Parmi les nouvelles stratégies thérapeutiques, la thérapie génique contre le VIH connaît actuellement un regain d'intérêt. La description du premier cas de guérison avéré après greffe de cellules souches mutantes pour le corécepteur majeur du VIH (CCR5) a relancé l'intérêt de la communauté pour développer des stratégies de thérapies géniques ciblant CCR5. Durant ma thèse, j'ai développé une stratégie basée sur l'inhibition de l'entrée du virus dans les lymphocytes T CD4 humains. Nos gènes thérapeutiques comprennent un inhibiteur de fusion membranaire (peptide C46) et un inhibiteur d'expression de CCR5. L'expertise de l'équipe dans les modèles de souris humanisées m'a permis de valider l'intérêt pré-clinique de cette stratégie dans un modèle de transfert de lymphocytes T modifiés. J'ai pu montrer que les lymphocytes T modifiés possédaient un avantage sélectif massif in vivo comparé à des cellules non protégées, ainsi qu’une protection totale contre la délétion induite par le VIH. De plus, dans une autre étude, j'ai montré que la dynamique virale dans les modèles de souris humanisées par transfert de CSH est plus proche des patients. Cette étude nous montre qu'il n'est pas nécessaire d'invoquer la réponse immune, pour expliquer les profils de réplication virale observés dans la phase primaire de l'infection. Ce résultat suggère donc qu'une partie de la dynamique virale est dépendante du nombre de cellules à infecter et du nombre de virions disponibles. L'ensemble des résultats de ma thèse a permis (i) de faire progresser notre compréhension de la dynamique virale, et (ii) de valider la combinaison d'inhibiteurs d'entrée dans un vecteur lentiviral. / Among new therapeutic strategies to fight the infection, gene therapy targeting CCR5 will be an asset. Indeed, the first patient to be cured from the infection received hematopoietic progenitors deprived of CCR5. This finding has ignited a flurry of research on genetic means to decrease CCR5 from the cell surface.During my PhD, I developed a gene therapy strategy based on entry inhibition of HIV in CD4 T cells. Our therapeutic genes are a membrane fusion inhibitor (the C46 peptide) and a CCR5 expression inhibitor, based on a super-agonist ligand. The experience of the team in humanized mice models allowed the validation of the strategy in vivo in a model of gene-modified T cell transfer. I first showed that the combination of the transgenes was able to prevent HIV infection in vitro in a dose dependent manner. Most importantly, I then showed that this protection conferred modified T cells with a huge selective advantage in vivo. This advantage was associated with a complete protection of CD4 T cells from HIV-induced deletion. Moreover, in another study, I showed that the viral dynamics in mouse models humanized by transferring HSC is closer to patients. This study also teaches us that it is not necessary to invoke the immune response to HIV, to explain the profiles of viral replication observed early after infection. This result suggests that part of the viral dynamic is dependent on the target/virus ratio. Together, results collected during my PhD thesis provides new information on viral dynamic and establish the interest of combining two viral entry inhibitors for gene therapy of HIV infection.

Les cellules T spécifiques d'antigène dans la peau participent au contrôle des infections cutanées. Toutefois, leurs mécanismes d'induction après infection ou vaccination ainsi que leur rôle dans la protection et leur maintenance restent à étudier. Nous avons émis l'hypothèse que l'infection cutanée ou la vaccination cutanée pouvaient programmer une réponse cellulaire T spécifique d'antigène cutanée. Notre premier objectif était le développement de modèle d'étude de la peau humaine, des cellules T cutanées et de la vaccination par la peau. Un modèle de greffes de peau humaine à des souris immunodéficientes, a permis de montrer un maintien et la fonctionnalité des cellules présentatrices d'antigènes et cellules T cutanées plusieurs semaines après greffe. J'ai ainsi mis en place un modèle d'étude in vivo des cellules humaines cutanées.Dans un deuxième temps, un essai clinique randomisé chez le volontaire sain, a étudié l'impact de la voie d'administration - intradermique, transcutanée ou intramusculaire - du vaccin antigrippal sur les réponses immunitaires. Cette étude de longue durée et multiparamétrique n'étant pas terminée, nous aborderons les résultats de l'impact de l'inflammation, en particulier CXCL-10, dans l'induction des réponses adaptatives.Enfin, le rôle des lymphocytes T cutanés dans la protection contre les herpesvirus - VZV, HSV-1, HSV-2 - restant méconnus et notamment la potentielle réactivité croisée des cellules T cutanées contre ces 3 virus, j'ai mis en place un modèle murin préclinique permettant d'étudier les réponses T spécifiques cutanées et systémiques à la varicelle après vaccination. Une étude clinique est maintenant en cours de montage. En conclusion, au cours de mon doctorat, j’ai pu mettre en évidence l’importance des LT cutanés notamment mémoires dans la mise en place de la réponse immunitaire après vaccination et/ou infection. Ces données sont importantes pour l’amélioration des stratégies vaccinales. / Antigen -specific T cells in the skin represents a considerable advantage. It has been proposed that these cells may participate in the control of skin infections. However, further investigation is needed