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Dans le système nerveux central, la synaptogenèse est un processus complexe multi-étapes qui se déroule aux contacts axones/dendrites. Les molécules d’adhérence neurexines/neuroligines jouent un rôle essentiel dans ce processus, en créant un lien physique entre les compartiments pré- et post-synaptiques et en participant au recrutement des complexes macromoléculaires essentiels à la fonction synaptique. Plus spécifiquement, le complexe neurexine-1β/neuroligine-1 induit la formation de post-synapses excitatrices, en recrutant des molécules d’échafaudage telles que PSD-95 et des récepteurs du glutamate.Mon travail de thèse a consisté à étudier les mécanismes moléculaires mis en jeu par les adhésions neurexines/neuroligines lors de la formation des post-synapses glutamatergiques. En utilisant des systèmes biomimétiques (neurexine purifiée fixée sur des billes, ou agrégée par des anticorps réticulés), nous avons induit des adhésions spécifiques neurexine-1β/neuroligine-1 sur des neurones d’hippocampe en culture. Nous avons ainsi étudié la distribution dynamique des composants post-synaptiques (récepteurs AMPA, PSD-95) endogènes ou étiquetés avec des protéines fluorescentes, par vidéo-microscopie. Dans un premier article, nous avons montré que la formation de ces contacts induisait un recrutement rapide de PSD-95 ainsi que des récepteurs NMDA et AMPA fonctionnels. En utilisant des récepteurs AMPA recombinants, j’ai montré que ce recrutement était dicté par la sous-unité GluA2. Dans une deuxième étude, en comparant le recrutement de PSD-95 induit par la neurexine avec des anticorps non–activants, nous avons mis en évidence un mécanisme d’activation spécifique de neuroligine-1 induit par la liaison de neurexine-1β. L’utilisation de mutants ponctuels de neuroligine-1 a permis de montrer que cette activation passe probablement par la déphosphorylation d’une tyrosine unique située dans le domaine C-terminal de la neuroligine-1.Enfin, en étudiant la diffusion latérale des rAMPA de surface par suivi de particules uniques fluorescentes (Quantum dots), ainsi qu’une batterie d’outils moléculaires pour moduler les adhésions neurexine/neuroligine (sur-expression, siRNA, souris KO), nous avons montré que les rAMPA sont recrutés aux adhésions neurexine-1β/neuroligine-1 via l’échafaudage PSD-95 et que ce recrutement nécessite la diffusion des récepteurs dans la membrane plasmique. Nous proposons ainsi que les récepteurs AMPA soient recrutés aux contacts naissants via un mécanisme original de diffusion/piégeage. / In the central nervous system, synaptogenesis is a multi step process occuring at axo-dendritic contacts. Neurexins/neuroligins adhesions are particularly involved in this process, making a bridge between the pre- and the post-synapse, and participating to the recruitment of macromolecular complexes essential for synaptic function. More precisely neurexin-1β/neuroligin-1 complex is specifically involved in the formation of excitatory synapses, inducing the recruitment of glutamatergic post-synapses components, such as PSD-95, and glutamate receptors.During my PhD, I focused on the molecular mechanisms involved in glutamatergic post-synapses formation triggered by neurexin-1β/neuroligin-1 adhesions. Using biomimetic models (beads coated with purified neurexin, or purified neurexin cross-linked with aggregated antibodies) we induced specific neurexin-1β/neuroligin-1 adhesions on cultured hippocampal neurons. We then studied the dynamic distribution of either endogenous or recombinant post-synaptic components (PSD-95, AMPARs) with live-imaging techniques. First, we showed that the formation of these contacts induced a rapid recruitment of PSD-95 and functional NMDA and AMPA receptors. Using recombinant AMPA receptors, I showed that this recruitment was mediated by GluA2 subunit.In a second study, using systematic comparison between the recruitment of PSD-95 induced either by neurexin-1β or by “non activating” antibody binding on neuroligin-1, we revealed a specific activation mechanism of neuroligin-1 induced by neurexin-1β binding. Using point mutations on neuroligin-1, we showed that this activation mechanism is mediated by a tyrosine dephosphorylation on neuroligin-1 intracellular tail.Finally, we studied AMPA receptor surface diffusion with single particle tracking experiments, using different molecular tools to perturb neurexin-1β/neuroligin-1 adhesions (overexpression, RNA interference, KO mice). We showed that AMPA receptors recruitment at new-formed neurexin-1β/neuroligin-1 adhesions occurs through PSD-95, and involves surface diffusion of AMPA receptors. We proposed an original diffusion/trap mechanism of AMPA receptors at nascent contacts.

