Ce travail de thèse présente en détail la conception et le développement d'un actionneur microfluidique pour la distribution de fluide au travers d'une matrice de microaiguilles. Cet actionneur est un élément d'un projet de recherche européen, Angioskin, visant à réaliser le traitement d'une maladie de peau (le psoriasis) par injection d'ADN codant pour une protéine antiangiogénique. Le contexte médical de ce projet a imposé plusieurs contraintes sur les caractéristiques du système de distribution fluidique ; ce dernier doit permettre de manipuler de petites quantités de fluide tout en limitant les pertes, et assurer l'injection d'une quantité définie de produit de manière uniforme au travers d'une matrice de cent microaiguilles malgré des conditions d'injection variables. Enfin, il a aussi été nécessaire de s'assurer que les molécules d'ADN pouvaient circuler correctement, et surtout sans être dégradées, dans le microsystème afin de garder leurs propriétés thérapeutiques. Ce microsystème a été réalisé en PDMS, et est constitué d'un réseau de micro-réservoirs connectés par des canaux ainsi que plusieurs éléments de contrôle (valves, diode fluidique, résistance hydrodynamique). Ce système a fait l'objet d'un brevet européen (EP1852142).

Le thème principal de notre travail consistait en la mise en exergue de l'efficience de la mise en œuvre de techniques hybrides associant l’électrochimie à l’élément biologique (biocapteur) ou l’électrochimie aux performances de la spectrométrie de masse (couplage EC-MS). Les informations fournies, jointes aux résultats des mesures en voltampérométrie sur électrodes solides, permettent une bonne compréhension mécanistique quant au devenir oxydatif de substances médicamenteuses. Notre champ d'investigation s'est plus spécifiquement focalisé sur deux familles de molécules psychotropes (les phénothiazines, et une dibenzoazépine). Celles-ci connaissent un usage thérapeutique intensif et un regain d’intérêt pour des applications nouvelles, mais leur utilisation optimale souffre de l’existence d'effets secondaires physiopathologiques importants et dont l’étiologie est encore mal connue. En premier lieu, les résultats de la voltampérométrie cyclique et les différentes modulations en ligne d'une cellule électrochimique couplée à la détection par spectrométrie de masse, nous ont permis de mettre en évidence des différences essentielles dans le devenir des phénothiazines quant aux produits d'oxydations générés. Plus précisément, un comportement clairement distinct entre les phénothiazines garnies de deux (2C) ou trois carbones (3C) entre les deux azotes au niveau de leur chaîne latérale a pu être mis en évidence. Les phénothiazines 3C s'oxydent de manière classique en leur sulfoxyde correspondant. Par contre, les phenothiazines 2C, conjointement à la formation de leur sulfoxyde, souffrent dans des conditions énergiques d’oxydation (persulfate, potentiel élevé) d'une rupture de la chaîne latérale et libèrent la phénothiazine base aisément oxydable et donc subissant elle-même une oxydation. Au vu des structures moléculaires en trois dimensions, nous émettons l’hypothèse que volume trop important de la chaîne latérale des phénothiazines 2C empêcherait le déploiement aisé des structures aromatiques en un radical cation coplanaire lors du phénomène d'oxydation. Les tensions intrastructurelles apparues conduiraient au bris de la chaîne latérale. Différents modes d'oxydation (chimique, électrochimique, enzymatique) ont été utilisés et laissent chacun apparaître la dépendance directe entre la puissance de l'agent oxydant appliqué et les produits d'oxydation obtenus. Chaque technique de détection, de manière individuelle, a bien confirmé la dualité entre les deux groupes de molécules. La mise en commun des divers résultats nous a permis l'identification irrévocable des espèces intermédiaires instables et des composés finaux. Par corollaire, nous avons pu postuler un schéma général d'oxydation pour les dérivés phénothiaziniques. Il nous paraît intéressant de transposer nos résultats aux biotransformations des phénothiazines car les produits identifiés ne possèdent pas l'activité pharmacologique du composé parent mais présentent un profil toxicologique bien répertorié dans la littérature. Nos résultats suggèrent d’approfondir les études de biotransformation afin de déterminer si ‘l’éclatement’ oxydatif des phénothiazines 2C est également observé in vivo. Une relation cause/effet de ces métabolites pourrait ainsi être établie. En deuxième point, au travers de l'association CE/SM ou CE/CL/SM, nous avons étudié l’électroxydation de la clozapine. La génération et l'identification des principaux métabolites de phases I et II, illustre un mimétisme certain avec le CYP450, et nous a permis de confirmer de nombreuses données de la littérature quant à l'oxydation in vivo et in vitro de la clozapine. L'oxydation électrochimique ne génère cependant pas l'ensemble des réactions de métabolisation prises en charge par le système CYP450. Lors de la combinaison CE/SM, par l'absence de séparation chromatographique dans cette configuration, le spectre de masse présente un pic correspondant à un intermédiaire à demi-vie courte, difficilement et rarement mis en évidence: l'ion nitrénium. Cette espèce hautement réactive envers les fonctions thiols des petites molécules et des protéines, se trouve très régulièrement tenue pour responsable majeur de la toxicité avérée de la clozapine. L'apparition plus abondante de dérivés déméthylés démontre l'influence du potentiel appliqué à l'électrode de travail lors de l'oxydation électrochimique. En effet, les processus de déméthylation nécessitent des potentiels élevés pour être observés. En présence de glutathion, aux différents pics antérieurement identifiés, des pics supplémentaires relatifs à la formation d'adduits de GSH sur la CLZ apparaissent. Les courbes voltampérométriques réalisées sur la clozapine suggèrent la distinctement la formation de l'ion nitrénium et d'une nouvelle espèce aisément électroréduite, probablement une structure quinone imine. L'addition de GSH provoque la disparition des pics de réduction de la CLZ. Ces comportements en VC corroborent les interprétations issues des mesures par couplage EC/CL/SM. La dernière partie de notre travail a consisté en la construction d'un biocapteur à pâte de carbone solide avec inclusion au sein de cette matrice de peroxydase de raifort. Basé sur la capacité reconnue de l'HRP à reproduire in vitro des produits d'oxydation similaires à la métabolisation in vivo, nous avons exploité un tel biocapteur pour l'analyse de la clozapine et de composés thiols. Une compréhension fine du mécanisme opérationnel intrinsèque du biocapteur a pu être suggérée. La génération à la surface de l'électrode de l'ion nitrénium par oxydation enzymatique de la clozapine par l'HRP, suivie de sa réduction immédiate fournit un courant ampérométrique substantiel. Sous des conditions de pH optimales, ce courant de réduction autorise la détermination quantitative de la clozapine dans un domaine de linéarité compris entre 1 x 10-5 M et 1 x 10-6 M. L'addition de composés thiols dans le milieu occasionne une chute de courant par action de ceux-ci sur la structure radical cation ou nitrénium par addition nucléophile. La disparition de l'ion nitrénium et la formation d'un adduit GSH-CLZ inhibent tout processus de réduction à l'électrode du biocapteur. Cette diminution de courant proportionnelle aux concentrations en thiols introduits, permet la détermination quantitative de dérivés thiols. Les courbes de calibration exprimées en pourcentage d'inhibition conduisent facilement à l'évaluation de la constante d'inhibition (Ki) et de CI50. L'étude de la réponse ampérométrique de la clozapine à l'EPC/HRP en l'absence ou présence d'un dérivé thiol envisagé permet la détermination de Km et de caractériser le type d'inhibition qui entre en jeu. De tels paramètres cinétiques nous ont habilités à classer les thiols considérés en fonction de leur puissance réactionnelle envers les substances oxydées de la clozapine. Au terme de ce travail, nous espérons avoir illustré, par l’étude de quelques molécules modèles, l’intérêt de la mise en œuvre des techniques électrochimiques couplées à l’élément biologique ou à la spectrométrie de masse. Des améliorations au niveau de la cellule électrochimique sont envisageables par l’emploi d’électrodes modifiées, elles laissent entrevoir la possibilité de mimer totalement le système CYP450. Les résultats fournis par ces techniques hybrides et par voltampérométrie cyclique sont complémentaires, ils procurent un éventail d'informations d'une utilité estimable pour une application dans des études prédictives précoces de candidats médicament.

