Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont greffées à des patients dont le système immunitaire est affaibli ou déficient, afin de reconstituer leur système hématopoïétique. En raison de leurs nombreux avantages, les CSH provenant du sang de cordon ombilical sont de plus en plus utilisées. Cette hausse de la demande a mené à l’implantation de plusieurs banques publiques, dont celle d’Héma-Québec, opérant selon les lignes directrices d’organismes réglementaires. Malgré la standardisation des protocoles de mise en banque, certains paramètres ne sont pas règlementés, telle la température d’entreposage des sangs de cordon avant leur cryopréservation. À Héma-Québec, le transport et la conservation des prélèvements avant la mise en banque sont faits à température pièce (TP) en respectant un délai maximal de 48 heures entre le moment du prélèvement et celui de la mise en banque. De récents travaux rapportés dans la littérature ont montré que les CSH provenant de sang de cordon conservé à TP pendant une période de 72 heures avant la mise en banque perdaient complètement leur capacité de reconstitution hématopoïétique alors que celle-ci était préservée si la conservation était faite à 4°C. Nous avons donc entrepris la présente étude afin de déterminer l’impact de l’entreposage à 4oC ou TP allant jusqu’à 48 heures sur plusieurs paramètres fonctionnels des CSH de sang de cordon ombilical, soit la viabilité, la capacité à se différencier et le potentiel de reconstitution hématopoïétique à l’aide d’un modèle animal de greffe. Les essais de différenciation ont permis de prédire les résultats des greffes, et ces derniers ont mis en évidence une grande variabilité entre les différents sangs de cordon. À ce stade, l’impact de la température d’entreposage avant la mise en banque sur le potentiel de reconstitution hématopoïétique des CSH n’est pas encore déterminé et des travaux supplémentaires devront être effectués. / Umbilical cord blood (UCB) has been proven to be an important alternative source of hematopoietic stem cells (HSCs) mostly for pediatric patients suffering from hematologic disorders. Because of its many advantages over other sources of HSCs, such as ease of collection, less stringent HLA restrictions and lower risks of developing GVHD, the use of UCB has expanded in recent years and led to a growing number of public cord blood banks (CBB) that operate under guidelines established by the regulatory organisms such as Netcord FACT, AABB or FDA. Despite the standardization of CBB procedures, some parameters remain unregulated, such as the pre-processing storage temperature. At Héma-Québec Public CBB, the units are kept at room temperature (RT) before being processed and cryopreserved within 48 hours after collection. Recently, a study using a mouse model of engraftment revealed that a pre-processing storage of 72 hours at room temperature might have deleterious effects on the HSC reconstitution capacity. The aim of our study was to evaluate the impact of pre-processing storage temperature on HSCs, by evaluating their viability, differentiation capacity and in vivo hematopoietic reconstitution in a mouse engraftment model. Results show that hematopoietic reconstitution potential measured in NSG mice differed for each of CBUs tested and that, in contrast to the previously published study, the in vivo reconstitution could be predicted by CFU assays. At this stage, the impact of preprocessing temperature on HSCs has not been confirmed, and to do so will require additional experiments.

L’hémine humaine, connue commercialement sous l’appellation Normosang® ou Panhematin® est un produit utilisé comme agent thérapeutique pour le traitement des attaques aigües de porphyrie, maladie génétique affectant la biosynthèse de l’hème. Récemment, le traitement d’une patiente atteinte d’anémie hémolytique auto-immune sévère et de réticulocytopénie a été pris en charge par un médecin hématologue d’Héma-Québec. Le traitement de cette patiente au Normosang® a entre autres contribué à l’augmentation de son nombre d’érythrocytes et a contribué au rétablissement de son état de santé. Nous avons ainsi entrepris ce projet dans le but d’évaluer les effets de l’hémine sur l’expansion et la différenciation des cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon dans un milieu de culture favorisant la différenciation érythroïde. Le suivi de l’expansion montre que l’hémine semble avoir un effet positif sur la croissance des cellules lors de leur différenciation érythroïde. Les résultats montrent que l’hémine semble aussi avoir un effet sur les précurseurs érythroïdes engagés dans ’érythropoïèse. L’analyse de la différenciation montre que l’hémine semble stimuler la différenciation érythroïde, ainsi que l’énucléation. L’approfondissement de ces connaissances pourrait ultimement permettre d’élargir le spectre d’application clinique du Normosang®. / Human hemin, commercialized as Normosang® or Panhematin®, is a therapeutic agent approved for the treatment of acute attacks of porphyria, a genetic disease causing a malfunction of the heme biosynthesis pathway. Recently, the treatment of a patient with severe autoimmune hemolytic anemia and reticulocytopenia was managed by a hematologist from Héma-Québec. The treatment of this patient with Normosang® has, among other things, contributed to the increasing erythrocyte levels and contributed to the complete recovery of this patient. The aim of this project was to evaluate the effects of hemin on the expansion and differentiation of hematopoietic cord blood stem cells in a culture media favoring erythroid differentiation. Results show that hemin has a positive effect on cell growth during their erythroid differentiation. The results show that hemin also appears to have an effect on erythroid precursors. Differentiation analysis points to a possible role for hemin in the stimulation of erythroid differentiation as well as enucleation. More knowledge on the subject could ultimately support a larger spectrum of clinical applications.

