Submitted by Márcio Maia (marciokjmaia@gmail.com) on 2016-09-08T17:34:01Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3383101 bytes, checksum: e52ccda15daee8307b55ff0e71eeea15 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-08T17:34:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3383101 bytes, checksum: e52ccda15daee8307b55ff0e71eeea15 (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / Cissampelos sympodialis Eichl., (Menispermaceae) is popularly known as “milona". This species has shown potential to interfere with the pathophysiology of asthma by exerting multiple synergistic effects. Warifteine, a bisbenzilsioquinoline alkaloid has been considered as the main bioactive substance present in the leaves and roots of this species. The present work used a metabolomics approach combined with multivariate data analysis to study quantitative and qualitative chemical variations in the leaf extracts during the phenological development of the plant (between 60 and 210 days after seedling, and the corresponding extracts were coded as CsL60, CsL90, CsL120, CsL150, CsL180 e CsL210) and its relation with the relaxing effect using in vitro guinea pig tracheal. 1H-NMR data from extracts were submitted to PCA analysis and the concentration of the identified compounds was quantified by 1H qNMR. The contents of warifteine and methylwarifteine were determined by HPLC and the total phenolic content of extracts was determined using the Folin-Ciocalteu method, using galic acid as standard. Extracts submitted to 1H-NMR spectroscopy were simultaneously screened to determine their potency in relaxing in vitro guinea-pig tracheal pre-contracted with carbachol. To investigate the relationship between chemical profile and pharmacological activity we used PLS regression. The method was able to identify and to quantitate 20 primary and secondary metabolites in the extracts. The concentration of the major alkaloids decrease from 2.0 ± 0.32 μg/mL for warifteine and 1.0 ± 0.14 μg/mL for methylwarifteine to undetectable levels from 90 days onwards after seedling for warifteine and 120 days for methylwarifteine. Phenolic compounds and derivatives of the flavonols quercetin and kaempferol behave in na opposite fashion, increasing its levels towards fructification (from 0.1 ± 0.05 to 1.0 ± 0.12 mmol/L for quercetin and from 0.4 ± 0.12 to 1.0 ± 0.16 mmol/L for kaempferol). The metabolomics study based on 1H-NMR spectroscopy with PCA was able to discriminate all extracts demonstrating that the phenological cycle is associated with clear differences in chemical composition, mainly due to variations in the concentration of sugars and quinic acid derivatives. The extract obtained during fructification (CsL210) was the most distinctive amongst all samples mainly due to signals from quinic acid derivatives, kaempferol and quercein derivatives. The content of major alkaloids decreased from 2.0 ± 0.32 μg/mL for warifteine and 1.0 ± 0.14 μg/mL to methylwarifteine to undetectable levels from 90 days onwards after seedling for warifteine and 120 days for methylwarifteine. The phenolic compounds and flavonoids quercetin (0.1 ± 0.05 a 1.0 ± 0.12 mmol/L) and kaempferol (0.4 ± 0.12 a 1.0 ± 0.16 mmol/L) behaved in an opposite fashion, increasing its concentration towards fructification. The six extracts relaxed the trachea pre-contracted with carbachol guinea pig, and the CsF210 extract (EC50 = 74.6 ± 7.9 μg/mL) more potent compared to CsL90 extracts (EC50 = 231.6 ± 38.9 μg/ml) and CsL180 (EC50 = 239.7 ± 15.1 μg/ml) in the presence of functional epithelium. There was no correlation between the content of alkaloids as determined by HPLC and the spasmolytic activity of the extracts. PLS analysis revealed a moderate correlation between 1H-NMR signals for quercetin and kaempferol derivatives and the spasmolytic activity of extracts. Taken together our results demonstrate for the first time that bisbenzylisoquinoline alkaloids warifteine and methylwarifteine do not seem to participate in the spasmolytic actions of polar Cissampelos sympodialis extracts. / Cissampelos sympodialis Eichler, pertence a família Menispermaceae, sendo conhecida popularmente como “milona". A espécie tem demonstrado por meio de testes pré-clínicos, potencial de interferir em processos relacionados com a fisiopatologia da asma, exercendo múltiplos efeitos sinérgicos. A warifteína, um alcaloide bisbenzilisoquinolínico, tem sido apontada como a principal substância bioativa presente nas folhas e nas raízes desta espécie. O presente estudo utilizou metodologia