Peptide hormones are critical modulators of physiology and development in humans and have been well characterized for their effects on humans and other mammals. The question of the origin of the many families of peptide hormones in mammals is pressing, as it gives us a window into the evolution of important systems in all extant animals and their common ancestors. The focus of this thesis was to examine the origin of a select group of peptide hormone families including the secretin superfamily, reproductive neuropeptides, insulin and the insulin-like peptides, and stanniocalcin. The evolution of the secretin superfamily was found to have originated with the vertebrates, and new information from the genomes of basal vertebrates like the lamprey Petromyon marinus and elephant shark Callorhinchus milii allows us to better piece together the gene duplications that produced the current hormone family in humans and fish. The reproductive hormones, including gonadotropin-releasing hormone (GnRH), vasopressin/oxytocin, and kisspeptin were examined, with a focus on the evolution of their G protein-coupled receptors. GnRH was found to have originated in the early bilaterians, and its receptors clearly belong to a superfamily also containing receptors of the related neuropeptides adipokinetic hormone and corazonin, which have only been found in protostome invertebrates. Vasopressin/oxytocin receptors share a common ancestor with the GnRH receptors, although their peptides are not structurally related, and evolved at a similar time. Kisspeptin evolved later, within the vertebrates, however its receptors are closely related to an orphan receptor in protostome invertebrates, GPR54, with an unknown ligand. Insulin family members from the tunicate Ciona intestinalis and the amphioxus Branchiostoma floridae were identified, isolated and characterized to determine the nature of the insulin superfamily at the origin of the chordates, and it appears this family was well-developed already. Finally, the calcium-regulator stanniocalcin was identified, isolated and characterized in C. intestinalis and compared with the vertebrate and amphioxus stanniocalcins. A group of stanniocalcins were also discovered in a wide range of both protostomes and unicellular eukaryotes, indicating this ancient group of neurohormones appeared early in eukaryotic evolution. / Graduate

Development of the adult form requires coordinated growth and patterning of multiple traits in response to local gene activity as well as global endocrine and physiological effectors. In recent years the zebrafish has been utilized as a favorable animal model as a step towards dissecting and better understanding these postembryonic developmental processes. One of the more powerful methods utilized in zebrafish has been the identification of new gene functions through the use of mutant screens. The nutria mutant was recovered from one such screen to identify postembryonic defects in pigment pattern, growth and metamorphosis. These mutants exhibited a pigment cell defect, touch unresponsiveness and severe growth retardation. Here I will discuss my work towards dissecting the underlying developmental processes governing the phenotypic changes in nutria mutants. I characterize gross alterations in skeletal development in nutria mutants that lead to accelerated endochondral ossification but delayed intramembranous ossification. I show that the nutria phenotype results from mutations in trpm7, which encodes a transient receptor potential (TRP) family member that functions as both a cation channel and a kinase. I find trpm7 expression in the fish-specific, ion homeostasis-regulating gland known as the corpuscles of Stannius (CS), and in the mesonephric kidney. I show that mutants also develop kidney stones. Together these results suggest a role for trpm7 activity in regulation of physiological ion homeostasis. Next I confirm that role by identifying late-embryonic and early larval defects in the CS and the kidney, two organs that regulate physiological ion homeostasis. I demonstrate the early larval detection of kidney stones in trpm7 mutants and show that their appearance is presaged by decreased levels of total calcium and magnesium. Furthermore I establish a link between trpm7 function in the CS and stanniocalcin1 (stc1), a potent molecular regulator of calcium homeostasis. Finally, using transgenic overexpression and morpholino-oligonucleotide knockdown, I demonstrate that stc1 modulates calcium and magnesium levels in trpm7 mutant and wild-type backgrounds. Together these analyses establish postembryonic roles for trpm7 function in growth, skeletogenesis, kidney function, and physiological ion homeostasis. / text