Titre de l'écran-titre (visionné le 29 juin 2023) / Les techniques d'édition du génome telles que CRISPR-Cas9, permettant l'introduction ciblée de modifications génétiques, offrent de nombreuses possibilités de développement d'outils de recherche ainsi que d'applications thérapeutiques. Dans le cadre de mes travaux effectués en co-direction à Héma-Québec, je me suis intéressée au potentiel de CRISPR-Cas9 en lien avec le système hématopoïétique et plus particulièrement en lien avec les globules rouges. Premièrement, j'ai exploré dans le chapitre 1 la modification spécifique de groupe sanguins qui est d'intérêt pour augmenter les possibilités transfusionnelles. Des globules rouges (GRs) de groupe sanguin rare Rhnull ont été créés en supprimant le gène RHAG des cellules souches hématopoïétiques (CSH) avec CRISPR-Cas9, suivi d'une différentiation érythrocytaire in vitro. Ce groupe sanguin pourrait théoriquement être utilisé pour transfuser des individus ayant n'importe quel variant Rh, en plus d'être utile en tant que réactif de sérologie. Le gène ABO a aussi été supprimé des CSH de groupe A, pour produire des GRs de groupe O. L'absence d'expression résiduelle des antigènes de type A obtenue à partir des CSH hétérozygotes A/O pourrait permettre de futures applications transfusionnelles comme des cas de donneur/receveur compatibles pour des phénotypes rares mais incompatibles pour le système ABO. Ensuite, un aspect prometteur du système CRISPR-Cas9 étant la correction thérapeutique de maladies génétiques, les greffes autologues de CSH génétiquement modifiées par cette technologie font l'objet de plus en plus d'études cliniques. Dans ce contexte, j'ai travaillé sur la modélisation in vitro de variants génétiques avec comme preuve de concept l'anémie falciforme puisque cela pourrait contribuer à l'étude des répercussions potentielles de l'édition du génome sur les CSH et les GRs, et complémenter les études cliniques. Une récapitulation complète de l'érythropoïèse in vitro jusqu'à la production de GRs matures a été considérée pertinente pour une caractérisation plus fidèle à la réalité de phénotypes érythrocytaires, pour étudier l'impact de divers variants sur les GRs, en plus d'être avantageuse dans l'optique de futures transfusions. La production de GRs in vitro est un objectif important en médecine transfusionnelle depuis plusieurs années et il est possible de reproduire l'érythropoïèse in vitro à partir de plusieurs sources cellulaires, dont les CSH. Cependant, les protocoles publiés à ce jour mettent peu l'accent sur l'étape de maturation finale des réticulocytes en GRs matures, analogues à ceux retrouvés en circulation, ou requièrent l'utilisation de cellules accessoires ou nourricières. Or, l'utilisation de cellules accessoires ou nourricières pourrait restreindre de potentielles applications pertinentes du modèle comme les transfusions et l'édition génétique ex vivo. Dans un premier temps, j'ai développé dans le chapitre 2 un protocole de culture cellulaire permettant une maturation accrue des réticulocytes en GRs in vitro ainsi qu'une maximisation de leur survie en culture durant cette étape, dans un milieu ne contenant aucun composé animal, cellules accessoires ou cellules nourricières. Les GRs obtenus ont un phénotype similaire à celui des GRs produits par le corps humain et ils peuvent être conservés en solution nutritive pendant 42 jours comme pour les GRs récoltés de dons de sang. Dans un second temps, j'ai optimisé dans le chapitre 3 un protocole d'édition avec CRISPR-Cas9 compatible avec la clinique, sans vecteur viral et sans sélection, dans le but d'être combiné à la production de GRs. L'introduction à une fréquence élevée de la mutation causant l'anémie falciforme, notamment de manière bi-allélique, dans des CSH suivie de la différenciation complète en GRs a permis de générer des GRs adoptant la forme caractéristique en faucille après exposition à des niveaux d'oxygène physiologiques, récapitulant ainsi l'anémie falciforme in vitro. De plus, un sous-produit d'édition produisant un variant de globine beta qui semble exprimé à des niveaux significatifs dans les GRs est présent à la suite du ciblage de la mutation dans le gène de la globine beta. La