to understand their mechanism of induction after infection or vaccination, their maintenance in the skin tissue and their role in the protection upon re-infection. We hypothesized that the skin vaccination or infection can program a cutaneous population of antigen-specific T cell response. In order to study T cell populations in the skin, we set up different in vivo and clinical models of study of human skin T cells. A model of human skin grafts in immunodeficient mice, allowed us to show the persistance of antigen-presenting cells as well as antigen-specific effector T skin cells in human skin engrafted explants. We have demonstrated their functionality several weeks after skin transplantation. This study provides an in vivo model for studying in vivo human skin T cells upon infection or vaccination. In a second part, we performed a randomized clinical trial of healthy volunteers, to study the impact of routes of immunization using trivalent-influenza vaccine (TIV) by intradermal, transcutaneous (hair follicular targeting) or intramuscular routes on immune responses. This long-term study is not completed yet. However, we will discuss the first results of the impact of inflammation including cytokine, CXCL10 on vaccination local side effects and in the induction of adaptive responses. In a third part, we asked the role of T lymphocytes in human skin infections or mucous membranes against herpèsviruses (VZV, HSV-1, and HSV-2). We hypothesized cross-reactive T cell skin against these three viruses. A preclinical mouse model for studying cutaneous and systemic T cell specific responses to varicella after vaccination has been developed. A clinical study is in progress.

La transmission du Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH) par voie sexuelle représente le mode majoritaire de contamination (80%) (UNAIDS). Ce mode de contamination implique le passage du virus à travers les muqueuses et une interaction avec les cellules épithéliales et les cellules immunitaires présentes au sein de ces muqueuses (cellules dendritiques, macrophages ou lymphocytes). Les muqueuses représentent le principal site d'exposition de l’organisme aux antigènes de l’environnement. Les SIgA (IgA sécrétoires) présentes dans la lumière de ces muqueuses représentent la première ligne de défense immunitaire contre l’infection et la colonisation des muqueuses. Les IgA sont capables d’interagir avec les glycoprotéines (gp) exprimées à la surface du VIH et de bloquer l’infection et/ou la transcytose à travers l’épithélium muqueux. Nous avons pu étudier la prévalence des SIgA anti-gp41 et plus précisément anti-MPER présentes dans la salive parotidienne de personnes Exposées au VIH Séronégatives (ESN) et leur rôle dans l’inhibition de l’infection par le virus in vitro. Nous avons pu démontrer que ces sujets présentaient un taux plus important de SIgA anti-MPER neutralisantes. Ce premier travail nous a permis de valider la gp41 comme immunogène d’intérêt pour la génération de SIgA neutralisantes. Nous avons pu générer des IgA1 dans un modèle murin α1Kl chimérique capable de produire des anticorps IgA1 humanisés. L’immunisation de ces souris a permis la production de 6 anticorps monoclonaux spécifiques de la région MPER capables de reconnaître des épitopes conformationnels élargis, correspondant aux épitopes reconnus par le 2F5 et le 4E10. Les IgA1 présentaient de fortes capacités neutralisantes pour différentes souches de laboratoire et de souches primaires du VIH. Les études de caractérisation des fonctions antivirales de ces anticorps permettront de mieux définir le mode d’action de ces anticorps. A notre connaissance, ces IgA1 neutralisantes anti-MPER sont les premières décrites à ce jour dans la littérature. De par leur faible immunogénicité et leur faible autoréactivité, ces anticorps peuvent facilement être intégrés dans des approches thérapeutiques locales ou par sérothérapie passive pour la protection après administration de SHIV dans des modèles animaux comme le macaque. L’ensemble de mes travaux de thèse ont confirmé l’intérêt thérapeutique potentiel des SIgA dans la lutte contre le VIH et notamment celles dirigées contre la partie gp41 de l’enveloppe / Sexual transmission of the Human Immunodeficiency Virus is the major mode of contamination (80%) for this pathogen (UNAIDS). This mode of transmission involves a passage of the virus though the mucosa and an interaction with epithelial cells and immune cells present in the mucosa (dendritic cells, macrophages and lymphocytes). Mucosa represents the major site of exposure for the organism to environmental antigens. The IgA expressed in the lumen of mucosa are the first line of immune defence against infection and colonization of mucosa. IgA are able to interact with glycoproteins (gp) expressed on the surface of HIV and prevent infection and/or block epithelial transcytosis. In this study we have investigated the prevalence of SIgA anti-MPER present in the parotid saliva of Exposed to HIV but Seronegative individuals (ESN). This study has allowed us to validate gp41 as an immunogen of interest for the generation of neutralizing IgA. IgA1 were generated in a chimeric mice model α1Kl that produced humanized IgA1 type antibodies. Immunizations of these mice has led to the elicitation of six monoclonal antibodies specific to the MPER region able to recognize extended conformational neutralizing epitopes of 2F5 and 4E10, two broadly neutralizing monoclonal antibodies specific to MPER. Elicited IgA1 have potent neutralizing properties for both laboratory and primary HIV strains. Characterization studies of the antiviral functions of these antibodies will further define the mode of action of these antibodies. To our knowledge, these anti-MPER humanized monoclonal neutralizing IgA1 antibodies are the first of this type described to date in the literature. By their low immunogenicity and autoreactivity, these antibodies can be easily integrated into local therapeutic approaches or passive serotherapy for protection in animal models such as the macaque challenged with SHIV. All the results of my PhD work confirm the great interest of gp41-specific SIgA as therapeutic agents against HIV