As stanniocalcinas (STC1 e STC2) são hormônios glicoproteicos identificados primeiramente em peixes ósseos, relacionados com o metabolismo do cálcio e fosfato. Recentes descobertas evidenciaram que as funções das STCs foram mantidas em mamíferos. A descoberta da localização do receptor para STC1 na membrana mitocondrial de roedores e sua ação como desacopladora da respiração celular sinalizam fortemente um importante papel desse hormônio no metabolismo intermediário de mamíferos. A STC estimula a lipogênese no tecido hepático e muscular de ratos, porém, suas ações sobre o metabolismo do tecido adiposo ainda não foram esclarecidas. No presente trabalho, estudamos o efeito, in vitro, da STC1 e da STC2 humanas, nas concentrações (A: 0,01ng/mL; B: 0,1ng/mL; C: 10ng/mL) no tecido adiposo branco (TAB) e no tecido adiposo marrom (TAM) em Rattus norvegicus machos, 300 ± 50g, alimentados ad libitum e submetidos ao jejum de 24 e 48 horas (n=61). Os resultados obtidos demonstram que, no TAB, a STC1 não apresentou efeito. Contudo, a STC2, nas concentrações A e C, diminuiu a formação de 14CO2 em animais em jejum de 24 horas e nas concentrações A e B, aumentou a incorporação de [214C] piruvato em 14C-glicerol, em animais alimentados (controle). No TAM, a STC1 na concentração B, diminuiu a formação de 14CO2 em animais alimentados (controle). Na mesma concentração, aumentou a incorporação de [214C] piruvato em 14C-glicerol em animais em jejum de 24 horas e aumentou a incorporação de 14C-ácido graxo em animais alimentados (controle). A STC2, na concentração B, diminuiu a formação de 14CO2 em animais alimentados (controle) e aumentou a formação de 14CO2 nos animais em jejum de 24 horas. A STC2 não alterou a via gliceroneogênica neste tecido. A dosagem plasmática do hormônio leptina apresentou acentuada diminuição no grupo jejum 48 horas. As STCs 1 e 2, nas concentrações utilizadas, não alteraram a atividade da enzima PEPCKc nos tecidos estudados (TAB e TAM), em animais alimentados (controle). Em quase todos os tratamentos observamos diferenças marcantes entre animais alimentados e jejuados. Este é o primeiro estudo que mostra as diferentes concentrações das STCs no metabolismo de lipídios. / The stanniocalcins (STC1 and STC2) are glycoprotein hormones related to the metabolism of calcium and phosphate first identified in fish bone. Recent findings showed that the functions of STCs were maintained in mammals. The discovery of the location of the receptor for STC1 in the mitochondrial membrane, as well as its uncoupling action of cellular respiration in rodents, strongly indicate an important role of this hormone in the intermediary metabolism of mammals. The STC stimulates lipogenesis in the liver and muscle tissue of rats. However, its action on the metabolism of adipose tissue has not yet been clarified. In this work, we studied the effect in vitro of human STC1 and STC2 concentrations (A: 0,01 ng/ml, B: 0,1 ng/ml, C: 10ng/mL) in white adipose tissue (WAT) and in brown adipose tissue (BAT) in male Rattus norvegicus , 300 ± 50 g , fed ad libitum and fasted for 24 and 48 hours (n= 61). The results show that in the WAT, the STC1 had no effect. However, STC2 at concentrations A and C decreased the formation of 14CO2 in fasted rats for 24 hours and the concentrations A and B increased the incorporation of [214C] into 14C-glycerol pyruvate in fed animals (control). In BAT, STC1 concentration B, decreased the formation of 14CO2 in fed animals (control). At the same concentration, increased the incorporation of [2 14C] pyruvate into 14C-glycerol in fasted rats for 24 hours and increased the incorporation of 14C-fatty acid in fed animals (control). The STC2 concentration B decreased the formation of 14CO2 in fed animals (control) and increased the formation of 14CO2 in animals fasted for 24 hours. The STC2 did not alter the glyceroneogenesis pathway in this tissue. The serum levels of leptin showed marked decrease in the group fasting for 48 hours. The STCs 1 and 2, in the concentrations used, did not alter the PEPCKc enzyme activity in the tissues studied (WAT and BAT) in fed animals (control). In almost all treatments we observed striking differences between fed and fasted animals. This is the first study that shows the effect of different concentrations of STCs in the metabolism of lipids.