présence de ce variant mérite attention dans l'optique du développement thérapeutique pour l'anémie falciforme. En conclusion, les procédures optimisées de culture de GRs et de modifications génétiques avec CRISPR-Cas9 présentées dans cette thèse peuvent être combinées de différentes façons afin de fournir une plateforme d'étude de variants érythrocytaires in vitro, en plus de contribuer aux efforts vers la transfusion de GRs produits in vitro et d'accompagner les thérapies d'édition génétique arrivant en clinique. / Genome editing techniques, such as CRISPR-Cas9, allowing the introduction of targeted genetic modifications, offer numerous research tool possibilities and potential cellular therapies. As part of my work done in co-direction at Héma-Québec, I became interested in the potential of CRISPR-Cas9 in relation to the hematopoietic system and more particularly in relation to red blood cells. First, I explored in chapter 1 specific blood type modifications that are of interest in increasing transfusion opportunities. Rhnull cultured red blood cells (cRBCs) were produced by deleting RHAG gene in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with CRISPR-Cas9, followed by in vitro erythroid differentiation. These red blood cells (RBCs) could theoretically be used to transfuse all Rh types, in addition to their relevance as RBC reagents for serology laboratories. ABO gene was also deleted in type A HSPCs to produce type O RBCs. The absence of residual A antigen expression when starting with heterozygotes A/O donors could allow future transfusion applications like cases of individuals compatible for rare phenotypes but frustratingly not for ABO. Then, a promising aspect of the CRISPR-Cas9 system being the therapeutic correction of genetic diseases, autologous hematopoietic stem cell (HSC) transplants genetically modified by this technology are the subject of more and more clinical studies. In this context, I worked on the in vitro modeling of genetic variants with sickle cell anemia (SCA) as proof of concept since it could contribute to the efforts aiming at studying and understanding potential side effects of genome editing on HSCs and RBCs, and complement clinical studies. The complete recapitulation of erythropoiesis in vitro, including terminal RBC maturation, was considered essential for the faithful characterization of erythroid phenotypes, for studying the impact of genetic variants on RBCs, in addition to being beneficial for future transfusion purposes. Production of cRBCs has been a major objective in the field of transfusion medicine for several years and erythropoiesis can be reproduced in vitro starting with several cell sources, one of which being HSPCs. However, current protocols do not focus on the process of reticulocyte maturation into RBCs, analogous to those found in the circulation, or they require accessory or feeder cells. Of note, accessory or feeder cells could restrict potentially relevant applications of the model like transfusions or ex vivo genome editing. First, I developed in chapter 2 a cell culture protocol allowing an increased maturation of reticulocytes into RBCs in vitro as well as a maximization of their survival in culture, using an animal component-free, accessory-free, and feeder-free medium. The resulting cRBCs had a similar phenotype as native RBCs and they could be stored for 42 days like RBCs collected from blood donations. Second, I optimized a virus-free and selection-free CRISPR-Cas9 strategy compatible with the clinic to use it in combination with cRBCs production. High efficiency introduction of the SCA-causing mutation, notably bi-allelic introduction, followed by mature cRBCs production yielded cells acquiring the characteristic sickled shape after exposition to physiological oxygen levels, thereby recapitulating SCA in vitro. Furthermore, an editing by-product giving rise to a beta globin variant seemingly expressed at significant levels in RBCs was present following the targeting of the mutation in the beta globin gene. The presence of this beta globin variant thus deserves further attention in the context of therapeutic development for SCA. To conclude, optimized procedures of RBCs' culture and CRISPR-Cas9-mediated genome editing presented in this thesis can be combined in several ways to provide a platform for the study of erythroid variants in vitro, in addition to contributing to the efforts towards future cRBCs transfusion and accompanying the coming gene editing therapies.