Les modèles animaux ont largement contribué à notre compréhension de l’immunologie humaine et des mécanismes pathologiques associés au développement des maladies. Cependant, les modèles murins ne permettent pas de reproduire toute la complexité des pathologies humaines. Les souris à système immunitaire humain (HIS), par leur capacité à récapituler l’hématopoïèse humaine et à être infectées par des pathogènes humains, constituent une solution de choix pour combler ce fossé inter-espèce. Après greffe de cellules souches hématopoïétiques humaines, des souris hôtes sévèrement immunodéprimées permettent un haut niveau de développement du système hémato-lymphoïde humain tout au long de leur vie. Cependant, certains types cellulaires, comme les cellules lymphoïdes innées, ne parviennent pas à se différencier et à fonctionner normalement dans les modèles murins HIS actuels. Ici, nous décrivons le développement d’un modèle souris HIS original, nommé BRGSF, montrant une amélioration de la maturation, de la fonction et de l’homéostasie des cellules natural killer (NK) humaines et des autres ILCs. De plus, en récapitulant les différentes étapes du développement des ILCs humaines, ce modèle souris BRGSF nous a permis d’identifier pour la première fois un précurseur d’ILC (ILCP) présent à la fois dans notre modèle HIS ainsi que dans le sang périphérique et plusieurs organes lymphoïdes et non-lymphoïdes humains. Cette population circulante d’ILCPs pourrait constituer un substrat pour la production d’ILCs matures dans les tissus périphériques en réponse à des stress environnementaux, inflammatoires et/ou infectieux. Dans une seconde partie de ce travail de thèse, nous avons utilisé ces souris BRGS afin de tester l’efficacité de deux immunothérapies reposant sur les lymphocytes innés pour le traitement d’un carcinome colorectal exprimant EGFR et muté pour KRAS. La première approche a consisté en la co-administration des cellules NK dérivées de sang de cordon ombilical et d'anticorps monoclonal cetuximab afin de promouvoir le mécanisme de cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) contre la tumeur. La seconde stratégie a reposé sur l’injection de nanobodies VHH combinant l’inhibition de l’EGFR et l’activation spécifique du récepteur Vγ9Vδ2 des cellules T effectrices. Les résultats de cette étude soulignent l’importance des modèles murins HIS pour la compréhension du développement des lymphocytes innés humains et pour mieux les mettre à profit dans les thérapies anti-tumeurs / Animal models have extensively contributed to our understanding of human immunobiology and to uncover the underlying pathological mechanisms occurring in the development of the disease. However, mouse models do not always reproduce the genetic complexity inherent in human disease conditions. Human immune system (HIS) mouse models that are susceptible to human pathogens and can recapitulate human hematopoiesis provide one means to bridge the interspecies gap. Severely immunodeficient host mice support life-long, high level human hematolymphoid development after engraftment with human hematopoietic stem cells (HSC). However, the differentiation and function of some blood cell types, including innate lymphoid cells (ILCs), is poorly characterized in current HIS mice. Here we describe the development of a novel HIS mouse model, named BRGSF, which demonstrate enhanced maturation, function and homeostasis of human natural killer (NK) cells and other ILCs. Furthermore, the BRGSF-based HIS mouse model recapitulated the developmental stages of human ILCs. We could identify for the first time an ILC precursor (ILCP) population that is present both in HIS mice and in human peripheral blood as well as in several lymphoid and non-lymphoid human tissues. This circulating human ILCP population may provide a substrate to generate mature ILCs in tissues in response to environmental stressors, inflammation and infection. In a second part of the thesis we used BRGS immunodeficient mice to assess two innate lymphocyte-based immunotherapeutic approaches for treating EGFR-expressing KRAS-mutated colorectal carcinoma in vivo. The first model used a combination of umbilical cord blood (UCB)-derived NK cells and the monoclonal antibody cetuximab to promote antibody dependent cell cytotoxicity (ADCC) against the tumors. In a second model, we evaluated the therapeutic suitability of novel bispecific VHH constructs that combine inhibition of the EGFR with the target-specific activation of effector Vγ9Vδ2-T cells. These studies highlight the utility for HIS-based mouse models to understand human innate lymphocyte development and to harness these potent effectors for anti-tumor therapies.