As stanniocalcinas (STC1 e STC2) são hormônios glicoproteicos identificados primeiramente em peixes ósseos, relacionados com o metabolismo do cálcio e fosfato. Recentes descobertas evidenciaram que as funções das STCs foram mantidas em mamíferos. A descoberta da localização do receptor para STC1 na membrana mitocondrial de roedores e sua ação como desacopladora da respiração celular sinalizam fortemente um importante papel desse hormônio no metabolismo intermediário de mamíferos. A STC estimula a lipogênese no tecido hepático e muscular de ratos, porém, suas ações sobre o metabolismo do tecido adiposo ainda não foram esclarecidas. No presente trabalho, estudamos o efeito, in vitro, da STC1 e da STC2 humanas, nas concentrações (A: 0,01ng/mL; B: 0,1ng/mL; C: 10ng/mL) no tecido adiposo branco (TAB) e no tecido adiposo marrom (TAM) em Rattus norvegicus machos, 300 ± 50g, alimentados ad libitum e submetidos ao jejum de 24 e 48 horas (n=61). Os resultados obtidos demonstram que, no TAB, a STC1 não apresentou efeito. Contudo, a STC2, nas concentrações A e C, diminuiu a formação de 14CO2 em animais em jejum de 24 horas e nas concentrações A e B, aumentou a incorporação de [214C] piruvato em 14C-glicerol, em animais alimentados (controle). No TAM, a STC1 na concentração B, diminuiu a formação de 14CO2 em animais alimentados (controle). Na mesma concentração, aumentou a incorporação de [214C] piruvato em 14C-glicerol em animais em jejum de 24 horas e aumentou a incorporação de 14C-ácido graxo em animais alimentados (controle). A STC2, na concentração B, diminuiu a formação de 14CO2 em animais alimentados (controle) e aumentou a formação de 14CO2 nos animais em jejum de 24 horas. A STC2 não alterou a via gliceroneogênica neste tecido. A dosagem plasmática do hormônio leptina apresentou acentuada diminuição no grupo jejum 48 horas. As STCs 1 e 2, nas concentrações utilizadas, não alteraram a atividade da enzima PEPCKc nos tecidos estudados (TAB e TAM), em animais alimentados (controle). Em quase todos os tratamentos observamos diferenças marcantes entre animais alimentados e jejuados. Este é o primeiro estudo que mostra as diferentes concentrações das STCs no metabolismo de lipídios. / The stanniocalcins (STC1 and STC2) are glycoprotein hormones related to the metabolism of calcium and phosphate first identified in fish bone. Recent findings showed that the functions of STCs were maintained in mammals. The discovery of the location of the receptor for STC1 in the mitochondrial membrane, as well as its uncoupling action of cellular respiration in rodents, strongly indicate an important role of this hormone in the intermediary metabolism of mammals. The STC stimulates lipogenesis in the liver and muscle tissue of rats. However, its action on the metabolism of adipose tissue has not yet been clarified. In this work, we studied the effect in vitro of human STC1 and STC2 concentrations (A: 0,01 ng/ml, B: 0,1 ng/ml, C: 10ng/mL) in white adipose tissue (WAT) and in brown adipose tissue (BAT) in male Rattus norvegicus , 300 ± 50 g , fed ad libitum and fasted for 24 and 48 hours (n= 61). The results show that in the WAT, the STC1 had no effect. However, STC2 at concentrations A and C decreased the formation of 14CO2 in fasted rats for 24 hours and the concentrations A and B increased the incorporation of [214C] into 14C-glycerol pyruvate in fed animals (control). In BAT, STC1 concentration B, decreased the formation of 14CO2 in fed animals (control). At the same concentration, increased the incorporation of [2 14C] pyruvate into 14C-glycerol in fasted rats for 24 hours and increased the incorporation of 14C-fatty acid in fed animals (control). The STC2 concentration B decreased the formation of 14CO2 in fed animals (control) and increased the formation of 14CO2 in animals fasted for 24 hours. The STC2 did not alter the glyceroneogenesis pathway in this tissue. The serum levels of leptin showed marked decrease in the group fasting for 48 hours. The STCs 1 and 2, in the concentrations used, did not alter the PEPCKc enzyme activity in the tissues studied (WAT and BAT) in fed animals (control). In almost all treatments we observed striking differences between fed and fasted animals. This is the first study that shows the effect of different concentrations of STCs in the metabolism of lipids.

