No description available.

Extensive experience-dependent refinement of cortical circuits is restricted to critical periods of plasticity early in life. The timing of these critical periods is tightly regulated by the relative levels of excitatory and inhibitory (E/I) neurotransmission during development. Genetic disruption of synaptic proteins that normally maintain E/I balance can result in severe behavioral dysfunction in neurodevelopmental disorders like autism, but the mechanisms are unclear. We propose that abnormal critical periods of sensory circuit refinement could represent a key link between E/I imbalance and the cognitive and behavioral problems in autism.

No description available.

No description available.

No description available.

No description available.

xi, 111 p. : ill. (some col.) / Excitatory glutamatergic synapses facilitate important aspects of communication between the neurons that govern complex forms of behavior. Accordingly, small differences in the molecular composition of glutamatergic synapses have been suggested to underlie neurodevelopment disorders, drive evolutionary changes in brain function and behavior, and enhance specific aspects of cognition in mammals. The appropriate development and later function of these structures in the adult involves the wellcoordinated activities of hundreds of molecules. Therefore, an important goal in neuroscience is to identify and characterize how specific molecules contribute to the development of excitatory synapses as well as how manipulations of their function impact neural systems and behavior throughout life. This dissertation describes two important contributions toward this effort, (1) that the newly discovered molecule, Synaptic Cell Adhesion Molecule 1 (SynCAM1) specifically contributes to the early stages of glutamatergic synapse formation and (2) that Neuroligin1 (NL1) contributes to the mature function of glutamatergic synapses and mature forms of behavior in vivo. In the first set of experiments, I developed an in vitro cell based assay in order to determine the minimal molecular components necessary to recruit developmentally relevant glutamate receptor subtypes to sites of adhesion mediated by SynCAM1. In these experiments we discovered that protein 4.1B interacted with SynCAM1 in order to cause the specific recruitment of the NMDA type glutamate receptor containing the NR2B subunit. In the second set of experiments, we show that expression of NL1 missing the terminal 55 amino acids enhanced short term learning and flexibility in behaving mice while increasing the number of immature excitatory postsynaptic structures. Interestingly, this behavioral profile had components more consistent with 1 month old juvenile controls than age matched control littermates. In contrast, full length NL1 overexpression impaired learning and enhanced perseverance while yielding an increase in the proportion of synapses with mature characteristics. These results suggest that NL1's C-terminus drives the synaptic maturation process that shapes the development of complex behavior. Both studies bolster our understanding of how specific molecules impact the development of excitatory synapses and complex behavior. This dissertation includes both my previously published and unpublished co-authored material. / Committee in charge: William Roberts, Chairperson; Philip Washbourne, Advisor; Victoria Herman, Member; Michael Wehr, Member; Judith Eisen, Member; Clifford Kentros, Outside Member

No description available.