La maladie du greffon contre l’hôte (GvHD) est une complication majeure des greffes de cellules souches hématopoïétiques (HSCT) qui survient dans 30 à 70% des cas et peut causer la mort, malgré un traitement prophylactique bien conduit. Il existe donc une réelle demande clinique pour améliorer ces traitements prophylactiques. Parce que ces traitements prophylactiques reposent en général sur des agents immunosuppresseurs, ceux-ci contribuent à diminuer la reconstitution immunitaire du patient, ce qui a un impact défavorable sur les infections et les taux de rechute d’hémopathie maligne, et donc limite leur utilisation. Les immunoglobulines (IVIG) pourraient représenter une alternative intéressante puisqu’elles ont des propriétés immunomodulatrices et qu’elles sont de plus couramment utilisées en clinique pour traiter des patients ayant un déficit immunitaire. Leur capacité à réduire l’apparition et la sévérité de la GvHD, sans toutefois inhiber ou nuire à la reconstitution immunitaire chez le patient n’a néanmoins jamais été clairement démontrée. Les objectifs de ce projet sont donc d’évaluer l’efficacité des IVIG à réduire l’incidence et la sévérité de la GvHD dans un modèle murin humanisé de GvHD, ainsi que de déterminer le mécanisme d’action des IVIG. Ce modèle consiste à injecter des huPBMCs à des souris immunodéprimées ne pouvant les rejeter. Les résultats obtenus suggèrent que les IVIG possèdent un effet immunomodulateur permettant de réduire les signes cliniques et de retarder l’apparition de la GvHD, tout en permettant l’apparition de cellules NK. Les IVIG agiraient de façon indirecte sur les huPBMCs afin d’induire l’apparition des cellules NK. / Graft-versus-host disease (GvHD) is a major complication following hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), occuring in 30 to 70% of HSCT despite proper prophylactic treatment, and can result in death. It is therefore primordial to improve the prophylactic treatments in order to reduce the frequency and severity of GvHD. Since these prophylactic treatments are based on the use of immunosuppressive agents, they inhibit the immune reconstitution and thus increase the risk of infections and relapse. Because of their immunomodulating properties, immunoglobulins (IVIG) represent a promissing alternative. Furthermore, IVIG are already widely used in patients with immune deficits. Since no study has yet clearly shown that IVIG can reduce GvHD without inhibiting the immune reconstitution in the patient, the scientific community is still debating their usefullness in GvHD prevention. Should their efficacy to reduce the incidence and severity of GvHD without impairment to the immune reconstitution be demonstrated, the use of IVIG could change the clinical outcome for HSCT patients, improving their remission and quality of life. The objectives of this project are to evaluate IVIG efficacy in GvHD prevention and to define the mechanism of action of IVIG. To fulfill these objectives, we will use a GvHD humanized mouse model, which consists of injecting huPBMCs in immunodeficient mice who can not reject them. Our results demonstrate an immunomodulatory effect of IVIG, allowing for reduced clinical signs and a slighlty increased survival in GvHD. A population of NK cells also appeared upon IVIG treatment and is believed to be indirectly induced by IVIG.