As stanniocalcinas (STC1 e STC2) são hormônios glicoproteicos identificados primeiramente em peixes ósseos, relacionados com o metabolismo do cálcio e fosfato. Recentes descobertas evidenciaram que as funções das STCs foram mantidas em mamíferos. A descoberta da localização do receptor para STC1 na membrana mitocondrial de roedores e sua ação como desacopladora da respiração celular sinalizam fortemente um importante papel desse hormônio no metabolismo intermediário de mamíferos. A STC estimula a lipogênese no tecido hepático e muscular de ratos, porém, suas ações sobre o metabolismo do tecido adiposo ainda não foram esclarecidas. No presente trabalho, estudamos o efeito, in vitro, da STC1 e da STC2 humanas, nas concentrações (A: 0,01ng/mL; B: 0,1ng/mL; C: 10ng/mL) no tecido adiposo branco (TAB) e no tecido adiposo marrom (TAM) em Rattus norvegicus machos, 300 ± 50g, alimentados ad libitum e submetidos ao jejum de 24 e 48 horas (n=61). Os resultados obtidos demonstram que, no TAB, a STC1 não apresentou efeito. Contudo, a STC2, nas concentrações A e C, diminuiu a formação de 14CO2 em animais em jejum de 24 horas e nas concentrações A e B, aumentou a incorporação de [214C] piruvato em 14C-glicerol, em animais alimentados (controle). No TAM, a STC1 na concentração B, diminuiu a formação de 14CO2 em animais alimentados (controle). Na mesma concentração, aumentou a incorporação de [214C] piruvato em 14C-glicerol em animais em jejum de 24 horas e aumentou a incorporação de 14C-ácido graxo em animais alimentados (controle). A STC2, na concentração B, diminuiu a formação de 14CO2 em animais alimentados (controle) e aumentou a formação de 14CO2 nos animais em jejum de 24 horas. A STC2 não alterou a via gliceroneogênica neste tecido. A dosagem plasmática do hormônio leptina apresentou acentuada diminuição no grupo jejum 48 horas. As STCs 1 e 2, nas concentrações utilizadas, não alteraram a atividade da enzima PEPCKc nos tecidos estudados (TAB e TAM), em animais alimentados (controle). Em quase todos os tratamentos observamos diferenças marcantes entre animais alimentados e jejuados. Este é o primeiro estudo que mostra as diferentes concentrações das STCs no metabolismo de lipídios. / The stanniocalcins (STC1 and STC2) are glycoprotein hormones related to the metabolism of calcium and phosphate first identified in fish bone. Recent findings showed that the functions of STCs were maintained in mammals. The discovery of the location of the receptor for STC1 in the mitochondrial membrane, as well as its uncoupling action of cellular respiration in rodents, strongly indicate an important role of this hormone in the intermediary metabolism of mammals. The STC stimulates lipogenesis in the liver and muscle tissue of rats. However, its action on the metabolism of adipose tissue has not yet been clarified. In this work, we studied the effect in vitro of human STC1 and STC2 concentrations (A: 0,01 ng/ml, B: 0,1 ng/ml, C: 10ng/mL) in white adipose tissue (WAT) and in brown adipose tissue (BAT) in male Rattus norvegicus , 300 ± 50 g , fed ad libitum and fasted for 24 and 48 hours (n= 61). The results show that in the WAT, the STC1 had no effect. However, STC2 at concentrations A and C decreased the formation of 14CO2 in fasted rats for 24 hours and the concentrations A and B increased the incorporation of [214C] into 14C-glycerol pyruvate in fed animals (control). In BAT, STC1 concentration B, decreased the formation of 14CO2 in fed animals (control). At the same concentration, increased the incorporation of [2 14C] pyruvate into 14C-glycerol in fasted rats for 24 hours and increased the incorporation of 14C-fatty acid in fed animals (control). The STC2 concentration B decreased the formation of 14CO2 in fed animals (control) and increased the formation of 14CO2 in animals fasted for 24 hours. The STC2 did not alter the glyceroneogenesis pathway in this tissue. The serum levels of leptin showed marked decrease in the group fasting for 48 hours. The STCs 1 and 2, in the concentrations used, did not alter the PEPCKc enzyme activity in the tissues studied (WAT and BAT) in fed animals (control). In almost all treatments we observed striking differences between fed and fasted animals. This is the first study that shows the effect of different concentrations of STCs in the metabolism of lipids.