voir résumé à l'intérieur du pdf

L'objectif de ma thèse est d'étudier des oligonucléotides et mononucléotides par de nouvelles techniques de fragmentation comme l'EDD (Electron-Detachment-Dissociation) et l'EID (Electron-Induced-Dissociation) qui font intervenir un bombardement d'électrons. Les échantillons sont d'abord ionisés par une source electrospray (ESI) qui permet une ionisation douce. Au cours de mon travail de thèse, je me suis intéressé à l'étude de petits oligonucléotides (ADN et ARN simples brins) et de mononucléotides par EDD et EID. Tout d'abord nous optimisons les différents paramètres qui ont permis d'obtenir en ESI les espèces multichargées pour étudier les processus EDD, EID d'oligonucléotides à des états de charge différents, afin d'obtenir le maximum d'ions fragments. Ces spectres seront comparés avec les spectres SORI-CID (Collision-Induced-Dissociation) et IRMPD (Infrared-Multiphoton-Dissociation) pour mettre en évidence les spécificités de l'EDD et EID par rapport au SORI-CID. Les spectres EDD et EID montrent quelques ions fragments qui ne sont pas observés dans les spectres SORI-CID et IRMPD parce que ces derniers ne conduisent pas aux ions radicalaires. Grâce aux ions fragments radicalaires obtenus en EDD et en EID, nous avons pu accéder au séquençage d'oligonucléotides riches en thymine pour lesquels il est difficile d'obtenir des informations par les méthodes conventionnelles. Enfin nous avons utilisé des techniques particulières de la technologie ICR et qui seront présentées dans ce manuscrit

La différentiation entre le « soi » et le « non-soi » est un processus biologique essentiel à la vie. Les peptides endogènes présentés par les complexes majeurs d’histocompatibilité de classe I (CMH I) représentent le fondement du « soi » pour les lymphocytes T CD8+. On donne le nom d’immunopeptidome à l’ensemble des peptides présentés à la surface cellulaire par les molécules du CMH I. Nos connaissances concernant l’origine, la composition et la plasticité de l’immunopeptidome restent très limitées. Dans le cadre de cette thèse, nous avons développé une nouvelle approche par spectrométrie de masse permettant de définir avec précision : la nature et l’abondance relative de l’ensemble des peptides composant l’immunopeptidome. Nous avons trouvé que l’immunopeptidome, et par conséquent la nature du « soi » immun, est surreprésenté en peptides provenant de transcrits fortement abondants en plus de dissimuler une signature tissu-spécifique. Nous avons par la suite démontré que l’immunopeptidome est plastique et modulé par l’activité métabolique de la cellule. Nous avons en effet constaté que les modifications du métabolisme cellulaire par l’inhibition de mTOR (de l’anglais mammalian Target Of Rapamycin) provoquent des changements dynamiques dans la composition de l’immunopeptidome. Nous fournissons également la première preuve dans l’étude des systèmes que l’immunopeptidome communique à la surface cellulaire l’activité de certains réseaux biochimiques ainsi que de multiples événements métaboliques régulés à plusieurs niveaux à l’intérieur de la cellule. Nos découvertes ouvrent de nouveaux horizons dans les domaines de la biologie des systèmes et de l’immunologie. En effet, notre travail de recherche suggère que la composition de l’immunopeptidome est modulée dans l’espace et le temps. Il est par conséquent très important de poursuivre le développement de méthodes quantitatives au niveau des systèmes qui nous permettront de modéliser la plasticité de l’immunopeptidome. La simulation et la prédiction des variations dans l’immunopeptidome en réponse à différents facteurs cellulaires intrinsèques et extrinsèques seraient hautement pertinentes pour la conception de traitements immunothérapeutiques. / Self/non-self discrimination is a fundamental requirement of life. Endogenous peptides presented by major histocompatibility complex class I (MHC I) molecules represent the essence of self for CD8 T lymphocytes. These MHC I peptides (MIPs) are collectively referred to as the immunopeptidome. Very little is known about the origin, composition and plasticity of the immunopeptidome. Here, we developed a novel high-throughput mass spectrometry approach that yields an accurate definition of the nature and relative abundance of peptides presented by MHC I molecules. Surprisingly, we found that the immunopeptidome, and therefore the nature of the immune self, is biased toward peptides derived from highly abundant transcripts and conceals a tissue-specific signature. Then, we showed that the immunopeptidome is plastic and moulded by cellular metabolic activity. In fact, we found that altering cellular metabolism via the inhibition of the mammalian target of rapamycin (mTOR) results in dynamic changes in the cell surface MIPs landscape. Importantly, we provide the first systems-level evidence that the immunopeptidome projects at the cell surface a faithful representation of biochemical networks and metabolic events regulated at multiple levels inside the cell. Our discoveries open up new perspectives in systems biology and immunology. Indeed, our work suggests that the composition of the immunopeptidome is modulated in space and time. Therefore, it is imperative to further develop and exploit systems-level quantitative methods that will enable modelling of the immunopeptidome’s plasticity. Simulating and predicting variations in the immunopeptidome in response to cell-intrinsic and -extrinsic factors could be relevant to numerous contexts, including the rational design of immunotherapeutic interventions.

