L'endocytose dépendante de la clathrine (EDC), c’est-à-dire la formation de vésicules recouvertes de clathrine (VRC) à partir de la membrane plasmique, est un processus essentiel dans les cellules eucaryotes. Au cours de l’EDC, la GTPase dynamine est recrutée au cou de la VRC naissante où elle s'oligomérise en hélice. Les changements de conformation induits par l'hydrolyse du GTP catalysent la scission du cou vésiculaire. Ce processus a été étudié en détail par reconstitution in vitro sur des tubules membranaires, mais il doit être établi dans des cellules vivantes, où les interactions de la dynamine avec d'autres protéines comme l'amphiphysine sont critiques. L'imagerie TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) avec le protocole pH pulsé (ppH) sur cellules vivantes permet la détection de la formation de VRC avec une résolution spatiale (~100 nm) et temporelle (2 s) élevée. Ce protocole a révélé que la dynamine présente un recrutement biphasique aux puits recouverts de clathrine (PRC) en maturation avec un pic au moment de la scission mais les paramètres de son recrutement dans les cellules vivantes restent peu clairs. Pour déterminer ces paramètres, j’ai utilisé des techniques d’imagerie sur cellules vivantes pour étudier le recrutement de la dynamine à l’échelle globale et à l’échelle de la molécule unique lors de perturbations aiguës de sa fonction. Mes résultats de thèse ont montré que la dynamine est recrutée à la membrane plasmique, diffuse à l'extérieur des PRC et y est transitoirement piégée. De plus, j’ai déterminé avec des dynamines mutées (1) que le domaine PRD de la dynamine est crucial pour son recrutement aux PRC ; (2) que le domaine PH est important pour la scission vésiculaire mais par pour son recrutement aux PRC ou à la membrane plasmique. Enfin, j’ai observé que la dynamine s'échange en permanence avec un pool extra-PRC, ce qui permettrait son recrutement ultérieur par l'ajout de nouveaux sites de liaison et sa capacité à rétrécir le cou des vésicules suite à l’hydrolyse du GTP. En conclusion, ces données suggèrent qu’aux PRC, les molécules de dynamine (1) sont constamment échangées ; (2) diffusent à des taux similaires tout au long du processus de formation, maturation et scission des vésicules; et (3) l'activité GTPase de la dynamine contribue à la maturation et à la scission des VRC. / Clathrin-mediated endocytosis (CME), the formation of clathrin-coated vesicles (CCV) from the plasma membrane, is an essential process in eukaryotic cells. During CME, the GTPase dynamin is recruited to the neck of nascent CCV where it oligomerizes into helical filaments. Conformational changes induced by the hydrolysis of GTP catalyze the scission of the vesicle neck. This process has been studied in detail with in vitro reconstitution on membrane tubules but it needs to be established in living cells, where interactions between dynamin and other proteins such as amphiphysin are critical. Live cell total internal reflection fluorescence (TIRF) imaging with the pulsed pH (ppH) assay allows the detection of CCV formation with high spatial (~100 nm) and temporal (2 s) resolutions. It has revealed that dynamin is recruited to maturing clathrin-coated pits (CCP) in two phases with a peak at the time of scission but the parameters of its recruitment in living cells remain unclear. To determine these parameters, we have performed live cell imaging of dynamin recruitment at collective and single molecule levels during acute perturbations of its function. My PhD results showed that dynamin is recruited to the plasma membrane, diffuses outside of CCP and is trapped at CCP. Furthermore, we determined with mutated dynamins that (1) the PRD domain of dynamin is crucial for its recruitment at CCP; (2) the PH domain is important for vesicular scission but not for recruitment to CCP or to the plasma membrane. Finally, I observed that dynamin exchanges with an extra-CCP pool at all times: this would allow for its further recruitment by addition of new binding sites and its ability to narrow the vesicle neck after GTP hydrolysis. Altogether, these data suggest that in CCP dynamin molecules (1) are constantly exchanged; (2) diffuse at similar rates throughout the entire process of vesicle formation, from maturation until scission; and (3) that dynamin’s GTPase activity contributes to CCP maturation and scission.

