Autosomal recessive spastic ataxia of Charlevoix Saguenay (ARSACS) is an early onset neurodegenerative disorder resulting from mutations in the SACS gene that encodes the protein sacsin. Sacsin is a 520kDa multi-domain protein localised at the cytosolic face of the outer mitochondrial membrane with suggested roles in proteostasis and most recently in the regulation of mitochondrial morphology. An excessively interconnected mitochondrial network was observed as a consequence of reduced levels of sacsin protein following SACS knockdown in neuroblastoma cells as well as in an ARSACS patient carrying the common Quebec homozygous SACS mutation 8844delT. Moreover, it was suggested that sacsin has a role in mitochondrial fission as it was found to interact with mitochondrial fission protein Dynamin related protein 1 (Drp1). The aim of this thesis was to explore sacsin’s role in the regulation of mitochondrial morphology and dynamics in non-Quebec ARSACS patients and sacsin knockdown fibroblasts. This study shows that loss of sacsin function promotes a more interconnected mitochondrial network in non-Quebec ARSACS patients and in sacsin knockdown fibroblasts. Moreover, recruitment of the essential mitochondrial fission protein Drp1 to the mitochondria was significantly reduced in ARSACS patient cells and in sacsin knockdown fibroblasts. This reduced recruitment of Drp1 to mitochondria also occurred when cells were treated to induce mitochondrial fission. Furthermore, both the size and intensity of Drp1 foci localised to the mitochondria were significantly reduced in both sacsin knockdown and patient fibroblasts. Finally, reduced ATP production, decreased respiratory capacity of mitochondria and an increase in mitochondrial reactive oxygen species demonstrated impaired mitochondrial function in ARSACS patient and sacsin knockdown fibroblasts. These results suggest a role for sacsin in the stabilisation or recruitment of cytoplasmic Drp1 to prospective sites of mitochondrial fission similar to that observed by other mitochondrial fission accessory proteins.

Sacsin, which is mutated in the neurodegenerative disease Autosomal Recessive Spastic Ataxia of Charlevoix-Saguenay (ARSACS), is a 520 kDa modular protein with regions of homology to molecular chaperones and domains linking to the ubiquitin proteasome system. This suggests a role in proteostasis. Previously, sacsin has been shown to partially localise with mitochondria, and loss of sacsin results in elongated and dysfunctional mitochondria. Moreover, alterations in neurofilaments have recently been reported in a mouse model of ARSACS. Despite these findings, pathophysiological mechanisms of ARSACS are poorly understood. The aim of this thesis was to elucidate the cellular role of sacsin by determining how loss of its function leads to the observed mitochondrial and intermediate filament defects. This hoped to shed light on the mechanism of disease in ARSACS. The results indicate that the mitochondrial elongation seen in ARSACS is likely due to reduced mitochondrial localisation of the essential fission factor DRP1. This may be mediated by loss of function of a complex involving sacsin and dynactin-6, a subunit of the dynein-dynactin motor complex, which has previously been shown to be required for DRP1 mitochondrial recruitment. DRP1-mediated mitochondrial fission is necessary for mitochondrial quality control; hence a disruption to mitochondrial quality control is likely to occur in sacsin deficient cells, which may explain the mitochondrial dysfunction in ARSACS. Furthermore, sacsin null cells display a dramatic collapse and perinuclear bundling of the vimentin intermediate filament network. This is coupled with the displacement of cellular organelles, particularly mitochondria, early endosomes and the Golgi, which accumulate at the periphery of the vimentin bundle. These are characteristic features of aggresome formation, indicating an aggregation of misfolded protein, which occurs due to disrupted proteostasis. Further supporting this, the proteostasis components ubiquitin, HSP70, LAMP2 and p62 are recruited to the perinuclear vimentin bundles. In summary, the findings of this thesis indicate a role for sacsin in mitochondrial and protein quality control, the dysfunction of which is likely to be particularly detrimental in neurons. Mitochondrial dysfunction along with protein misfolding and aggregation are implicated in many neurodegenerative diseases, and ARSACS is no exception.