Submitted by Irene Nascimento (irene.kessia@ufpe.br) on 2017-03-08T16:58:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Juliana Gusmão de Araujo.pdf: 5234646 bytes, checksum: 87f79f1087a57c64407eda5226cb557f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-08T16:58:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Juliana Gusmão de Araujo.pdf: 5234646 bytes, checksum: 87f79f1087a57c64407eda5226cb557f (MD5) Previous issue date: 2012-12-26 / O colesteatoma adquirido, mesmo com os conhecimentos acumulados desde sua primeira descrição, ainda se mantém como um problema de saúde pública distante de ser solucionado. O entendimento mais profundo da patogênese do colesteatoma é de extrema importância visto que a natureza desta lesão é destrutiva e causadora de complicações potencialmente graves. Apesar das teorias propostas e das várias proteínas terem sido identificados no colesteatoma, a verdadeira etiopatogenia da doença ainda carece de investigações. Objetivo: Identificar biomarcadores do colesteatoma adquirido utilizando a plataforma proteômica. Casuística e Métodos: Foram coletadas amostras de colesteatoma e também fragmento de pele da região retroauricular de 12 indivíduos submetidos a cirurgia para remoção do colesteatoma. As amostras foram armazenadas em solução salina e mantidas a -20ºC até pesagem tecidual e extração das proteínas. Eletroforese bidimensional foi realizada, os géis foram corados com nitrato de prata e suas imagens digitalizadas. Todas as análises foram realizadas em triplicatas. Os peptídeos extraídos após a digestão do spots foram levados à espectrometria de massa e os espectros obtidos foram analisados usando o algoritmo Mascot utilizando os bancos de dados de proteína do NCBI e SwissProt. Resultados: Dos 393 spots identificados na análise do extrato proteico de colesteatoma adquirido, apenas 10 estavam dentro dos parâmetros estatísticos aceitáveis pelo algoritmo Mascot. As principais proteínas detectadas no colesteatoma adquirido foram a cadeia beta do fibrinogênio, proteína da matriz extracelular 2, actina citoplasmática 1, heparan sulfato glucosamina 3-O-sulfotransferase 3A1, fator de necrose tumoral alfa induzido proteína 8-like 1, Stanniocalcina-2, lisofosfolipase eosinofílica e OFUT1.Conclusão: Foram identificadas proteínas envolvidas com a migração celular, regulação da apoptose, vias de sinalização, hiperproliferação celular, cicatrização e processos inflamatórios. Pudemos, desta maneira, traçar um perfil proteômico do colesteatoma adquirido. / The acquired cholesteatoma, even with all the knowledge accumulated since its first description, still remains a public health problem, far from being solved. A deeper understanding of its pathogenesis is extremely important since it is a destructive lesion that might cause potentially serious complications. Several proteins have been identified in cholesteatoma and a few theories were described, however the true etiology of the disease still needs investigation. Objective: Identify acquired cholesteatoma biomarkers using proteomics platform. Patients and methods: Cholesteatoma samples were collected and also a skin fragment of the surgical incision of twelve patients undergoing surgery for cholesteatoma removal. The samples were stored in saline solution and kept at -20 ° C until weighing tissue and proteins extraction. Two-dimensional electrophoresis was conducted, the gels were stained with silver nitrate and their images were digitized. All analyzes were performed in triplicate. The peptides extracted after spots digestion were taken to mass spectrometry and the spectra obtained were analyzed using the Mascot algorithm comparing databases of the NCBI and SwissProt protein. Results: Of the 393 spots identified in the analysis of protein extracts of acquired cholesteatoma, only 10 were within acceptable statistical parameters by Mascot algorithm. The proteins detected in acquired cholesteatoma were fibrinogen beta chain, extracellular matrix protein 2, actin cytoplasmic 1, heparan sulfate glucosamine 3-O-sulfotransferase 3A1, tumor necrosis factor alpha 8 induced proteinlike 1, stanniocalcin-2, eosinophil lysophospholipase and OFUT1. Conclusion: Proteins involved in cell migration, regulation of apoptosis, signaling pathways, cellular proliferation, wound healing and inflammatory processes were identified. We were able to draw a proteomic profile of acquired cholesteatoma.