En état de douleur chronique, la sensibilisation centrale s’accompagne d’une modification de l’équilibre excitation/inhibition en faveur d’une excitation accrue de la corne dorsale de la moelle épinière. Cet équilibre implique des molécules d’adhérence telles que les neuroligines postsynaptiques (NLs). Dans une première partie de notre travail de thèse, nous avons étudié la régulation éventuelle de ces protéines dans un modèle de douleur neuropathique (Spinal Nerve Ligation, SNL) chez le rat. Nos données ont montré une surexpression inattendue de la NL2, généralement associée à l’inhibition, alors que l’expression de la NL1, généralement associée à l’excitation, ne change pas. Le blocage de l’expression de NL2 in vivo par application intrathécale de siRNA, a produit des effets anti-nociceptifs réversant de façon significative l’allodynie mécanique observée chez les rats SNL. L’étude ultérieure des partenaires pré- et postsynaptiques de NL2, a démontré une co-variation spécifique avec PSD95, une protéine d’échafaudage des synapses excitatrices. De plus, une approche par co-immunoprécipitation a mis en évidence une augmentation significative des interactions protéiques NL2 /PSD95 chez les rats SNL. Enfin, cette association inhabituelle en condition neuropathique, est apparue liée à la surexpression spécifique de NL2(-), un variant d’épissage de NL2 normalement minoritaire en condition physiologique. La surexpression, l’augmentation d’association avec PSD95, et l’effet pro-nociceptif inattendu de la NL2 « inhibitrice » en condition de douleur neuropathique, indiquent une permutation fonctionnelle de la NL2 de l’inhibition vers l’excitation modifiant le rapport synaptique en faveur d’une excitation globale plus élevée dans la corne dorsale.Dans une deuxième partie du travail, nous avons exploré le rôle des molécules d’adhérence NLs dans la sensibilisation spinale associée à un autre type de douleur chronique, à savoir la douleur cancéreuse, sur un modèle de cancer de l’os chez le rat. L’étude de l’expression des NLs et de leurs partenaires, a montré une augmentation d’expression spécifique de la NL1 et de S-SCAM, une autre protéine d’échafaudage des synapses excitatrices. D’autre part, d’après la littérature, ce modèle se caractérise par une importante activation gliale dans les cornes dorsales de la moelle épinière, se traduisant notamment par une astrogliose massive. Cependant, nous avons montré que dans le modèle utilisé, il n’y avait aucune variation ni de marqueurs classiques de l’activation astrocytaire (GFAP, S100β), ni des marqueurs microgliaux (OX-42 et Iba1). Au contraire, tous ces paramètres étaient effectivement augmentés dans la corne dorsale ipsilatérale d’animaux neuropathiques. Ces résultats suggèrent que, contrairement à ce qui a été décrit précédemment, la douleur cancéreuse d’origine osseuse n’est pas nécessairement corrélée à une surexpression spinale des marqueurs de la glie réactive, tandis que la douleur neuropathique l’est.En conclusion, nos résultats obtenus dans le modèle de douleur cancéreuse montrent un phénotype concernant des molécules impliquées dans la formation, la spécification et la modulation des synapses, bien différent de celui que nous avons mis en évidence dans le modèle de douleur neuropathique. Nous montrons notamment dans les deux modèles, une implication bien distincte des molécules d’adhérence NLs et de la glie confortant les données de la littérature indiquant que ces deux grandes catégories de douleur chronique ont chacune une signature propre. De plus, nos résultats ouvrent la perspective d’identifier de nouveaux diagnostics et/ou de nouvelles possibilités thérapeutiques, en ciblant spécifiquement les NLs. / In chronic pain states, central sensitization is associated with a modification in the excitation/inhibition balance toward increased excitation in the spinal dorsal horn. This balance involves adhesion molecules such as the postsynaptic Neuroligins (NLs). In a first part of our thesis work, we investigated the putative regulation of these proteins in the Spinal Nerve Ligation (SNL) model of neuropathy in the rat. Our data showed an unexpected upregulation of NL2, usually associated to inhibition, whereas expression of NL1, usually associated to excitation, did not change. The in vivo expression blockade of NL2 by intrathecal injection of siRNAs, produced specific antinociceptive effects, significantly reversing the SNL-induced mechanical allodynia. Subsequent study of pre- and postsynaptic NL2 partners, demonstrated a specific co-variation with PSD95, a scaffolding protein of excitatory synapses. Moreover, a co-immunoprecipitation approach showed a significant increase of NL2/PSD95 protein interactions in SNL rats. Finally, this unusual association in neuropathic conditions, appeared to be linked to specific over-expression of NL2(-), a NL2 splice variant usually a minority in physiological conditions. Over-expression, increased association with PSD95, and unexpected pronociceptive effect of the “inhibitory” NL2 in neuropathic pain condition, suggest a functional shift of NL2 from inhibition to excitation changing the synaptic ratio toward higher overall excitation in the dorsal horn.In a second part of our work, we investigated the role of the NLs adhesion molecules in spinal sensitization associated with another type of chronic pain, namely cancer pain, using a rat model of bone cancer. The study of the expression of NLs and partners, showed a specific increase in the expression of NL1 and S-SCAM, another postsynaptic scaffolding protein at excitatory synapses. Moreover, according to the literature, this model is characterized by a strong glial activation in the spinal dorsal horn, identified especially by a massive astrogliosis. However, we showed that in the bone cancer model used, there was no variation, neither in the classical markers of astrocyte activation (GFAP, S100β), nor in microglial markers (OX-42 et Iba1). On the contrary, all these parameters did actually increase in the ipsilateral dorsal horn of SNL neuropathic rats. These results suggest that, at odd with what was previously described, bone cancer pain is not necessarily correlated with a spinal overexpression of markers of reactive glia, whereas neuropathic pain is.In conclusion, our results obtained with the cancer pain model, show that the molecules involved in the formation, specification and modulation of synapses, yield a phenotypes clearly different to the one evidenced in the model of neuropathic pain. More particularly, we show in the two models, a well distinct involvement of the NL adhesion molecules and of glia, reinforcing reports from the literature, which indicate that the two important categories of chronic pain, cancer and neuropathic, each have a peculiar signature. Moreover, our results raise the possibility that new diagnosis and/or new therapeutic possibilities may emerge from targeting NL expression

