correlated with WFPS, DOC, and NH4+ soil contents. Averaged across doses, urine EF was 0.11 ± 0.04% of applied N. The urine EF reported in our study is significant smaller than the 1% EF proposed by the Intergovernmental Panel on Climate Change.

O etileno (Et) é um fitormônio importante na chamada resposta tripla em plântulas, compreendendo a inibição do alongamento caulinar, o espessamento do caule e o hábito de crescimento horizontal (perda da sensibilidade gravitrópica), além de participar na indução da abscisão foliar e na resposta à estresse. Estudos sobre a resposta da soja aos mais diversos tipos de estresse têm emergido dentre a comunidade científica brasileira, uma vez que esta cultura é de grande importância econômica ao país. Tendo em vista o papel descrito das respostas desencadeadas por etileno em diversas espécies vegetais, este trabalho descreveu in silico a rota de biossíntese deste fitormônio e da sinalização por ele mediada em soja, utilizando recursos disponibilizados por banco de dados públicos e pelo Projeto GENOSOJA (Consórcio Brasileiro do Genoma da Soja), que disponibilizou dados moleculares relacionados à genômica, transcriptômica e proteômica desta leguminosa sob diversas condições de estresse. Com auxílio de ferramentas de bioinformática foram identificados 502 genes em soja, divididos em três grupos: (i) biossíntese de etileno, (ii) transdução de sinal por ele mediada e (iii) fatores de transcrição da superfamília AP2/ER. Análises posteriores possibilitaram a avaliação da possível ortologia das proteínas de soja identificadas por experimentos in silico de BBH (Best Bidirectional Hit), mostrando uma maior proximidade filogenética com Arabidopsis thaliana. A associação destes dados propiciou a elaboração de modelos in silico da biossíntese de etileno e da sinalização por ele mediada em soja, onde foram identificados elementos conservados principalmente com A. thaliana. Além disso, a análise do banco de dados fornecido pelo Projeto GENOSOJA possibilitou identificar em transcriptomas de raízes e folhas de cultivares de soja cultivadas em sistema hidropônico e submetidas à déficit hídrico a expressão diferencial de cerca de 24,00 % dos genes caracterizados. A regulação transcricional destes genes foi estudada pela análise de seus possíveis promotores, onde foram identificadas in silico 29 famílias de elementos cis-atuantes importantes na regulação mediada por etileno e em possíveis interconecções com a sinalização mediada por outros fitormônios, como ácido jasmônico, ácido abscísico, auxinas e brassinoesteróides. Estes dados, associados com a avaliação dos níveis de ACC livre e produção de etileno, possibilitaram melhor compreensão em nível molecular da importância deste fitormônio em soja nas condições analisadas e a sua possível participação em respostas desta commodity à seca. / The ethylene (Et) is the phytohormone known for the seedlings triple response, comprising the inhibition of shoot elongation, the stem thickness and the habit of horizontal growth (loss of gravitropic sensitivity). Ethylene also participates in the induction of leaf abscission and in response to stress. Studies about soybean response to various types of stress have emerged among the Brazilian scientific community since this crop is extremely relevant to the country. Considering the described role triggered by ethylene responses in several plant species, this work described in silico the biosynthesis and signaling pathways mediated by this gas in soybean, using resources provided by public databases and GENOSOJA (Brazilian Soybean Genome Consortium) project. The study expanded the molecular data related to genomics, transcriptomics and proteomics known of this plant under several stress conditions. With the aid of bioinformatics tools, we identified 502 genes in soybean, divided into three groups: (i) ethylene biosynthesis, (ii) signal transduction mediated by this gas, and (iii) AP2/ERF transcriptional factors superfamily. Subsequent analyzes of BBH (Best Bidirectional Hit) experiments enabled the evaluation of the possible protein orthology encoded by these genes, showing phylogenetic proximity with Arabidopsis thaliana. The combination of these data propitiated the development of soybean ethylene biosynthesis and signaling in silico models, which were identified preserved elements mainly with A. thaliana. Furthermore, GENOSOJA database analysis allowed to identify the differential expression of 24, 00% of these genes in soybean transcriptomes, as the crop was initially grown in hydroponic system and then submitted to water deficit. In addition, the transcriptional regulation of these genes was studied by analyzing its putative promoters, in which were identified, in silico, 29 families of cis-acting elements. These elements are important for ethylene-mediated regulation and its possible interconnections with other signaling pathways mediated by other plant hormones, such as jasmonic acid, abscisic acid, auxin and brassinosteroids. Thereby, this study, combined with assessing the abundance of free ACC and ethylene production, allowed a better understanding of ethylene importance at a molecular level in this crop, and its possible participation in responses to drought.