Orientador: Jörg Kobarg / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T05:39:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cardoso_AlineMonticelli_M.pdf: 19291466 bytes, checksum: 5920430c506c4670ca04da10ad934398 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A Stanniocalcina-1 (STC1) humana é uma glicoproteína homóloga a Stanniocalcina (STC) originalmente identificada como um hormônio regulador da homeostase de cálcio em peixes. A STC1 humana secretada atua em diferentes processos fisiológicos incluindo a angiogênese, a hipóxia e, principalmente, a carcinogênese, demonstrando assim uma atividade abrangente. Atualmente não se conhece o receptor da STC1 e pouco se sabe sobre o mecanismo de ação e de entrada nas células dessa proteína. Assim, o objetivo desse trabalho foi investigar um candidato a receptor de membrana dessa proteína, o receptor de transferrina (TfR1), uma proteína transmembrana responsável pela absorção de ferro nas células. Esse receptor é provavelmente expresso por todas as células em diferentes níveis, em destaque em células do sistema hematopoiético, em células em divisão celular e células neoplásicas. Assim, avaliou-se por citometria de fluxo o efeito do tratamento com STC1 em células não transfectadas e células transfectadas superexpressando o receptor de transferrina. Células tratadas com STC1 demonstraram um efeito semelhante ao tratamento com transferrina, um conhecido ligante desse receptor, no qual ambos diminuíram o número de células positivas para a marcação da superfície com transferrina conjugada com fluorocromo (transferrina-Alexa Fluor® 488 - Life Technologies). Em outro conjunto de experimentos de Western Blot foi demonstrado que a STC1 adicionada no sobrenadante das culturas de células é internalizada nas células e detectável no lisado celular, principalmente as células transfectadas para a superexpressão do receptor de transferrina. Complementarmente, em experimentos de localização subcelular por imunofluorescência a STC1 foi detectada em uma forma pontual e espalhada no citoplasma. Em conjunto, todos esses experimentos sugerem que STC1 e transferrina interferem na localização do receptor de transferrina na superfície celular e que possivelmente esse receptor está envolvido em mecanismos de internalização da própria STC1 / Abstract: Human Stanniocalcin 1 (STC1) is the mammalian homologue of STC, which was originally identified as a calcium-regulating hormone in bony fishes. The human secreted Stanniocalcin acts on different physiological processes, including angiogenesis, hypoxia and especially carcinogenesis, facts that demonstrate their activity is wide. Currently there are few data on the mechanism of action of this protein or how it enters the cell. Thus, the aim of this study was to investigate transferrin receptor (TfR1) as a candidate to membrane receptor protein of STC1. This receptor is a membrane protein responsible for the iron uptake in cells. This receptor is probably expressed by all cells especially by cells in division and cancer cells, but its expression level may vary. We evaluated by flow cytometry the effect of STC1 treatment in non-transfected cells and cell with TfR1 overexpression. The treatment with STC demonstrated a similar effect to treatment with transferrin, a known ligand for receptor, which decreased the number of positive cells for staining with fluorochrome (transferrin conjugated to Alexa Fluor® 488 - Life Technologies). We also demonstrated by Western Blot that STC1 added to the supernatant of cultures of cells, especially cells that overexpress transferrin receptor, is internalized into the cells and detectable in the cell lysate. Additionally, in subcellular localization experiments by immunofluorescence STC1 was detected in a timely manner and scattered in the cytoplasm. Together all this information suggests that STC1 and transferrin interferes with the localization of the transferrin receptor in the cellular surface and perhaps this receptor is involved in the mechanism of internalization of STC1 / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jörg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T01:34:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_MarcosTadeudos_D.pdf: 