La mise en œuvre d'une technique d'analyse par "désorption en programmation de température" a permis de dénombrer 6 états énergétiques distincts de l'oxygène adsorbé à la surface de l'oxyde de nickel. En réalisant une étude systématique, il a été ainsi possible de définir les conditions d'existence de chacune de ces espèces et de suivre leurs cinétiques d'adsorption à différentes températures. Les résultats obtenus ont été exploités pour préparer divers échantillons de NiO en maîtrisant parfaitement la nature des espèces oxygénées adsorbées. Ceci a permis d'étudier sélectivement les propriétés de chaque espèce et de préciser son rôle dans un certain nombre de réactions de surface telles que la sulfatation de l'oxyde de nickel en présence de dioxyde de soufre gazeux.

Les nitrosamines constituent une famille de composés posant un risque pour la santé des gens. Depuis la fin des années cinquante, 90% des nitrosamines ont été prouvées ou suspectées cancérogènes pour l'homme. Ces substances peuvent être retrouvées dans l'air, entre autres dans les milieux de travail. Les concentrations les plus importantes de nitrosamines volatiles ont été retrouvées dans les procédés de fabrication du caoutchouc. La valeur d'exposition admissible (VEA) recommandée par l'Institut national de santé publique du Québec (INSPQ) dans une revue de littérature récente est de 1 μg/m3 de nitrosamines. Les faibles concentrations à analyser demandent donc des outils et des méthodes d'analyse hautement spécifiques et sensibles. Depuis 2007, les laboratoires de l'IRSST ont effectué un important développement qui a permis de mettre au point une méthode d'analyse de huit nitrosamines dans l'air par chromatographie gazeuse avec détecteur azote phosphore (CG-DAP). Cependant, cette méthode peut parfois présenter des limitations quant à sa spécificité. Le spectromètre de masse étant très sélectif et sensible à la fois, une méthode couplant la chromatographie liquide à la spectrométrie de masse (CLHP-MS) a été développée dans le but de doser de basses concentrations de nitrosamines dans l'air. L'échantillonnage s'effectue avec le tube adsorbant développé par l’INRS (France). La méthode de désorption mise au point permet une récupération moyenne de 96,00 ± 0,08 %. Les limites de quantification obtenues lors des validations préliminaires de la méthode d'analyse par CLHP-MS varient de 0,03 μg/m3 à 0,09 μg/m3 selon la nitrosamine. Les valeurs obtenues représentent respectivement 3 % à 9 % de la norme recommandée par l'INSPQ pour 800 L de volume d'air échantillonné (400 minutes d'échantillonnage à 2 L/min). Le domaine d'applicabilité de la méthode est de 0,07 μg/m3 à 1,75 μg/m3 ce qui couvre les concentrations visées par l'INSPQ. Les résultats démontrent une détection spécifique et sensible des nitrosamines. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Nitrosamines, CLHP-MS, Analyse de l'air, Caoutchouc, GC-DAP.