Les cellules épithéliales qui produisent l’émail, les améloblastes, sont séparées de l'émail au niveau de la zone de maturation par une membrane basale spécialisée (MBS) enrichie en laminine 332 (LM-332). Cette protéine hétérotrimérique (composée des chaînes α3, ß3 et γ2) assure l'intégrité structurelle des membranes basales (MB) et influence divers processus cellulaires épithéliaux tels que l'adhésion et la différenciation cellulaire. Des modèles de souris « knockout » (KO), où les gènes codant pour LM-332 ont été supprimés, meurent peu après la naissance. Néanmoins, ce phénotype létal peut être contourné en substituant chez la souris le gène produisant la chaîne γ2 de la laminine (LAMC2) par sa forme humaine, sous le contrôle de l’expression du promoteur-rtTA, de la cytokératine 14, inductible par la prise de doxycycline (Dox) - (Tet-on). Le but de ce projet est d’examiner si l’utilisation de cette protéine humaine chez la souris a un effet sur la structuration de la MBS ainsi que sur la maturation de l'émail. La phase de maturation de l’organe de l’émail chez la souris transgénique a été sévèrement altérée par rapport à une souris normale (WT). La MBS n’est plus visible, une matrice dystrophique s’est formée dans la couche d'émail dans la phase de maturation, et la présence d’une matrice résiduelle de l'émail est observée durant la phase tardive de maturation. Des micro-analyses tomographiques ont révélé une usure excessive des surfaces occlusales des molaires, un écroulement de l'émail sur les pointes des incisives et une hypominéralisation de l'émail. Cependant, aucune altération structurale due à cette recombinaison transgénique n’a été observée dans d'autres sites épithéliaux, tels que la peau, le palais et la langue. Ces résultats indiquent que, bien que ce modèle de souris humanisée soit capable de rétablir ses fonctions dans divers tissus épithéliaux, il est incapable de soutenir la structuration d'une MBS à l'interface entre les améloblastes et l’émail en maturation. Cet échec peut être lié à la composition spécifique de la MBS dans la phase de maturation et supporte l’hypothèse que la MBS est essentielle pour la maturation adéquate de l'émail. / The epithelial ameloblasts are separated from the maturing enamel by an atypical basement membrane (BM) that is enriched in laminin 332 (LM-332). This heterotrimeric protein (α3, ß3 and γ2 chains) provides structural integrity to BMs and influences various epithelial cell processes including cell adhesion and differentiation. Mouse models that lack expression of individual LM-332 chains die shortly after birth. The lethal phenotype of laminin γ2 knockout mice can be rescued by human laminin γ2 (LAMC2) expressed using a doxycycline-inducible (Tet-on) cytokeratin 14 promoter-rtTA. These otherwise normal-looking rescued mice exhibit white spot lesions on incisors. We therefore investigated the effect of rescue with human LAMC2 on enamel maturation and structuring of the atypical BM. The maturation stage enamel organ in transgenic mice was severely altered as compared to wild type controls, a structured BM was no longer discernible, dystrophic matrix appeared in the maturing enamel layer, and there was residual enamel matrix late into the maturation stage. Microtomographic scans revealed excessive wear of occlusal surfaces on molars, chipping of enamel on incisor tips, and hypomineralization of the enamel layer. No structural alterations were observed at other epithelial sites, such as skin, palate and tongue. These results indicate that while this humanized mouse model is capable of rescue in various epithelial tissues, it is unable to sustain structuring of a proper BM at the interface between ameloblasts and maturing enamel. This failure may be related to the atypical composition of the BM in the maturation stage and reaffirms that the atypical BM is essential for enamel maturation.

La maladie du greffon contre l’hôte (GvHD) est une complication majeure des greffes de cellules souches hématopoïétiques (HSCT) qui survient dans 30 à 70% des cas et peut causer la mort, malgré un traitement prophylactique bien conduit. Il existe donc une réelle demande clinique pour améliorer ces traitements prophylactiques. Parce que ces traitements prophylactiques reposent en général sur des agents immunosuppresseurs, ceux-ci contribuent à diminuer la reconstitution immunitaire du patient, ce qui a un impact défavorable sur les infections et les taux de rechute d’hémopathie maligne, et donc limite leur utilisation. Les immunoglobulines (IVIG) pourraient représenter une alternative intéressante puisqu’elles ont des propriétés immunomodulatrices et qu’elles sont de plus couramment utilisées en clinique pour traiter des patients ayant un déficit immunitaire. Leur capacité à réduire l’apparition et la sévérité de la GvHD, sans toutefois inhiber ou nuire à la reconstitution immunitaire chez le patient n’a néanmoins jamais été clairement démontrée. Les objectifs de ce projet sont donc d’évaluer l’efficacité des IVIG à réduire l’incidence et la sévérité de la GvHD dans un modèle murin humanisé de GvHD, ainsi que de déterminer le mécanisme d’action des IVIG. Ce modèle consiste à injecter des huPBMCs à des souris immunodéprimées ne pouvant les rejeter. Les résultats obtenus suggèrent que les IVIG possèdent un effet immunomodulateur permettant de réduire les signes cliniques et de retarder l’apparition de la GvHD, tout en permettant l’apparition de cellules NK. Les IVIG agiraient de façon indirecte sur les huPBMCs afin d’induire l’apparition des cellules NK. / Graft-versus-host disease (GvHD) is a major complication following hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), occuring in 30 to 70% of HSCT despite proper prophylactic treatment, and can result in death. It is therefore primordial to improve the prophylactic treatments in order to reduce the frequency and severity of GvHD. Since these prophylactic treatments are based on the use of immunosuppressive agents, they inhibit the immune reconstitution and thus increase the risk of infections and relapse. Because of their immunomodulating properties, immunoglobulins (IVIG) represent a promissing alternative. Furthermore, IVIG are already widely used in patients with immune deficits. Since no study has yet clearly shown that IVIG can reduce GvHD without inhibiting the immune reconstitution in the patient, the scientific community is still debating their usefullness in GvHD prevention. Should their efficacy to reduce the incidence and severity of GvHD without impairment to the immune reconstitution be demonstrated, the use of IVIG could change the clinical outcome for HSCT patients, improving their remission and quality of life. The objectives of this project are to evaluate IVIG efficacy in GvHD prevention and to define the mechanism of action of IVIG. To fulfill these objectives, we will use a GvHD humanized mouse model, which consists of injecting huPBMCs in immunodeficient mice who can not reject them. Our results demonstrate an immunomodulatory effect of IVIG, allowing for reduced clinical signs and a slighlty increased survival in GvHD. A population of NK cells also appeared upon IVIG treatment and is believed to be indirectly induced by IVIG.