Urease (EC 3.5.1.5) é uma metaloenzima dependente de níquel que catalisa a hidrólise da ureia à amônia e dióxido de carbono. A Soja (Glycine max) produz duas isoformas de urease: a urease ubíqua (uSBU) e a urease embrião-específica (eSBU). Nosso grupo demonstrou que eSBU apresenta propriedades biológicas independentes da sua atividade ureolítica, como ativação de plaquetas, atividade inseticida e inibição do crescimento de fungos fitopatogênicos, estes últimos sugestivos de envolvimento das SBUs em mecanismos de defesa da planta. Outras ureases também estudadas pelo nosso grupo, são as de Feijão-de-porco (Canavalia ensiformis). O Feijão-de-porco produz três isoformas de urease: Canatoxina, JBU e JBURE-II, que também apresentam atividades biológicas, não relacionadas à sua atividade enzimática. Dentre elas, a atividade inseticida tem sido a mais estudada. A toxicidade das ureases a insetos envolve a liberação de um peptídeo interno tóxico, mediante à hidrólise por enzimas digestivas do inseto. Um peptídeo equivalente foi clonado em Escherichia coli e denominado Jaburetox. Este peptídeo apresenta um amplo espectro de ação contra insetos e toxicidade contra fungos. Nossos objetivos nessa tese foram estudar: 1) as propriedades biológicas da urease ubíqua de soja, fusionada à Glutationa S-Transferase (GST-uSBU), e 2) as propriedades estruturais do peptídeo Jaburetox. No capítulo 1 mostramos que a GST-uSBU é tóxica contra fungos filamentosos, interferindo no metabolismo secundário fúngico e na produção de pigmentos, e também foi tóxica a leveduras, induzindo mudanças morfológicas. A proteína de fusão apresentou ainda atividade inseticida e induziu agregação de plaquetas de coelho e de hemócitos de insetos. Os dados sugerem que GST-uSBU serve de modelo para o estudos futuros de propriedades biológicas de ureases de plantas. No captítulo 2, o peptídeo Jaburetox foi estabilizado em sua forma monomérica, com a utilização do agente redutor TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina). O Jaburetox apresentou elevado raio hidrodinâmico, característico de uma proteína intrinsicamente desordenada. Estes dados foram confirmados através de análises de Dicroísmo Circular, de preditores de desordem (PONDR) e por Ressonância Magnética Nuclear. A estrutura do peptídeo em solução foi elucidada, apresentando um motivo α-hélice na região N-terminal e duas estruturas do tipo volta, uma na região central e outra próxima da região C-terminal do peptídeo. O conhecimento da estrutura tridimensional do peptídeo será de grande importância para o entendimento do mecanismo de ação inseticida e fungitóxico do Jaburetox. / Urease (EC 3.5.1.5) is a nickel-dependent metalloenzyme that catalyzes the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide. Soybean (Glycine max) produces two urease isoforms: ubiquitous urease (uSBU) and the embryo-specific urease (eSBU). Our group demonstrated that eSBU displays biological properties independent of its ureolytic activity, such as platelets activation, insecticidal activity and inhibition of phytopathogenic fungi growth. These data suggested that soybean ureases could be involved in plant defense. Other ureases also studied by our group are jack bean (Canavalia ensiformis) ureases. Jack bean produces three isoforms of ureases, Canatoxin, JBU and JBURE-II, which also have biological properties unrelated to enzymatic activity. Among them, the insecticidal activity has been the most studied. The toxicity of ureases against insects involves hydrolysis by insect digestive enzymes and the release of a toxic internal peptide. An equivalent peptide was cloned in Escherichia coli and called Jaburetox. This peptide presents a broad spectrum of activity against insects and is also fungitoxic. In this thesis, our objectives were to study: 1) the biological properties of the soybean ubiquitous urease fused to Glutathione S- Transferase (GST-uSBU), and 2) the structural properties of the peptide Jaburetox. In chapter 1, we show that GST-uSBU is toxic against filamentous fungi, interfering on the fungal secondary metabolism, in the pigments production, and also affected yeasts, inducing morphological changes. GST-uSBU also displayed insecticidal activity and induced aggregation of rabbit platelets and insect hemocytes. Thus, this fusion protein could serve as model for future studies related to biological properties on plant ureases. In chapter 2, the peptide Jaburetox was stabilized in its monomeric form by using the reducing agent TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine). Jaburetox showed a large hydrodynamic radius, which is characteristic of an intrinsically disordered protein. These data were confirmed by Circular Dichroism analysis, disorder predictors (PONDR) and Nuclear Magnetic Resonance. The structure of the peptide in solution was elucidated, showing a α-helix motif in the N-terminal region and two turn-like structures, one located in the central region and another near the C-terminal of the peptide. The knowledge of Jaburetox’s three-dimensional structure is an important step towards the understanding of its insectidal and fungitoxic mode of action.