Il est bien admis que la compréhension de la structuration moléculaire à l’intérieur des cellules neuronales est essentielle pour appréhender le fonctionnement du cerveau. Pour cette raison, l’étude de l’organisation des molécules clés neuronales et synaptiques contribue grandement à comprendre le mystère du cerveau. AMPA sont des récepteurs ionotropiques du glutamate jouent le rôle central dans la plasticité synaptique et la transmission synaptique basale dans le système nerveux central. Distribution des récepteurs AMPA sur la membrane neuronale est remarquablement hétérogène. Ils sont organisés en agrégats fonctionnels distincts, appelés nanodomaines. Des travaux antérieurs ont montré que Neuroligin, la molécule d’adhésion post-synaptique, ancres récepteurs AMPA par PSD95 dans la membrane post-synaptique et constitue en même temps un complexe d’adhésion trans-synaptique avec présynaptique Neurexin, impliqué dans le recrutement de machines de libération vésiculaire sur le site présynaptique. De cette façon, NRLG fonctionnellement organise synapses par la poste de recrutement de molécules présynaptiques essentielles pour réponse synaptique. Ici, nous avons étudié l’effet de la modulation de NRLG1 (modification du niveau d’expression ou de l’activité) sur le dynamique et nano-organisation des récepteurs AMPA au niveau des synapses individuelles. Notre hypothèse est que le complexe NRX-NRG pourrait être impliquée dans la localisation précise des récepteurs post-synaptiques et son apposition avec zone active présynaptique, jouant ainsi le rôle important dans la transduction du signal approprié. Taille de la densité post-synaptique (PSD) est de l’ordre de 500 nm, alors que diamètre moyen des nanodomaines AMPAR 100 nm. Une telle petite dimension nécessitait l’application de techniques de microscopie de super-résolution, dont la résolution de l’ordre de 20-40 nm est presque un ordre de grandeur mieux que microscopie fluorescence limitée par la diffraction. Nanoscopie fluorescence permettent visualiser des cellules jusqu’au niveau presque moléculaire. Pour atteindre mes objectifs, j’ai mis en place différents nanoscopies de localisation d’une seule molécule, qui s’appuient sur séparés dans l’espace et le temps de détection de population choisi de sondes de fluorescence. Il a été proposé que le trafic membranaire des récepteurs de neurotransmetteurs peut contribuer à la modulation de l’efficacité synaptique. J’ai sondé propriétés diffusionnelles des récepteurs AMPA avec suivi de particules unique, qui a été pendant longtemps appliqué pour sonder l’hétérogénéité de la membrane cellulaire. Localisation relative des biomolécules à la base de la compréhension de leur relation fonctionnelle. Il est bien admis que la juxtaposition de deux objets, ainsi que leur colocalisation, peuvent témoigner de leur association. Avec les récents développements dans l’acquisition multi couleur de la molécule unique et images de super-résolution à base d’ensemble, il est maintenant possible d’explorer la colocalisation à l’échelle nanométrique entre biomolécules dans des cellules vivantes et fixe. Malgré l’ la popularité et l’application très répandue, il n’existe que quelques paradigmes d’analyse quantitative pour la colocalisation des images multicolores super-résolution. Ici, avec l’aide de paradigmes conventionnels de mesure de la colocalisation et statistiques multivariées, nous analysons et présentons en isolement l’échelle du détail et proximité des macromolécules au sein de zones fonctionnelles de synapses. En outre, nous utilisons ces paradigmes pour évaluer marqueurs fluorescents impliqués dans la production de routine de la molécule unique fondée images super-résolution. Nous étendons notre analyse élucider en profondeur le co-agrégation des molécules clés synaptiques, PSD95 et récepteurs AMPA, qui sont impliqués dans l’organisation synaptique et transmission basale. / The brain is made of complex networks