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’obtention d’un nombre élevé de cellules souches hématopoïétiques (CSH) représente un enjeu majeur pour le développement de protocoles de thérapies cellulaires d’hémopathies ou de tumeurs solides. L’expansion ex vivo de ces cellules met en jeu différents acteurs (cytokiniques, environnementaux) et notamment les basses concentrations d’oxygène (O2), qui reflètent des conditions physiologiques retrouvées au sein de structures spécifiques de la moelle osseuse où résident les CSH et auxquelles notre équipe s’intéresse depuis plusieurs années. Les effets bénéfiques de ces basses concentrations d’O2 sur le maintien des CSH sont actuellement bien établis lors de courtes cultures de cellules de moelle osseuse, de sang placentaire ou mobilisées dans le sang. Nous avons cherché à confirmer et à étendre ces résultats à des cellules peu étudiées, les cellules souches de sang périphérique en situation d’homéostasie (CSSP-H). Ces cellules représentent en effet une source possible de CSH à usage thérapeutique, du fait de leur disponibilité et de leur facilité d’accès. Nos travaux ont permis d’établir et d’optimiser un protocole, rapide et simple, de purification de cellules CD34+ à partir de filtres de leucoréduction (LRF). La quantité et la pureté de ces cellules adaptées à la poursuite de nos travaux, ainsi que leur validation fonctionnelle, nous ont permis de les utiliser comme modèle pour l’étude des effets de cultures de 7 jours très faiblement oxygénées (0,1% d’O2). La détermination de combinaisons cytokiniques assurant le maintien et l’expansion des cellules primitives a révélé un rôle bénéfique de l’IL-3 et du SCF couplé à la TPO. Ces conditions de culture ont permis de révéler, comparativement à des cultures réalisées à 20% d’O2, le rôle majeur des faibles concentrations d’O2 dans le maintien de cellules quiescentes, indifférenciées, ne se divisant pas ou très peu et capables de reconstituer une hématopoïèse, suite à leur injection dans des souris NOG. Les mécanismes moléculaires et métaboliques intervenant dans ces processus restent, cependant, encore à établir. / Obtaining a high number of hematopoietic stem cells (HSCs) is a major challenge for developing cell therapies for blood diseases. Ex vivo expansion of HSCs involves various factors (cytokines, environment), including low oxygen (O2) concentrations, that reflect the physiological conditions found in specific structures of the bone marrow where HSCs reside. Our team is interested with the study of these low O2 levels for several years and their beneficial effects are currently well established during short-term cultures of cells from bone marrow, cord blood or mobilized in the blood. We sought to confirm and extend these results to poorly studied cells: stem cells from steady state peripheral blood (SSPB). Indeed, these cells represent a possible HSCs source devoted to the therapeutic use, because of their availability and their easy access. Our work has led to the establishment and the optimisation of a procedure, rapid and easy to set up, for CD34+ cells purification from leukoreduction filters (LRFs). The cell quantities and purities, adapted to our further work, together with their functional validation, led us to use these cells as a model for 7-days in vitro cultures performed at very low O2 concentration (0.1%). Cytokine combination assays, allowing the maintenance and the expansion of primitive cells, have revealed a beneficial influence of IL-3 or SCF + TPO additions. These cultures have revealed, comparatively to those performed at 20% O2, a major role of the very low O2 concentrations in the maintenance of quiescent and undifferentiated cells, showing an un- or low-cycling status and able to reconstitute hematopoiesis, consecutively to their injection into NOG mice. However, the molecular and metabolic mechanisms involved in these processes remain unknown.