Le VIH-1 présentent une menace pour la santé publique car aucune thérapie antivirale efficace n’existe encore ciblant les étapes tardives de leur réplication. Au cours de ma thèse, j’ai choisi de m’intéresser aux mécanismes d'assemblage de ce rétrovirus bourgeonnant de la membrane plasmique des cellules infectées. Dans un contexte cellulaire, j’étudierais les étapes tardives de la réplication du VIH-1, en particulier, à la régulation de la dynamique membranaire modulée au cours de l’assemblage du HIV-1 grâce à des techniques de pointe en microscopie de fluorescence à haute résolution. Ainsi, nous chercherons à comprendre les mécanismes moléculaires et les facteurs cellulaires, protéiques ou lipidiques, impliqués dans l’assemblage et le bourgeonnement du HIV-1 dans les cellules hôtes, le lymphocyte T CD4+ / HIV-1 presents a threat for the public health because either no vaccine or no effective antiviral therapy still exists targeting the late stages of their replication. During my thesis, I chose to be interested in the mechanisms of assembly of this burgeoning retrovirus of the plasmic membrane of the infected cells. In a cellular context, I would study the late stages of the replication of the HIV 1, in particular, in the regulation of the dynamics membranaire modulated during the assembly of the HIV-1 thanks to state-of-the-art techniques in microscopy of high-resolution fluorescence. So, we shall try to understand the molecular mechanisms and the cellular, protein or lipid factors, involved in the assembly and the budding of the HIV-1 in hosts cells, the lymphocyte T CD4 +

Il est bien admis que la compréhension de la structuration moléculaire à l’intérieur des cellules neuronales est essentielle pour appréhender le fonctionnement du cerveau. Pour cette raison, l’étude de l’organisation des molécules clés neuronales et synaptiques contribue grandement à comprendre le mystère du cerveau. AMPA sont des récepteurs ionotropiques du glutamate jouent le rôle central dans la plasticité synaptique et la transmission synaptique basale dans le système nerveux central. Distribution des récepteurs AMPA sur la membrane neuronale est remarquablement hétérogène. Ils sont organisés en agrégats fonctionnels distincts, appelés nanodomaines. Des travaux antérieurs ont montré que Neuroligin, la molécule d’adhésion post-synaptique, ancres récepteurs AMPA par PSD95 dans la membrane post-synaptique et constitue en même temps un complexe d’adhésion trans-synaptique avec présynaptique Neurexin, impliqué dans le recrutement de machines de libération vésiculaire sur le site présynaptique. De cette façon, NRLG fonctionnellement organise synapses par la poste de recrutement de molécules présynaptiques essentielles pour réponse synaptique. Ici, nous avons étudié l’effet de la modulation de NRLG1 (modification du niveau d’expression ou de l’activité) sur le dynamique et nano-organisation des récepteurs AMPA au niveau des synapses individuelles. Notre hypothèse est que le complexe NRX-NRG pourrait être impliquée dans la localisation précise des récepteurs post-synaptiques et son apposition avec zone active présynaptique, jouant ainsi le rôle important dans la transduction du signal approprié. Taille de la densité post-synaptique (PSD) est de l’ordre de 500 nm, alors que diamètre moyen des nanodomaines AMPAR 100 nm. Une telle petite dimension nécessitait l’application de techniques de microscopie de super-résolution, dont la résolution de l’ordre de 20-40 nm est presque un ordre de grandeur mieux que microscopie fluorescence limitée par la diffraction. Nanoscopie fluorescence permettent visualiser des cellules jusqu’au niveau presque moléculaire. Pour atteindre mes objectifs, j’ai mis en place différents nanoscopies de localisation d’une seule molécule, qui s’appuient sur séparés dans l’espace et le temps de détection de population choisi de sondes de fluorescence. Il a été proposé que le trafic membranaire des récepteurs de neurotransmetteurs peut contribuer à la modulation de l’efficacité synaptique. J’ai sondé propriétés diffusionnelles des récepteurs AMPA avec suivi de particules unique, qui a été pendant longtemps appliqué pour sonder l’hétérogénéité de la membrane cellulaire. Localisation relative des biomolécules à la base de la compréhension de leur relation fonctionnelle. Il est bien admis que la juxtaposition de deux objets, ainsi que leur colocalisation, peuvent témoigner de leur association. Avec les récents développements dans l’acquisition multi couleur de la molécule unique et images de super-résolution à base d’ensemble, il est maintenant possible d’explorer la colocalisation à l’échelle nanométrique entre biomolécules dans des cellules vivantes et fixe. Malgré l’ la popularité et