metabolômica baseada em RMN e combinação com análise multivariada para analisar a variação química qualitativa e quantitativa dos constituintes presentes nos extratos hidroalcoólicos das folhas durante o desenvolvimento da planta (entre 60 a 210 dias após o plantio, codificados como CsF60, CsF90, CsF120, CsF150, CsF180 e CsF210) e a relação com o efeito in vitro sobre traqueia isolada de cobaia. Os dados de RMN-1H dos seis extratos das folhas foram submetidos à análise por PCA e os teores dos compostos identificados foram quantificados por RMNq-1H. O teor de warifteína e metilwarifteína foram determinados por CLAE e o teor de fenólicos totais determinado pelo método de Folin-Ciocalteu, utilizando ácido gálico como o composto fenólico padrão. Os extratos submetidos à análise por RMN-1H foram simultaneamente testados quanto à sua potência em relaxar in vitro a traqueia de cobaia pré-contraída com carbacol. Para estudar a relação entre o perfil químico e a atividade farmacológica foi empregada a técnica de PLS (Partial Least Squares). O estudo foi capaz de identificar e quantificar vinte substâncias dentre metabólitos primários e secundários presentes em todos os extratos das folhas. Os teores dos alcaloides majoritários decaem de 2,0 ± 0,32 μg/mL para warifteína e 1,0 ± 0,14 μg/mL para metilwarifteína a níveis não detectáveis, a partir de 90 dias após o plantio para a warifteína e a partir de 120 dias para metilwarifteína. Os compostos fenólicos e os flavonóis quercetina (0,1 ± 0,05 a 1,0 ± 0,12 mmol/L) e caempferol (0,4 ± 0,12 a 1,0 ± 0,16 mmol/L) se comportam de forma contrária, aumentando os seus níveis no sentido da frutificação. Através da análise de PCA foi possível diferenciar todos os extratos, demonstrando que o ciclo vegetativo está associado com diferenças claras na composição química, principalmente devido a variações na concentração de açúcares, compostos fenólicos e derivados do ácido quínico. O extrato (CsF210) originado das folhas no período da frutificação foi o mais distinto entre as amostras, sendo os sinais atribuídos aos derivados do ácido quínico, quercetina e caempferol responsáveis por esta discriminação. Os seis extratos foram capazes de relaxar a traqueia de cobaia pré-contraída com carbacol, sendo o extrato CsF210 (CE50 = 74,6 ± 7,9 μg/mL) mais potente em relação aos extratos CsF90 (CE50 = 231,6 ± 38,9 μg/mL) e CsF180 (CE50 = 239,7 ± 15,1 μg/mL) na presença de epitélio funcional. Não houve correlação entre o teor de alcaloides determinados por CLAE e a atividade espasmolítica dos extratos. Por outro lado, a análise por PLS demonstrou correlação entre os sinais de derivados dos flavonóis quercetina e caempferol e a potência espasmolítica dos extratos. Em conjunto nossos resultados demonstram pela primeira vez que os alcaloides bisbenzilisoquinolínicos warifteína e metilwarifteína não parecem estar envolvidos nas ações espasmolíticas dos extratos polares de Cissampelos sympodialis.

Submitted by Clebson Anjos (clebson.leandro54@gmail.com) on 2016-03-29T19:52:46Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2685795 bytes, checksum: 4ec45796766163ba90a711b655c68fbf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-29T19:52:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2685795 bytes, checksum: 4ec45796766163ba90a711b655c68fbf (MD5) Previous issue date: 2014-03-06 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Xylopia frutescens Aubl. species, popularly known as “embira”, “semente-de-embira” and “embira-vermelha”, is used in folk medicine as antidiarrhoeal. From leaves of these species was extract the essential oil (XF-OE), that in previous studies, showed spasmolytic activity on phasic contractions induced by CCh or histamine on guinea pig ileum. Considering this premise, the aim of this study was to characterize the mechanism of spasmoliytic action of XF-OE on intestinal smooth muscle. For this, were used functional and cellular methodologies. XF-OE inhibited cumulative concentration-response curves to histamine, and these were shifted to the right, in a non-parallel manner, with Emax reduction, discarding thus a competitive type antagonism and relaxed the guinea pig ileum contracted by KCl (40 mM) or histamine (10-6 M). How the relaxant potency of the essential oil was smaller in organ pre-contracted by KCl, it was hypothesized that XF-OE would be acting as a K+ channels positive modulator. In presence of CsCl (5 mM), a non-selective blocker of these channels, the relaxant potency of XF-OE was not altered, showed a non-participation of K+ channels