Les stratégies d'ingénierie du génome par recombinaison homologue basées sur la technologie CRISPR/Cas-9 ont été largement utilisées pour modifier la séquence de gènes chez C. elegans. Cependant, l'efficacité de sélection des animaux modifiés nécessite d'être améliorée. Nous avons développé un nouveau marqueur, le gène miniSOG, qui permet la contre-sélection des animaux non modifiés et que nous avons intégré dans une cassette de double sélection. Les animaux contenant la cassette HySOG sont d'abord sélectionnés pour leur résistance à un antibiotique, l'hygromycine B. HySOG est ensuite excisée et les modifications sont insérées au locus cible. Les souches recombinantes résistent à une exposition à la lumière bleue, qui tue les vers exprimant le gène miniSOG. Nous montrons que la méganucléase I-SceI peut être utilisée pour exciser HySOG et pour introduire des modifications dans la lignée germinale avec la même efficacité que la technologie CRISPR/Cas-9.Des technologies d'ingénierie du génome ont été utilisées pour étiqueter la sous-unité des GABAAR UNC-49 et pour analyser le rôle de MADD-4/Punctin, UNC-40/DCC et NLG-1/neurologine sur l'agrégation synaptique des GABAAR à la jonction neuromusculaire GABAergique. Nous montrons que MADD-4, une protéine de la matrice extracellulaire sécrétée par les motoneurones, est un nouveau ligand de NLG-1 et de UNC-40 et constitue un organisateur synaptique antérograde des synapses GABAergiques. D'abord, l'isoforme courte de MADD-4, MADD-4B, lie directement NLG-1 et assure sa localisation à la membrane post-synaptique. Ensuite, MADD-4B lie, recrute et active probablement le récepteur UNC-40, qui renforce l'interaction des GABAAR avec NLG-1. / CRISPR/Cas-9-based techniques have been widely used to engineer any gene in C. elegans by homologous recombination. However, the selective efficacy of engineered animals needs to be expanded. We have developed miniSOG as a counter-selection marker in a dual selection strategy. Animals containing the dual selection cassette HySOG are firstly selected by the resistance to the antibiotic hygromycin B. HySOG is then excised and customized gene modifications are inserted into target sites. Recombinant strains are selected based on the resistance to blue light exposure, which otherwise kills miniSOG expressing worms. We demonstrate that meganuclease I-SceI can be used to excise HySOG and to introduce gene modifications in C. elegans germline as efficiently as CRISPR/Cas-9. Genome-engineering techniques have been used to tag the GABAAR subunit UNC-49 with RFP and to analyze the role of MADD-4/Punctin, UNC-40/DCC and NLG-1/neuroligin on GABAARs clustering at GABAergic NMJs. We showed that MADD-4/Punctin, an extracellular matrix protein secreted by GABAergic neurons, is a new ligand of NLG-1/neuroligin and of UNC-40/DCC and functions as a central anterograde organizer of GABAergic synapses. First, the short isoform of MADD-4, MADD-4B directly binds NLG-1/neuroligin and localizes it in the post-synaptic membrane of GABAergic synapses. Second, MADD-4B binds, recruits and likely activates the netrin receptor UNC-40/DCC, which in turn promotes the interaction of GABAAR with NLG-1/neuroligin and its localization at the synapse.