of interconnected neuronal cells. All our mental activities are underlain by electrochemical signals passing through dedicated neuronal circuits. Climbing further up on the complexity ladder, information processing by neurons is performed by multiple molecules assembling and interacting together. It is well accepted that the understanding of the molecular structuring inside neuronal cells is essential to apprehend functioning of the brain. For this reason, study of the organization of the key neuronal and synaptic molecules greatly contributes to understand the mystery of the brain. AMPA receptors (AMPARs) are ionotropic glutamate receptors that play a central role in synaptic plasticity and basal synaptic transmission in the central nervous system. The distribution of AMPARs on the neuronal membrane is remarkably heterogeneous. They are organized in distinct functional aggregates, called nanodomains. Previous work demonstrate that the postsynaptic adhesion molecule Neuroligin (NRLG) anchors AMPARs through PSD-95 in the postsynaptic membrane while simultaneously forming a trans-synaptic adhesion complex with presynaptic Neurexin (NRX), and recruiting vesicular release machinery at the presynaptic site. In this way, NRLG functionally organizes synapses by recruiting post and pre-synaptic molecules essential for regulation of synaptic responses. Here we studied the effect of NRLG modulation (modification of expression level or activity) on AMPAR nano-dynamics and nano-organization at individual synapses. Our hypothesis is that the NRX-NRLG complex could be involved in the precise localization of postsynaptic receptors and their apposition with the neurotransmitter release sites in the presynaptic active zone, thus playing important role in proper signal transduction. The size of the postsynaptic density (PSD) is in the order of 500 nm, whereas the average diameter of AMPAR nanodomains 100 nm. Such small dimension necessitated the application of super-resolution microscopy techniques, whose resolution in the range of 20-40 nm is almost an order of magnitude better than diffraction limited fluorescence microscopy. Probe-based far-field fluorescence nanoscopies allow visualizing cells down to almost molecular level. To achieve my goals, I implemented different single-molecule localization nanoscopies which rely on the detection of selected populations of fluorescence probes that are separated in space and time. It was proposed that membrane trafficking of neurotransmitter receptors may contribute to modulation of synaptic efficacy. I have probed diffusional properties of AMPARs with single particle tracking, which has long been applied to probe heterogeneity of the cell membrane. Relative localization of biomolecules provides the basis for understanding their functional relationship. It is well accepted that the juxtaposition of two objects, as well as their colocalization, may give evidence of their association. With the recent developments in multi-color acquisition of single molecule and ensemble based super resolution images, it is now possible to explore the colocalization at the nanoscale between biomolecules in live and fixed cells. Despite the popularity and wide spread application of super resolution imaging, there exist only a few quantitative analysis paradigms for the colocalization of multicolor super-resolution images. Here, with the aid of conventional colocalization measurement paradigms and multivariate statistics, we analyze and report in detail the scale segregation and proximity of macromolecules within functional zones of synapses. Furthermore, we use these paradigms to evaluate fluorescent tags involved in the routine generation of single molecule based super-resolution images. We extend our analysis to elucidate in depth the co-aggregation and clustering of two key synaptic molecules, PSD95 and AMPARs, which are involved in basal synaptic organization and transmission.