ARSACS est une maladie neurodégénérative autosomique récessive caractérisée par une ataxie cérébelleuse, une paraplégie spastique et une polyneuropathie sensitivo-motrice démyélinisante. Le gène SACS, responsable de la maladie, a été identifié en 2000. Depuis, de nombreux cas ont été décrits dans le monde entier. Le gène SACS code pour la sacsine, dont la fonction reste inconnue malgré l’identification de nombreux domaines protéiques et surtout la description récente d’un rôle dans la physiologie mitochondriale. Les objectifs de ma thèse étaient d’identifier des mutations dans SACS au sein d’une large cohorte de patients atteints d’ataxie grâce à plusieurs collaborations puis d’étudier leurs effets au niveau du compartiment mitochondrial en utilisant essentiellement des cellules de malades. Nous avons pu identifier 2 variants de SACS dans 10% des cas analysés recrutés via le réseau international SPATAX. Nous avons parallèlement confirmé les mutations de SACS identifiées par séquençage haut-débit chez 5 autres patients via le PHRC ATAXIC et analysé un dernier cas porteur d’une délétion complète de SACS découverte par CGH-array pangénomique. Des cultures primaires de fibroblastes ont été obtenues chez 11 patients pour l’analyse fonctionnelle. Une altération de la morphologie des mitochondries a été observée chez tous les patients sauf un. Ces anomalies du réseau mitochondrial semblent très utiles pour cheminer vers le diagnostic d’ARSACS qui peut s’avérer complexe dans les situations non exceptionnelles où les résultats moléculaires sont délicats à interpréter (mutations faux-sens). Nous proposons une définition graduelle d’ARSACS reposant sur des critères cliniques, génétiques et cellulaires intégrant ces anomalies du réseau. Enfin, nous avons débuté l’exploration des mécanismes impliqués dans cette altération de la dynamique du réseau mitochondrial. Nos résultats préliminaires font évoquer une action potentielle de la sacsine au niveau du renouvellement des mitochondries. / ARSACS is a recessive autosomal neurodegenerative condition characterized by cerebellar ataxia, spastic paraplegia and demyelinating sensitivo-motor polyneuropathy. ARSACS is caused by mutations in the SACS gene identified in 2000. Since then, cases have been reported worldwide. SACS encodes sacsin, a protein of still unknown function in spite of the description of numerous protein domains and of a recent focus on a potential implication in the regulation of mitochondrial physiology. Aims of this thesis were to identify new mutations in a large population of ataxic patients and then to functionally analyze their cellular effects in the mitochondrial compartment. We identified 2 variants in SACS in 10% of analyzed cases collected through the international SPATAX network. We also confirmed mutations in SACS in 5 patients identified using next-generation sequencing in the ATXAIC project, and studied a last case harbouring a large deletion encompassing the entire SACS gene identified by pangenomic CGH-array. For functional analyses, primary cultures of fibroblasts were obtained in 11 patients. A drastic and recurrent alteration of the mitochondrial network was observed in all patients except one. These anomalies seem very useful for the diagnosis of ARSACS when molecular results are difficult to interpret (missense variants). We therefore propose a grading diagnostic definition using clinical, genetic and cellular criteria for ARSACS. Finally, we started to study the mechanistic of the mitochondrial function of sacsin. Our preliminary data may suggest a potential role at the mitochondrial turn over level.

Résumé : Introduction : L’ataxie récessive spastique de Charlevoix-Saguenay (ARSCS) est une maladie héréditaire dégénérative présentant un taux élevé de porteurs (1/22) au Saguenay-Lac-Saint-Jean, mais aussi retrouvée à l’échelle mondiale. Les personnes atteintes présentent des atteintes cérébelleuses (ataxie), neuropathiques (amyotrophie) et pyramidales (spasticité). L’ARSCS présente un portrait différent des autres types d’ataxies et il n’existe pas d’échelle de gravité spécifique pour évaluer la progression de la maladie ou évaluer l’efficacité d’un traitement. Méthodologie : Les objectifs de ce projet sont de développer et documenter les qualités métrologiques des items de la section pyramidale de l’échelle de gravité de l’ARSCS (Disease Severity Index for Autosomal Recessive Spastic Ataxia of Charlevoix-Saguenay, DSI-ARSACS). La section pyramidale a été élaborée à l’aide du modèle de développement de Streiner et Norman (2008). La planification et la construction ont été réalisées à l’aide d’une recension systématique