La transmission du Virus de l'Immunodéficience Humaine (VIH) par voie sexuelle représente le mode majoritaire de contamination (80%) (UNAIDS). Ce mode de contamination implique le passage du virus à travers les muqueuses et une interaction avec les cellules épithéliales et les cellules immunitaires présentes au sein de ces muqueuses (cellules dendritiques, macrophages ou lymphocytes). Les muqueuses représentent le principal site d'exposition de l'organisme aux antigènes de l'environnement. Les SIgA (IgA sécrétoires) présentes dans la lumière de ces muqueuses représentent la première ligne de défense immunitaire contre l'infection et la colonisation des muqueuses. Les IgA sont capables d'interagir avec les glycoprotéines (gp) exprimées à la surface du VIH et de bloquer l'infection et/ou la transcytose à travers l'épithélium muqueux. Nous avons pu étudier la prévalence des SIgA anti-gp41 et plus précisément anti-MPER présentes dans la salive parotidienne de personnes Exposées au VIH Séronégatives (ESN) et leur rôle dans l'inhibition de l'infection par le virus in vitro. Nous avons pu démontrer que ces sujets présentaient un taux plus important de SIgA anti-MPER neutralisantes. Ce premier travail nous a permis de valider la gp41 comme immunogène d'intérêt pour la génération de SIgA neutralisantes. Nous avons pu générer des IgA1 dans un modèle murin α1Kl chimérique capable de produire des anticorps IgA1 humanisés. L'immunisation de ces souris a permis la production de 6 anticorps monoclonaux spécifiques de la région MPER capables de reconnaître des épitopes conformationnels élargis, correspondant aux épitopes reconnus par le 2F5 et le 4E10. Les IgA1 présentaient de fortes capacités neutralisantes pour différentes souches de laboratoire et de souches primaires du VIH. Les études de caractérisation des fonctions antivirales de ces anticorps permettront de mieux définir le mode d'action de ces anticorps. A notre connaissance, ces IgA1 neutralisantes anti-MPER sont les premières décrites à ce jour dans la littérature. De par leur faible immunogénicité et leur faible autoréactivité, ces anticorps peuvent facilement être intégrés dans des approches thérapeutiques locales ou par sérothérapie passive pour la protection après administration de SHIV dans des modèles animaux comme le macaque. L'ensemble de mes travaux de thèse ont confirmé l'intérêt thérapeutique potentiel des SIgA dans la lutte contre le VIH et notamment celles dirigées contre la partie gp41 de l'enveloppe

La Granulomatose Septique Chronique (CGD) est une maladie génétique rare de l’immunodéficience innée affectant les cellules phagocytaires (neutrophiles, macrophages). Elle est causée par des mutations dans les sous-unités du complexe NADPH oxydase formé du cytochrome b558 membranaire (NOX2 associé à p22phox) et de facteurs cytosoliques (p47phox, p67phox et p40phox). La déficience de ce complexe enzymatique va conduire à l’absence de formation de formes réactives de l’oxygène (FRO) microbicides et donc à l’apparition d’infections graves et récurrentes très tôt dans l’enfance. La chimioprophylaxie à vie permet de protéger ces patients mais peut être responsable d’effets indésirables. La seule thérapie curative est la transplantation de moelle osseuse mais tous les patients ne peuvent en bénéficier, et la thérapie génique n’est pas encore envisageable. Il y a donc un manque réel de nouvelles thérapies pour cette maladie. Cependant pour développer de nouveaux traitements, il faut disposer de modèles physiopathologiques pertinents. Or, les modèles existants sont imparfaits ou manquants. Le but de notre travail est donc de produire des modèles cellulaires et animaux de la CGD pour développer dans un second temps, une nouvelle approche thérapeutique basée sur l’utilisation de protéoliposomes.Grâce à leurs propriétés de pluripotence et d’auto-renouvellement à l’infini, les cellules souches pluripotentes induites (iPS) sont un outil puissant pour la modélisation physiopathologique. Ainsi, à partir de fibroblastes de patients atteints de CGD reprogrammés en cellules iPS, nous avons mis au point un protocole efficace de différenciation hématopoïétique in vitro en neutrophiles et macrophages. Nous avons montré que ces cellules phagocytaires sont matures et reproduisent parfaitement le phénotype déficient en FRO des patients CGD. Nous avons donc obtenu des modèles cellulaires pertinent modélisant trois formes génétiques de CGD, la CGD liée à l’X et deux formes autosomiques récessives, CGDAR22 et CGDAR47.Nous avons ensuite réalisé la preuve du concept de l’efficacité de protéoliposomes thérapeutiques sur les macrophages modélisés de la forme CGDX, la forme génétique la plus fréquente (70 % des cas) due à l’absence du cytochrome b558 membranaire (NOX2/p22phox). Grâce à une collaboration