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont à l’origine de l’ensemble des cellules hématopoïétiques, mais les mécanismes responsables de leurs réponses au stress ne sont que partiellement compris. J’ai étudié le rôle du facteur de transcription Helios dans les CSH, dans lesquelles il est fortement exprimé. J’ai trouvé que les CSH de souris nulles pour Helios (He-/-) possèdent un plus fort potentiel de reconstitution que les CSH WT dans des expériences de transplantations en série. De manière frappante, les souris âgées de 2 ans possèdent 8 fois plus de CSH fonctionnelles par rapport aux souris vieilles WT. De plus, le pool de CSH de long terme de souris He-/- vieilles ressemblent aux CSH WT jeunes en termes de phénotype et de fréquences. Les CSH He-/- vieilles présentent une dérégulation de gènes impliqués dans le vieillissement. De plus,les CSH He-/- jeunes sous-expriment des gènes codant des protéines impliquées dans la réparationde l’ADN ainsi que dans la voie p53. Quand les CSH He-/- et WT sont traitées avec différents agents radiomimétiques qui induisent des cassures simple et double brins à l’ADN, tels que la néocarzinostatine, la camptothécine ou l’étoposide, l’entrée en apoptose, en sénescence et l’arrêt de la prolifération des CSH He-/- sont altérées. Ce phénotype est accompagné d’une faible induction des gènes cibles de p53 et d’une altération du dégagement des foyers gammaH2AX. De plus, j’ai montré que Helios agit en synergie avec p53 pour réguler les réponses aux dommages à l’ADN des CSH. Mes résultats suggèrent qu’en synergie avec p53, Helios contrôle le vieillissement des CSH en prévenant l’accumulation des dommages de l’ADN des CSH. / Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood cell lineages but the mechanisms responsible of HSCs responses to stress remain partially understood. I studied the role of the transcription factor Helios in HSCs, where Helios is highly and specifically expressed. I found that HSCs from young Helios null mice (He-/-) reconstitute the hematopoietic system of irradiated recipient mice similarly to HSCs from WT mice in primary transplantations, but out-perform WT cells in secondary and tertiary transplantations. Strikingly, HSCs from 2-year-old He-/- mice had 8-fold higher reconstitution potential than old WT HSCs in primary transplantations. Moreover, the pool of long-term HSCs in old He-/- mice resembles that of young WT animals in both phenotype and frequency. HSCs from old He-/- mice present a down regulation of genes involved in aging. Further, young He-/- HSCs express reduced mRNA levels of genes encoding DNA repair proteins as well as those associated with thep53 pathway. When He-/- and WT HSCs were subjected to DNA damage by different agents like neocarzinostatin, camptothecin, or etoposide, DNA damage-induced apoptosis, senescence and cell cycle arrest were significantly impaired in He-/- HSCs. This phenotype was accompanied by a poor induction of p53 target genes and impaired clearance of gammaH2AX foci. Furthermore, I found that Helios synergies with p53 to regulate the DNA damage responses of HSCs. My results suggest that,in synergy with p53, Helios controls HSC aging by preventing the accumulation of DNA damage in these cells.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les Cellules Souches Hématopoïétiques sont à l’origine de la production de toutes les cellules sanguines et immunitaires, grâce à leur double capacité à s’auto-renouveler et se différencier en progéniteurs puis en cellules matures fonctionnelles. Du fait de leur importance, leur physiologie est contrôlée par de nombreux signaux qui assurent un équilibre entre quiescence, prolifération, auto-renouvellement et différenciation. Mes travaux s’intéressent au rôle du facteur de transcription PLZF dans la régulation des CSH grâce à l’utilisation du modèle murin Zbtb16lu/lu, qui porte une mutation spontanée inactivant PLZF. En cas de stress régénératif, les souris Zbtb16lu/lu présentent des défauts de reconstitution de l’hématopoïèse caractérisés par un biais myéloïde, une forte expansion des LT-HSC et des dérégulations du cycle cellulaire, un phénotype similaire au vieillissement physiologique des CSH. De plus, lors d'expositions répétées au Lipopolysaccharide, un composant des bactéries à Gram négatif, les souris Zbtb16lu/lu montent une réponse pro-inflammatoire excessive qui induit un remodelage du compartiment CSH, ce qui suggère qu’elles ne parviennent pas à mettre en place de tolérance au LPS. Ainsi, nos résultats semblent positionner PLZF comme un régulateur central du destin des CSH. / Hematopoietic stem cells (HSCs) are responsible for the production of all blood cells and possess the dual ability to self-renew and differentiate into progenitor and into mature cells. Given their importance, their physiology is tightly controlled by a plethora of signals that balance quiescence, proliferation, self-renewal and differentiation. In the present Phd work, I focused on the role of the transcription factor PLZF in HSC fate using the Zbtb16lu/lu mouse model, harbouring a spontaneous mutation inactivating PLZF. In a context of regenerative stress, Zbtb16lu/lu mice showed a decreased repopulation capacity characterized by a myeloid bias, expansion of LT-HSC and cell cycle dysregulation, features that seem to recapitulate HSC physiological aging. Furthermore, repeated injections of LPS, a component of Gram Negative bacteria, induced a strong pro-inflammatory response in Zbtb16lu/lu mice, that resulted in the reshaping of the HSC compartment and the failure to induce endotoxin tolerance. Taken together, our results suggest that PLZF is a central regulator of HSC fate.