des écrits et d’une consultation Delphi. La validité de construit (convergente et discriminatoire) et la fidélité (intraévaluateur et interévaluateurs [n=2]) ont été documentées. Vingt-huit (28) participants âgés de 18 à 59 ans ont été recrutés, selon un échantillonnage stratifié pour l’âge et le sexe. Le diagnostic devait être confirmé génétiquement. La validité convergente a été documentée avec des outils évaluant le contrôle moteur aux membres inférieurs (LEMOCOT), la gravité de la spasticité (SPRS), la mobilité (6MWT, 10mWT, échelle de Berg), le fonctionnement dans les activités quotidiennes (Index de Barthel), la participation sociale (MHAVIE) et la qualité de vie (SF-12v2). La validité discriminatoire a été documentée selon le sexe, le groupe d’âge et le stade de la maladie. La section pyramidale a été administrée à trois reprises par deux physiothérapeutes, à deux semaines d’intervalle, pour évaluer la fidélité intra/interévaluateurs. Résultats : La validité de contenu a été jugée adéquate par les experts du domaine. La validité de construit convergente est soutenue par des corrélations élevées avec les outils mesurant des concepts apparentés (r > 0,7, p = 0,00), à l’exception du SF-12v2 (r = 0,09-0,33). La validité de construit discriminatoire est appuyée par la capacité de distinguer les personnes atteintes en fonction des groupes d’âge et des stades de la maladie. La fidélité intra/interévaluateurs est excellente pour les items individuels (κ[indice inférieur w] = 0,68-0,96/0,60-0,95 sauf pour deux items κ[indice inférieur w] = 0,12 et 0,47) et pour le sous-total pyramidal (CCI = 0,94/0,88, p = 0,000). La cohérence interne (α = 0,85) témoigne de l’homogénéité des items pyramidaux. Conclusion : Le sous-total pyramidal du DSI-ARSACS a démontré une excellente validité de construit convergente et discriminatoire et une bonne fidélité. L’échelle de gravité permettra de mieux documenter l’évolution naturelle de la maladie. / Abstract : Introduction: Autosomal recessive spastic ataxia of Charlevoix-Saguenay (ARSACS) is a hereditary and degenerative illness that has a high carrier rate (1/22) in Saguenay-Lac-St-Jean (Quebec, Canada) but that is also found elsewhere around the world. Individuals with ARSACS have cerebellar impairments (ataxia), neuropathic impairments (amyotrophy) and pyramidal impairments (spasticity). ARSACS does not have the same characteristics as other forms of ataxia and there is currently no specific disease severity index (DSI) for it. Method: This project aimed to develop the items of the pyramidal section of the DSI-ARSACS and document their metrological properties. A literature review was conducted to identify ARSACS’ related impairments and existing scales measuring pyramidal impairments. Both items from known scales and new items were used to build a new scale that would assess the pyramidal impairments associated with ARSACS. The scale’s content validation was based on expert opinion. A consensus on the final scale composition was reached. Two physiotherapists administered the newly developed scale to 28 participants with a genetically confirmed ARSACS diagnosis in order to document the reliability of the pyramidal section of the DSI. Existing scales related to pyramidal impairments, mobility, social participation and quality of life were administered to assess convergent construct validity. The contrasting group method (age group, disease stage, gender) was used to assess discriminant validity. Results: Content validity was considered adequate by an expert panel that completed a Delphi process. The pyramidal section’s subscore was distributed normally and did not show a ceiling/floor effect. Convergent construct validity was supported by strong correlations with existing scales measuring related constructs (r > 0.7, p = 0.00), excluding SF-12 v2 (r = 0.09-0.33). Discriminant construct validity was supported by the scale’s ability to distinguish subjects according to age and disease stage. Intra/inter-rater reliability was excellent for individual items (κ[subscript w] = 0.68-0.96/0.60-0.95), except for two items (κ[subscript w] = 0.12 and 0.47), and also excellent for the section’s subscore (CCI = 0.94/0.88, p = 0.000). Internal consistency (α = 0.85) reflected the homogeneity of the pyramidal items. Conclusion: The pyramidal section’s subscore of DSI-ARSACS displayed excellent metrological properties (discriminative and convergent validity, reliability) during this initial validation. The index will lead to a better understanding of ARSACS’ natural history while also allowing for the categorization of subjects participating in future clinical trials.