avec la start-up Synthelis SAS, des liposomes contenant le cytochrome b558 au niveau de la membrane lipidique ont été produits dans un système d’expression acellulaire basé sur l’utilisation d’extraits d’Escherichia coli. Ces liposomes NOX2/p22phox sont capables de reconstituer une enzyme NADPH oxydase fonctionnelle in vitro et de délivrer le cytochrome b558 à la membrane plasmique des macrophages CGDX qui présentent alors une restauration de l’activité NADPH oxydase avec la production de FRO.Enfin, nous nous sommes proposés de générer des souris dites « humanisées » par transplantation de cellules souches hématopoïétiques CD34+ capables de prise de greffe et de reconstitution hématopoïétique dans des souris immunodéficientes. A partir de cellules iPS saines, nous avons réussi à produire des cellules hématopoïétiques CD34+ possédant un potentiel hématopoïétique in vitro. Cependant, malgré des résultats encourageants, aucune prise de greffe in vivo n’a pu être réellement confirmée à ce jour.Pour conclure, nous avons donc montré au cours de ce projet, la production de modèles cellulaires de trois formes génétiques de CGD à partir de cellules iPS. Puis le modèle de macrophages CGDX nous a permis de faire la preuve de l’efficacité d’une nouvelle thérapie in vitro, une « enzymothérapie substitutive liposomale », qui pourrait à terme, offrir une alternative thérapeutique pour le traitement des infections aigües pulmonaires des patients CGD réfractaires aux traitements antibiotiques et antifongiques conventionnels. / Chronic Granulomatous Disease (CGD) is a rare inherited pathology of the innate immune system that affects the phagocytic cells (neutrophils, macrophages). This disease is caused by mutations in the subunits of the NADPH oxidase complex composed of the membrane cytochrome b558 (NOX2 associated with p22phox) and the cytosolic components (p47phox, p67phox et p40phox). Dysfunction in this enzymatic complex leads to the absence of microbicidal reactive oxygen species (ROS) and therefore to the development of recurrent and life-threatening infections in early childhood. Life-long prophylaxis is used to protect these patients but it may be responsible for side effects. Bone marrow transplantation is the only curative treatment but it can not be proposed to all the patients. In addition, gene therapy is not possible up to now. So there is a real lack of new therapies for this disease. However, to develop new therapeutic approaches, relevant physiopathological models must be available. Actually, existing models are imperfect or missing. Thus, the goal of our work is to produce cellular and animal models of CGD to develop a new proteoliposome-based therapy.Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a powerful tool for physiopathologic modeling due to their pluripotency and self-renewal properties. Using CGD patient-specific iPSCs regrogrammed from fibroblasts, we developped an efficient protocol for in vitro hematopoietic differentiation into neutrophils and macrophages. We showed that the phagocytic cells produced are mature and reproduce the ROS-deficient phenotype found in CGD patients. Thus, we obtained relevant cellular models for three genetic forms of CGD: X-linked CGD and the two autosomal recessive forms AR22CGD and AR47CGD.Then, we demonstrated the proof-of-concept of the efficacy of therapeutic proteoliposomes on X-CGD iPS-derived macrophages. Indeed, X-CGD is the main form of the disease (70% of cases) and is caused by the absence of the membrane cytochrome b558 (NOX2/p22phox). Thanks to a collaboration with the start-up Synthelis SAS, liposomes integrating the cytochrome b558 into lipid bilayers were produced in an E. coli-based cell-free protein expression system. These NOX2/p22phox liposomes were able to reconstitute a functional NADPH oxidase enzyme in vitro and to deliver the cytochrome b558 at the plasma membrane of X-CGD macrophages, leading to restore the NADPH oxidase activity with a ROS production.Finally, we proposed to generate « humanized » mice models with a human immune system after transplantation of CD34+ hematopoietic stem cells able to engraft and reconstitute long-term hematopoiesis in immunodeficient mice. Using healthy iPSCs, we successfuly produced CD34+ hematopoietic cells with in vitro hematopoietic potential. However, no in vivo engraftment was really confirmed yet.In conclusion, during this project, we produced cellular models of three genetic forms of CGD using patient-specific iPSCs. Then, X-CGD macrophages were used to demonstrate in vitro the efficacy of a new therapy. This « liposomal replacement enzymotherapy » could, in the future, represents a curative alternative against life-threatening lung infections refractory to conventional antibiotic and antifungal therapy.