Cette étude s'inscrit dans une problématique globale d'analyse en ligne de la composition chimique de l'Aérosol Organique Secondaire (AOS) pour une meilleure compréhension de sa formation et de son vieillissement, à travers le développement d'un spectromètre de masse à désorption thermique et ionisation chimique : le TDCIAMS. La caractérisation des performances de cet instrument, ainsi que l'étude de l'AOS formé par ozonolyse de l'a- pinène en chambre de simulation atmosphérique (CSA) ont montré que le TDCIAMS est bien adapté à l'analyse quantitative de l'AOS formé en CSA. Les données recueillies par le TDCIAMS permettent d'accéder à des informations essentielles concernant les mécanismes de formation et l'évolution de l'AOS. De plus, l'étude de l'AOS formé par ozonolyse de deux composés d'origine anthropique (2-méthylstyrène et indène), peu étudiés jusqu'alors, a été comparée avec celle réalisée par une analyse off-line (SFE-GC-MS).

La physico-chimie et l'évolution des différents milieux qui constituent le milieu interstellaire<br />dépendent étroitement de H2, son principal constituant moléculaire. En particulier,<br />la connaissance incomplète du bilan énergétique et de l'efficacité de la réaction de<br />formation d'hydrogène moléculaire par catalyse hétérogène sur les grains de poussière est<br />une source importante d'incertitude dans la description de la dynamique du milieu, notamment<br />lors de la formation d'étoiles. L'´etude de cette réaction et de ses sous-processus<br />(collage et diffusion sur les grains, désorption) est abordée théoriquement et expérimentalement<br />depuis plus de 40 ans.<br />Cette thèse vise par une approche expérimentale à caractériser la réaction de formation<br />d'hydrogène moléculaire à la surface des glaces d'eau. Elle s'articule autour du<br />dispositif FORMOLISM. Ultravide, cryogénie, jets atomiques, spectrométrie de masse<br />et spectroscopie UV sont réunis pour étudier en particulier les effets de l'hétérogénéité<br />et de la porosité de la surface. L'étude de la désorption de l'hydrogène moléculaire s'est<br />révélée indispensable à l'interprétation des expériences de formation. Nous avons mesuré les distributions d'énergies d'adsorption de H2, HD et D2. Ces mesures permettent<br />d'estimer la quantité d'hydrogène moléculaire en surface des grains interstellaires. La<br />présence d'hydrogène moléculaire modifie l'efficacité de la réaction. Un mécanisme de<br />ségrégation isotopique a été mis en évidence et son importance pour la deutération de<br />l'hydrogène moléculaire en surface des manteaux de glace a été étudiée. Les expériences<br />sur la formation révèlent que sur les glaces poreuses l'énergie dégagée par la réaction est<br />transmise à la surface par la rétention des molécules formées. La réaction reste efficace<br />à des températures plus élevées (20 K) que sur les glaces non poreuses (13 K). Sur ces<br />dernières, les molécules formées sont directement libérées en phase gazeuse où elles sont<br />détectées dans des états rovibrationnellement excités.

Cette étude a pour but l'étude de l'os minéralisé et de sa matrice par spectrométrie d'absorption infrarouge. L'os est un tissu conjonctif qui constitue, avec le cartilage, le squelette. Les os assurent trois fonctions: (1) support mécanique et site d'attachement du muscle pour la locomotion, (2) protectrice pour les organes vitaux. et la moelle osseuse et (3) métabolique : Réserve ionique pour tout l'organisme, spécialement en calcium et en phosphate. Les constituants fondamentaux des tissus conjonctifs sont les cellules et la matrice extracellulaire. Cette dernière est particulièrement abondante dans l'os et se compose de fibres de collagène, de protéines non collagéniques et de substances non protéiniques. Cette matrice a la possibilité de se calcifier. Anatomiquement on peut distinguer deux types d'os dans le squelette : les os plats (côte, mandibule, iliaque ... ) et les os longs (tibia, fémur, humérus) qui dérivent de deux types distincts d'histogénèses (intramembranaire et endochondrale) bien que le développement et la croissance des os longs comportent les deux types à la fois.