Résumé : Introduction : L’ataxie récessive spastique de Charlevoix-Saguenay (ARSCS) est une maladie neuromusculaire héréditaire rare qui affecte notamment les voies spinocérébelleuses. Elle est caractérisée par une triple composante de signes et symptômes incluant l’ataxie et la dysarthrie (atteintes cérébelleuses), la spasticité aux membres inférieurs (atteintes pyramidales) et une faiblesse distale qui engendre des difficultés de préhension (atteintes neuropathiques). Des avancées récentes permettent de croire que des essais thérapeutiques seront bientôt possibles. Dans ce contexte, il est nécessaire de développer une échelle de gravité de la maladie pour permettre la sélection des patients et la documentation de l’histoire naturelle. But : L’objectif de ce projet était de développer les items de la section cérébelleuse du Disease Severity Index for Autosomal Recessive Spastic Ataxia of Charlevoix-Saguenay (DSI-ARSACS) et de documenter ses qualités métrologiques. Méthode : La section cérébelleuse a été élaborée à l’aide du modèle de développement de Streiner et Norman (2008) qui comprend trois grandes étapes : planification, construction et validation. La planification et la construction ont été réalisées à l’aide de consultations d’experts par la méthode Delphi et d’une recension systématique des écrits. La validité de construit (convergente et discriminatoire) et la fidélité (intra-évaluateur et inter-évaluateur) ont été documentées. Vingt-huit participants ont été recrutés selon un échantillonnage stratifié pour l’âge et le sexe. Ils devaient avoir un diagnostic confirmé génétiquement et être âgés entre 18 ans et 59 ans. La validité convergente a été documentée avec des outils évaluant les aptitudes motrices des membres supérieurs (9HPT, PPT, TDNS), la gravité de l’ataxie (SARA), la mobilité (6MWT, 10mWT, échelle de Berg), le fonctionnement dans les activités quotidiennes (Index de Barthel), la participation sociale (MHAVIE) et la qualité de vie (SF-12v2). La validité discriminante a été documentée selon le sexe, le groupe d’âge et le stade de la maladie. La section cérébelleuse a été appliquée à trois reprises par deux physiothérapeutes à deux semaines d’intervalle pour évaluer la fidélité intra et inter-évaluateurs. Résultats : La section cérébelleuse comporte 6 items d’évaluation liés aux fonctions motrices du cervelet. Le sous total de la section cérébelleuse est fortement corrélé avec la majorité des outils d’évaluation (r ≥ 0,69, p = 0,00), à l’exception du SF-12v2 (r ≤ 0,36, p ≥ 0,06). Une différence significative (p < 0,00) a été démontrée entre chaque groupe d’âge pour la majorité des items et le sous-total de la section cérébelleuse de l’échelle. Le résultat de chaque item et le sous-total de la section cérébelleuse augmentent significativement avec le stade de la maladie (p < 0,00). La fidélité intra et inter-évaluateurs correspond à un accord fort (κ ≥ 0,69) pour la majorité des items et le sous-total. Conclusion : Ce projet a permis de développer la section cérébelleuse de l’échelle de gravité DSI-ARSACS avec de bonnes qualités psychométriques (validité et fidélité). L’échelle pourra être utilisée dans le processus de catégorisation et d’évaluation des participants pour de futurs essais thérapeutiques. / Abstract : Introduction: Autosomal Recessive Spastic Ataxia of Charlevoix-Saguenay (ARSACS) is a rare hereditary neuromuscular disease that mainly affects the spinocerebellar tract. It is characterized by a triad of signs and symptoms, including ataxia and dysarthria (cerebellum impairment), spasticity in the lower limbs (pyramidal impairment) and a distal weakness leading to prehension difficulties (neuropathic impairment). Recent research advances suggest that clinical trials may soon become possible. In this context, it is necessary to develop a disease severity index in order to select patients and document natural history of disease. Objective: The project aimed to develop the items of the cerebellar section of the Disease Severity Index for Autosomal Recessive Spastic Ataxia of Charlevoix-Saguenay DSI-ARSACS and document their metrological properties. Method: The cerebellar section was developed using the Streiner and Norman (2008) model, which involves three stages: planning, construction and validation. The planning and construction stages were conducted by carrying out a literature review, obtaining expert opinions and completing a Delphi process. Construct validity (convergent and discriminant) and reliability (intra- and inter-raters) were documented. Twenty-eight participants between the ages of 18 and 59 were recruited using a stratified sampling method based on age and gender. All of them had a genetically confirmed diagnosis of ARSACS. Convergent validity was documented with measurements of upper limbs motor abilities (9HPT, PPT, TDNS), ataxia severity (SARA), mobility (6MWT, 10mWT, Berg scale), functional status in activities of daily living (Barthel index), social participation (MHAVIE) and quality of life (SF-12v2). Discriminant validity was documented according to gender, age group and disease stage. The cerebellar section was administered three times, two weeks apart, by two physiotherapists to assess intra- and inter-rater reliability. Results: The cerebellar section includes 6 assessment items linked to cerebellum motor functions. The cerebellar section subscore was strongly correlated with the majority of assessment tools (r ≥ 0.69, p = 0.00), excluding SF 12v2 (r ≤ 0,36, p ≥ 0,06). A significant difference (p < 0.00) was observed between each age group for most items and the subscore of the cerebellar section. Results on each item and the subscore significantly increase with disease stage (p < 0.00). Intra- and inter-rater reliability reflects a strong level of agreement (κ ≥ 0.69) on the majority of items and the subscore. Conclusion: The cerebellar section of the DSI-ARSACS shows good psychometric properties (validity and reliability). The index can be used to categorize and assess future participants in clinical trials.