Le développement de nouvelles stratégies vaccinales et le traitement de nombreuses pathologies dermatologiques font partis des enjeux majeurs des années à venir. L'étude et la compréhension des mécanismes de réponses immunitaires cutanées sont ainsi essentielles. Les cellules de Langerhans épidermiques et les cellules dendritiques dermiques jouent un rôle central dans l'immunité adaptative spécifique à un pathogène, et dans l'immunité innée, de par leur fonction de présentation des antigènes (APC), mais également d'activateur et de régulateur de l'action des autres cellules immunitaires. Durant ce travail de recherche, nous avons mis au point et testé plusieurs modèles d'étude des mécanismes de l'immunité cutanée. Un premier modèle de " souris humanisées " a été mis au point, à partir de souris immunodéprimées NSG HLA-A2 tg et de greffes de peau humaine. Une fois le modèle techniquement mis au point, nous avons vérifié de la conservation et de la fonctionnalité des APC. La faible conservation des APC au-delà de plusieurs semaines, nous a conduit à mettre au point un deuxième modèle de " souris humanisées " qui bénéficiaient d'injections intra-hépatiques de progéniteurs hématopoïétiques humains. La colonisation en APCs cutanées humaines n'étant pas suffisante, il a fallu injecter aux souris des APCs provenant du même sang que les progéniteurs hématopoïétiques afin d'obtenir une réponse immunitaire suffisante. La faible concentration en APC cutanées de ce modèle, la lourdeur et le coût de mise au point sont des limites non négligeables pour l'utilisation de ce support d'étude. Ces souris humanisées sont d’excellents modèles d’étude, mais ils présentent chacun leurs limites. Lorsque cela est possible il est ainsi plus simple d’utiliser des explants cutanés frais. Nous avons quantifié les APC cutanées en fonction du site d’origine (abdomen, seins…) et de l’âge du donneur de ces explants issus de chirurgie plastique. Sur les 21 explants testés, nous n’avons pas retrouvé de différence significative dans la concentration en APC quel que soit le site et l’âge du donneur. Ces 3 modèles offrent des possibilités d’étude des mécanismes de l’immunité cutanée, nous les utilisons actuellement au sein du laboratoire pour des tests vaccinaux, et pour l’étude du rôle de l’IL-32 produite par les kératinocytes impliqués dans l’activation des cellules de Langerhans. / The development of new vaccination strategies and the treatment of many dermatological pathologies are among the major challenges of the years to come. The study and understanding of the mechanisms of cutaneous immune responses are thus essential. Epidermal Langerhans cells and dermal dendritic cells play a central role in pathogen-specific adaptive immunity, and in innate immunity, by their antigen presenting function (APC), but also as an activator and regulator of the action of other immune cells.During this research, we developed and tested several models for the study of the mechanisms of cutaneous immunity. A first model of "humanized mice" was developed from immunosuppressed NSG HLA-A2 tg mice and human skin grafts. Once the model was technically developed, we verified the conservation and functionality of the APCs. The low PCA retention beyond several weeks, led us to develop a second model of "humanized mice" that benefited from intrahepatic injections of human hematopoietic progenitors. Since colonization in human skin APCs was not sufficient, it was necessary to inject the APCs from the same blood as the hematopoietic progenitors to obtain a sufficient immune response. The low concentration of skin APCs in this model, the cumbersomeness and the cost of development are not insignificant limits for the use of this study support.These humanized mice are excellent models of study, but they each have their limitations. Where possible, it is thus easier to use fresh skin explants. We quantified the cutaneous APCs according to the site of origin (abdomen, breasts ...) and the age of the donor of these explants resulting from plastic surgery. Of the 21 explants tested, there was no significant difference in APC concentration at any site and age of the donor.These three models offer possibilities for studying the mechanisms of skin immunity, we are currently using them in the laboratory for vaccine tests, and for studying the role of IL-32 produced by the keratinocytes involved in l activation of Langerhans cells.