15943486 bytes, checksum: 39810fdf0ace76e5e8963354bdc460ca (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O objetivo deste projeto foi estudar genes ativados em células do estroma da medula óssea, induzidos pela co-cultura com blastos leucêmicos, na tentativa de uma melhor compreensão sobre o crostalk entre estas células no microambiente tumoral. Nós identificamos Stanniocalcina-1 (STC1) como um potencial marcador molecular do microambiente tumoral, uma vez que sua expressão foi aumentada cerca de 7 vezes em células do estroma co-cultivadas com blastos leucêmicos primários. STC1 humana é uma glicoproteína secretada e tem sido descrita participando em diferentes processos fisiológicos, incluindo a angiogênese, hipóxia e principalmente, a carcinogênese. Nós produzimos a proteína recombinante STC1 no sistema baculovírus e também anticorpos monoclonais, usados em um ensaio ELISA, que agora será testado como um novo kit de diagnóstico de leucemia por uma empresa brasileira. Além disso, identificamos novos parceiros de interação para STC1 através do sistema de duplo hibrido em levedura sendo que algumas destas interações foram confirmadas por GST-pull down. A região Nterminal foi identificada como sendo a região responsável pela interação de STC1 com seus parceiros. Estudos de localização sub-celular por microscopia, revelaram uma deposição ubíqua citoplasmática e puntiforme nuclear, lembrando corpúsculos nucleares relacionados a SUMOilação. Embora STC1 interaja com a proteína SUMO1 e tenha uma predição de alta probabilidade para ser SUMOilada, ensaios in vitro e in vivo não conseguiram detectar STC1 SUMOilada. No entanto, observamos que STC1 regula a SUMOilação de forma significativa em três outras proteínas. Essas descobertas sugerem um novo papel para STC1 no ciclo de SUMOilação, agindo como uma SUMO E3 ligase. Observamos também que STC1 possui um receptor na membrana plasmática em linhagem de células leucêmicas K562 e que a incubação de STC1 com outras células leucêmicas parece favorecer a proliferação destas células ao passo que estimula uma maior produção da própria STC1 intracelular em células do estroma. Juntos, todos estes resultados abrem novas pistas promissoras a serem exploradas no futuro, uma vez que todos os resultados mostram ligações interessantes com estudos funcionais anteriores em STC1 / Abstract: The aims of this project is to study upregulated genes on bone marrow stromal cells, induced by the co-culture with leukemic blasts, trying to have a better understand about the crosstalk between these cells in the tumor microenvironment. We identified Stanniocalcin-1 (STC1) as a putative molecular marker for the leukemic microenvironment, once its expression was increased around 7 times in stromal cells co-cultivated with primary leukemic blasts. Human STC1 is a secreted glycoprotein that has been implicated in different physiological process, including angiogenesis, hypoxia and mainly in carcinogenesis. We produced the recombinant protein STC1 in baculovirus system and monoclonal antibodies for an ELISA assay that now will be tested as a new leukemia diagnostic kit by a Brazilian company. Moreover, we identified new interacting protein partners for STC1 by yeast two hybrid system and some of these interactions were confirmed by GST-pull down assays. The N-terminal region was mapped to be the region that mediates the interaction between STC1 and its partners. Microscopic subcellular localization, revealed an ubiquitous cytoplasmic and dot-like nuclear deposition, resembling SUMOylation related nuclear bodies. Although STC1 interacts with SUMO-1 and has a high theoretical prediction score for a SUMOylation site, in vitro and in vivo assays could not detect STC1 SUMOylation. However, we found that STC1 significantly regulates the SUMOylation of three other proteins. These ??ndings suggest a new role for STC1 in SUMOylation cycle, acting as a SUMO E3 ligase. We either observe that STC1 has a plasmatic membrane receptor in K562 leukemic cell lines and the incubation of STC1 with other leukemic cells suggest a increase of proliferation of these cells and stimulates the production of more intracellular STC1 at stromal cells. Together, all