l’application très répandue, il n’existe que quelques paradigmes d’analyse quantitative pour la colocalisation des images multicolores super-résolution. Ici, avec l’aide de paradigmes conventionnels de mesure de la colocalisation et statistiques multivariées, nous analysons et présentons en isolement l’échelle du détail et proximité des macromolécules au sein de zones fonctionnelles de synapses. En outre, nous utilisons ces paradigmes pour évaluer marqueurs fluorescents impliqués dans la production de routine de la molécule unique fondée images super-résolution. Nous étendons notre analyse élucider en profondeur le co-agrégation des molécules clés synaptiques, PSD95 et récepteurs AMPA, qui sont impliqués dans l’organisation synaptique et transmission basale. / The brain is made of complex networks of interconnected neuronal cells. All our mental activities are underlain by electrochemical signals passing through dedicated neuronal circuits. Climbing further up on the complexity ladder, information processing by neurons is performed by multiple molecules assembling and interacting together. It is well accepted that the understanding of the molecular structuring inside neuronal cells is essential to apprehend functioning of the brain. For this reason, study of the organization of the key neuronal and synaptic molecules greatly contributes to understand the mystery of the brain. AMPA receptors (AMPARs) are ionotropic glutamate receptors that play a central role in synaptic plasticity and basal synaptic transmission in the central nervous system. The distribution of AMPARs on the neuronal membrane is remarkably heterogeneous. They are organized in distinct functional aggregates, called nanodomains. Previous work demonstrate that the postsynaptic adhesion molecule Neuroligin (NRLG) anchors AMPARs through PSD-95 in the postsynaptic membrane while simultaneously forming a trans-synaptic adhesion complex with presynaptic Neurexin (NRX), and recruiting vesicular release machinery at the presynaptic site. In this way, NRLG functionally organizes synapses by recruiting post and pre-synaptic molecules essential for regulation of synaptic responses. Here we studied the effect of NRLG modulation (modification of expression level or activity) on AMPAR nano-dynamics and nano-organization at individual synapses. Our hypothesis is that the NRX-NRLG complex could be involved in the precise localization of postsynaptic receptors and their apposition with the neurotransmitter release sites in the presynaptic active zone, thus playing important role in proper signal transduction. The size of the postsynaptic density (PSD) is in the order of 500 nm, whereas the average diameter of AMPAR nanodomains 100 nm. Such small dimension necessitated the application of super-resolution microscopy techniques, whose resolution in the range of 20-40 nm is almost an order of magnitude better than diffraction limited fluorescence microscopy. Probe-based far-field fluorescence nanoscopies allow visualizing cells down to almost molecular level. To achieve my goals, I implemented different single-molecule localization nanoscopies which rely on the detection of selected populations of fluorescence probes that are separated in space and time. It was proposed that membrane trafficking of neurotransmitter receptors may contribute to modulation of synaptic efficacy. I have probed diffusional properties of AMPARs with single particle tracking, which has long been applied to probe heterogeneity of the cell membrane. Relative localization of biomolecules provides the basis for understanding their functional relationship. It is well accepted that the juxtaposition of two objects, as well as their colocalization, may give evidence of their association. With the recent developments in multi-color acquisition of single molecule and ensemble based super resolution images, it is now possible to explore the colocalization at the nanoscale between biomolecules in live and fixed cells. Despite the popularity and wide spread application of super resolution imaging, there exist only a few quantitative analysis paradigms for the colocalization of multicolor super-resolution images. Here, with the aid of conventional colocalization measurement paradigms and multivariate statistics, we analyze and report in detail the scale segregation and proximity of macromolecules within functional zones of synapses. Furthermore, we use these paradigms to evaluate fluorescent tags involved in the routine generation of single molecule based super-resolution images. We extend our analysis to elucidate in depth the co-aggregation and clustering of two key synaptic molecules, PSD95 and AMPARs, which are involved in basal synaptic organization and transmission.