on the essential oil spasmolytic effect. Thus, we decided to check whether the essential oil would prevent calcium influx through CaV, for this were obtained cumulative concentration-response curves to CaCl2 in depolarizing medium (70 mM KCl) nominally without Ca2+ in absence (control) and presence of different concentrations of XF-OE. The essential oil shifted to the right CaCl2 control curves, with reduction of its Emax, in addition to relaxed the ileum pre-contracted by S-(-)-Bay K8644 (3 x 10-7 M), a CaV1 selective agonist, demonstrating that the essential oil inhibited Ca2+ influx through CaV1. As the Ca2+ mobilization mechanisms into circular and longitudinal muscle layers are differentiated, it was hypothesized that XF-OE would preventing Ca2+ mobilization from intracellular stores in order to promote its spasmolytic effect. To test this hypothesis, in experiments with ileum circular layer, the essential oil antagonized phasic contractions induced by histamine (10-5 M), negatively modulates the Ca2+ release to exert their spasmolytic effect. In cellular experiments, the viability of longitudinal layer myocytes from guinea pig ileum was not altered in XF-OE (81 μg/mL) presence and the fluorescence intensity in these intestinal myocytes stimulated by histamine was reduced by the essential oil, indicating a [Ca2+]c reduction. Thus, the XF-OE spasmolytic action mechanism on guinea pig ileum involves blocking the Ca2+ influx, by CaV1, in addition to negative modulation of Ca2+ release mechanisms from intracellular stores, that lead to reduction of this ion cytosolic levels and consequently muscle relaxation. / A espécie Xylopia frutescens Aubl., conhecida popularmente como “embira”, “semente-de-embira” e “embira-vermelha”, é utilizada na medicina popular como antidiarreica. Das folhas dessa espécie foi extraído o óleo essencial (XF-OE), que, em estudos anteriores, apresentou atividade espasmolítica frente às contrações fásicas induzidas por CCh ou por histamina em íleo de cobaia. Diante dessa premissa, o objetivo desse trabalho foi caracterizar o mecanismo de ação espasmolítica do XF-OE em musculatura lisa intestinal. Para isso, foram utilizadas metodologias funcionais e celulares. O XF-OE inibiu as curvas concentrações-resposta cumulativas à histamina, desviando-as para a direita, de maneira não paralela e com redução do seu Emax, descartando um antagonismo do tipo competitivo, além de relaxar o íleo pré-contraído com KCl (40 mM) ou com histamina (10-6 M). Como a potência relaxante do óleo essencial foi menor quando as contrações foram induzidas por KCl, hipotetizou-se que o XF-OE estaria atuando como um modulador positivo de canais de K+. Na presença do CsCl (5 mM), bloqueador não seletivo desses canais, a potência relaxante do XF-OE não foi alterada, sendo descartada a participação dos canais de K+ no efeito espasmolítico do óleo essencial. Diante disso, decidiu-se verificar se o óleo essencial estaria inibindo o influxo de cálcio através dos CaV, para isso foram obtidas curvas concentrações-resposta cumulativas ao CaCl2 em meio despolarizante (KCl 70 mM) nominalmente sem Ca2+ na ausência (controle) e na presença de diferentes concentrações do XF-OE. O óleo essencial deslocou para a direita as curvas controle de CaCl2 com redução do seu Emax, além de relaxar o íleo pré-contraído com o S-(-)-Bay K8644 (3 x 10-7 M), um agonista dos CaV1, demonstrando que o óleo essencial inibe o influxo de Ca2+ através dos CaV1. Sendo os mecanismos de mobilização de Ca2+ em células musculares das camadas circular e longitudinal diferenciados, hipotetizou-se que o XF-OE estaria impedindo a mobilização de Ca2+ dos estoques intracelulares para promover seu efeito espasmolítico. Para testar essa hipótese, em experimentos utilizando a camada circular do íleo, o óleo essencial antagonizou as contrações fásicas induzidas por histamina (10-5 M), modulando negativamente a liberação de Ca2+ para exercer seu efeito espasmolítico. Nos experimentos celulares, a viabilidade dos miócitos da camada longitudinal do íleo de cobaia não foi alterada na presença do XF-OE (81 μg/mL) e a intensidade de fluorescência nos miócitos intestinais estimulados por histamina foi reduzida pelo óleo essencial, indicando a redução na [Ca2+]c. Assim, o mecanismo de ação espasmolítica do XF-OE em íleo de cobaia envolve bloqueio do influxo de Ca2+, via CaV1, além da modulação negativa dos mecanismos de liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, levando à redução dos níveis citosólicos desse íon e, consequente, relaxamento muscular.