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Le sommeil est essentiel au bon fonctionnement de l’organisme. Ce dernier est régulé, entre autres, par le processus de régulation homéostatique qui dépend de la pression de sommeil accumulée suite à l’éveil. Des études ont suggéré que ce processus pourrait être lié à la plasticité synaptique, et que le changement de la pression de sommeil affecterait le degré de plasticité du cerveau. Les récepteurs N-méthyl-D-aspartate, des médiateurs importants de plasticité, semblent impliqués dans les conséquences délétères du manque de sommeil ainsi que dans la régulation de la synchronisation corticale caractéristique du sommeil lent profond. Leur activité est contrôlée par Neuroligine 1 (NLGN1), une molécule d’adhésion synaptique. Une mutation de Nlgn1 a des effets similaires à ceux de la privation de sommeil sur la mémoire et le comportement. Dans le manuscrit de mon mémoire, nous présentons l’hypothèse d’une implication de NLGN1 dans la régulation du sommeil et de l’éveil. Pour tester cette hypothèse, l’expression d’ARNm et de protéine NLGN1 a été mesurée suite à une privation de sommeil et le sommeil de souris n’exprimant pas NLGN1 a été caractérisé. Les résultats de mon projet de maîtrise montrent, en premier lieu, qu’une augmentation de la pression pour dormir altère l’expression de l’ARNm et de la protéine NLGN1 chez la souris. De plus, nos observations révèlent qu’une mutation de Nlgn1 diminue la quantité d’éveil et modifie l’activité spectrale en éveil et en sommeil. Ces observations dévoilent l’importance de NLGN1 dans le maintien de l’éveil et la régulation du sommeil, et supportent un rôle de NLGN1 dans la régulation de l’activité neuronale. / Sleep is essential for the well-functioning of the body. It has been suggested that sleep is regulated, in part, by the homeostatic process of sleep regulation which controls a pressure for sleep in function of the amount of time spent awake. Studies have suggested that the homeostatic process could be linked to synaptic plasticity, and that changes in sleep pressure can affect brain plasticity. N-methyl-D-aspartate receptors, which are important plasticity mediators, appear to be implicated in the deleterious effects related to sleep loss as well as in the regulation of cortical synchrony characteristic of slow wave sleep. Their activity is controlled by Neuroligin 1 (NLGN1), a synaptic adhesion molecule. Also, a Nlgn1 mutation has similar effects on memory and behavior as those observed following a sleep deprivation. In this master’s thesis, we hypothesized that NLGN1 is implicated in sleep and wake regulation. To test this hypothesis, Nlgn1 mRNA and protein expression has been measured after sleep deprivation, and the sleep of mice lacking NLGN1 has been studied. The results of my research project show that an increase in sleep pressure changes Nlgn1 mRNA and protein expression in mice. We also find that Nlgn1 mutation reduces wake duration and modifies the EEG spectral composition during wake and sleep. These results indicate that NLGN1 is important in the maintenance of wakefulness and the regulation of sleep, and provide further support to a role for NLGN1 in the regulation of neuronal activity.

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Le sommeil est essentiel au bon fonctionnement de l’organisme. Ce dernier est régulé, entre autres, par le processus de régulation homéostatique qui dépend de la pression de sommeil accumulée suite à l’éveil. Des études ont suggéré que ce processus pourrait être lié à la plasticité synaptique, et que le changement de la pression de sommeil affecterait le degré de plasticité du cerveau. Les récepteurs N-méthyl-D-aspartate, des médiateurs importants de plasticité, semblent impliqués dans les conséquences délétères du manque de sommeil ainsi que dans la régulation de la synchronisation corticale caractéristique du sommeil lent profond. Leur activité est contrôlée par Neuroligine 1 (NLGN1), une molécule d’adhésion synaptique. Une mutation de Nlgn1 a des effets similaires à ceux de la privation de sommeil sur la mémoire et le comportement. Dans le manuscrit de mon mémoire, nous présentons l’hypothèse d’une implication de NLGN1 dans la régulation du sommeil et de l’éveil. Pour tester cette hypothèse, l’expression d’ARNm et de protéine NLGN1 a été mesurée suite à une privation de sommeil et le sommeil de souris n’exprimant pas NLGN1 a été caractérisé. Les résultats de mon projet de maîtrise montrent, en premier lieu, qu’une augmentation de la pression pour dormir altère l’expression de l’ARNm et de la protéine NLGN1 chez la souris. De plus, nos observations révèlent qu’une mutation de Nlgn1 diminue la quantité d’éveil et modifie l’activité spectrale en éveil et en sommeil. Ces observations dévoilent l’importance de NLGN1 dans le maintien de l’éveil et la régulation du sommeil, et supportent un rôle de NLGN1 dans la régulation de l’activité neuronale. / Sleep is essential for the well-functioning of the body. It has been suggested that sleep is regulated, in part, by the homeostatic process of sleep regulation which controls a pressure for sleep in function of the amount of time spent awake. Studies have suggested that the homeostatic process could be linked to synaptic plasticity, and that changes in sleep pressure can affect brain plasticity. N-methyl-D-aspartate receptors, which are important plasticity mediators, appear to be implicated in the deleterious effects related to sleep loss as well as in the regulation of cortical synchrony characteristic of slow wave sleep. Their activity is controlled by Neuroligin 1 (NLGN1), a synaptic adhesion molecule. Also, a Nlgn1 mutation has similar effects on memory and behavior as those observed following a sleep deprivation. In this master’s thesis, we hypothesized that NLGN1 is implicated in sleep and wake regulation. To test this hypothesis, Nlgn1 mRNA and protein expression has been measured after sleep deprivation, and the sleep of mice lacking NLGN1 has been studied. The results of my research project show that an increase in sleep pressure changes Nlgn1 mRNA and protein expression in mice. We also find that Nlgn1 mutation reduces wake duration and modifies the EEG spectral composition during wake and sleep. These results indicate that NLGN1 is important in the maintenance of wakefulness and the regulation of sleep, and provide further support to a role for NLGN1 in the regulation of neuronal activity.