Des mises au point de nouvelles stratégies d’expansion ex vivo des cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont développées depuis quelques années afin de pallier le problème du faible nombre de ces cellules pour le traitement des hémopathies ou de certaines tumeurs solides. Notre équipe avait établi un modèle d’expansion des CSH via leur exposition aux homéoprotéines HOXB4 ou HOXC4. L’étude comparative des transcriptomes de ces cellules a permis l’identification de cibles précoces des facteurs HOXB4/C4 parmi lesquels les gènes codant les régulateurs post-transcriptionnels Pumilio (de la famille PUF). Les facteurs PUF sont impliqués en particulier dans le maintien des cellules souches germinales dans différents modèles animaux, chez les vertébrés ou les invertébrés. Cependant, le rôle des facteurs PUF humains (hPum1 et hPum2) dans les cellules hématopoïétiques humaines n’avait jamais été étudié.Mon travail de thèse exposé ici a consisté, d’une part, en l’étude du profil d’expression des facteurs hPum1 et hPum2 dans différentes lignées hématopoïétiques et au cours de l’hématopoïèse humaine, démontrant une expression plus importante de ces gènes dans les cellules les plus immatures ainsi que dans les progéniteurs dont la prolifération est activée. D’autre part, l’étude fonctionnelle des facteurs hPum1 et hPum2 a mis en évidence leur implication dans l’expansion et la survie des cellules CD34+. L’inhibition spécifique de hPum1 ou de hPum2 in vitro par des shARN, induit une diminution significative du nombre absolu des cellules ainsi qu’une augmentation de leur apoptose. Cela corrèle avec une accumulation des CSH en phase G0-G1 du cycle cellulaire. Par ailleurs, la répression de l’expression de hPum1 ou de hPum2 diminue la reconstitution de l’hématopoïèse in vivo dans des souris immunodéficientes NOD-SCID-γC-/-. L’analyse des ARNm cibles des facteurs Pum par une étude comparative des transcriptomes des CSH transduites ou non par des vecteurs lentiviraux contenant des shARN hPum1 ou hPum2, a permis l’identification de nombreux gènes impliqués dans le contrôle de la croissance, de la survie ou du cycle cellulaire. L’ensemble de nos résultats montre l’indispensable implication des facteurs Pumilio dans le maintien de l’état souche, la prolifération et la survie des CSH humaines. Nous avons démarré des études fonctionnelles dans les cellules leucémiques myéloïdes primaires afin d’évaluer le rôle éventuel des facteurs Pumilio dans la leucémogenèse. Ultérieurement, la caractérisation de hPum1 et hPum2 comme de nouvelles molécules impliquées dans l’expansion des CSH permettra d’envisager leur étude dans la perspective de nouvelles stratégies thérapeutiques. / Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells (HSCs) could improve new therapeutic strategies for the treatment of hematopoietic malignancies and solid tumors. Our team had developed an original method to expand human HSCs, consisting in the transfer into these cells of active HOXB4 or HOXC4 homeoproteins. The comparative transcriptomic analysis of CD34+ cells exposed or not to HOXB4 or HOXC4 proteins induced over-expression of Pumilio (PUF) genes. PUF proteins are post-transcriptional regulators of gene expression. They are involved in different biological functions among which the maintenance of stem cells. However, the function of human PUF factors (hPum1 and hPum2) in hematopoietic stem cells has never been investigated. The work that I developed during my thesis first consisted in analyzing the expression of PUF factors in different hematopoietic cell lines and during human hematopoiesis. The results highlighted a high expression of the hPum1 en hPum2 genes in the most immature cells and in the proliferating active progenitors. The study of human PUF factors by inducing their inhibition using specific shRNAs revealed their involvement in proliferation and survival of CD34+ cells. In vitro, inhibition of hPum1 or hPum2 decreases the expansion of human HSCs and increases cell apoptosis. The hPum1 or hPum2 repression also increases the number of HSCs in G0-G1 phase of the cell cycle. Moreover, the inhibition of hPum1 or hPum2 reduces the capacity of human HSCs to reconstitute in vivo hematopoiesis of immunodeficient NOD-SCID-γC-/- mice. The identification of PUF target mRNAs by a comparative transcriptomic analysis of human HSCs infected or not with lentiviral vectors containing hPum1/2 shRNAs, revealed a large number of genes involved in the regulation of cell growth, survival or cell cycle. On the whole, our results demonstrate the involvement of Pumilio factors in stemness maintenance, expansion and survival of human HSCs. Functional studies in primary myeloid leukemic cells are in progress to assess the potential role of the Pum factors in the leukemogenic process. Later on, identification of Pumilio factors as new regulators of HSCs expansion will allow consider them as new tools for therapeutic perspectives.