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Neuroligine (NL) sind vorwiegend postsynaptisch lokalisierte transmembrane Adhäsionsmoleküle, die in Wechselwirkung mit dem präsynaptisch lokalisierten Protein Neurexin eine wichtige Rolle in der Reifung und Funktion von Synapsen spielen. Es existieren verschiedene NL-Isoproteine (NL-1 – NL-4), die sich in ihrer Assoziation zu exzitatorischen und inhibitorischen Synapsen unterscheiden. Die funktionelle und klinische Relevanz der Neuroligine belegen beispielhaft Mutationen des Isotyps NL 4, welche mit neuropsychiatrischen Erkrankungen wie Autismus-Spektrum-Störungen assoziiert vorkommen. Anhand eines durch Ausschalten des human-orthologen NL-4-Gens generierten Mausmodells (NL 4 Knockout, NL 4 KO) konnte in vorhergehenden Studien die Bedeutung einer immunhistochemisch beobachteten Lokalisation von NL 4 an glycinergen Synapsen der Retina für die inhibitorische synaptische Übertragung nachgewiesen werden. Im Unterschied dazu konnte kein Zusammenhang zwischen einer in Schicht IV des Barrel-Kortex nachweisbaren Lokalisation von NL-4 mit inhibitorischen Synapsen hergestellt werden. Deshalb, und aufgrund der in Schicht IV dominierenden exzitatorischen Verschaltung von thalamischen Projektionen und den kolumnenassoziierten Rückverschaltungen aus dem Neokortex, lässt sich eine Interaktion von NL-4 mit exzitatorischen Synapsen in diesem Areal vermuten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde anhand der NL-4-KO-Modellmaus der Frage nachgegangen, inwiefern NL-4 die exzitatorische synaptische Übertragung im Barrel-Kortex beeinflusst. Dafür wurden mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik abgeleitete AMPA-Rezeptor-vermittelte exzitatorische postsynaptische Ströme (EPSC) von bedornten Sternzellen, Sternpyramiden- und Pyramidenzellen der Schicht IV ausgewertet und zwischen NL-4-Wildtyp- (NL 4-WT) und NL 4 KO-Neuronen verglichen. Dabei zeigten NL 4-KO-Neurone signifikant veränderte Parameter der EPSC-Kinetik. Die Abfallszeit war in NL 4 KO-Neuronen signifikant länger, das maximale Gefälle und die maximale Steigung signifikant flacher gegenüber NL-4-WT-Kontrollen. Diese Veränderungen sprechen für eine funktionelle Relevanz von NL-4 für die AMPA-Rezeptor-vermittelte synaptische Übertragung auf exzitatorische Neurone in Schicht IV des Barrel-Kortex. Das Muster der in NL-4-KO-Neuronen veränderten EPSC-Kinetik weist dabei auf eine Modulation der biophysikalischen AMPA-Rezeptoreigenschaften hin und könnte mit Veränderungen der synaptisch exprimierten AMPA-Rezeptor-TARP-Subtypen in Zusammenhang stehen, die über Proteine der postsynaptischen Dichte (wie PSD-95 und S SCAM) mit Neuroliginen interagieren.