of these findings open promising new avenues to be explored in future detailed studies, since they all show interesting connections with previous functional studies on STC1 / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Jorg Kobarg, Jose Andres Yunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T22:20:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Trindade_DanielMaragno_D.pdf: 7352494 bytes, checksum: 5b03d143205e747b05e3d4b6a8ed8e34 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Staniocalcinas (STCs) representam uma pequena família de hormônios glicoprotéicos, encontrados em todos os vertebrados e composta por STC1 e STC2, que foram inicialmente implicados na homeostase de cálcio e recentemente também foram implicados em vários outros processos. Stanniocalcina-1 (STC1), o primeiro membro encontrado, foi originalmente descoberto em peixes ósseos e posteriormente identificado em humanos onde parece ter um papel, embora ainda obscuro, na carcinogênese e angiogênese. Nos seres humanos STC1 pode ser encontrado em duas formas: um dímero ou um grupo de variantes de alto peso molecular coletivamente chamados bigSTC. Uma vez que ambas as células leucêmicas e os tumores sólidos dependem vascularização, a angiogênese é um passo fundamental na interação tumorhospedeiro e essencial para a progressão do câncer. Análises prévias de microarray resultaram na identificação de vários genes ativados em células endoteliais da medula óssea (BMEC) modulados pela presença de células leucêmicas. Apresentamos aqui STC1 como um marcador microambiente de medula óssea (BMM) durante leucemia linfoblástica aguda (LLA) pela validação dos dados prévios de microarray através de PCR em tempo real quantitativos. Em vista da falta de informações funcionais e estruturais sobre STC1 realizamos: (1) um screen no sistema de duplo híbrido em levedura, a fim de encontrar algumas das proteínas que interagem com a STC1 humana, e (2) uma caracterização estrutural inicial à baixa resolução desta proteína. Fomos capazes de construir um mapa interação proteína-proteína, obtido a partir dos 22 interactantes encontrados em screen de duplo híbrido em levedura. As proteínas encontradas apresentam-se em vários compartimentos celulares nos quais STC1 já foi demonstrada para estar presente, e essas novas informações podem ajudar a esclarecer como e qual o papel STC1 desempenha nesses locais. A fim de fornecer informação estrutural sobre STC1, realizamos análises bioquímicas e estruturais da proteína recombinante STC1 com 6xHis tag produzida em células de inseto utilizando o sistema baculovírus. A análise de dicroísmo circular confirmou a predição in silico do elevado conteúdo de alfa-helices. A análise por espectrometria de massas forneceu os dados experimentais que confirmaram o padrão conservado de pontes dissulfeto anteriormente descrito para STC1 de peixes. Finalmente, os dados de espalhamento de raios-X a baixo ângulo demonstraram que, STC1 adota uma estrutura dimérica, ligeiramente alongada em solução fornecendo deste modo os primeiros dados estruturais à baixa resolução desta família de proteínas. Além disso, foi possível obter proteína suficiente e de elevado grau de pureza para realizar ensaios cristalização que resultaram em cristais os quais difrataram a boa resolução. / Abstract: Staniocalcins (STCs) represent a small family of glycoprotein hormones found in all vertebrates composed by STC1 and STC2, which have been initially implicated in calcium homeostasis and also recently implicated in several other processes. Stanniocalcin-1 (STC1), the first member found, was originally discovered in bony fishes and later identified in humans were it seems to have a role, although still unclear, in carcinogenesis and angiogenesis. In humans STC1 can be found in two forms: a dimer or a group of higher molecular weigh variants collectively called bigSTC. Since both leukemic cells and solid tumors depend on vascularization, angiogenesis is a fundamental step in tumor-host interaction and essential to the cancer progression. Previous microarray analysis resulted in the identification of several activated genes in bone marrow (BM) endothelial cells (BMEC) modulated by presence of leukemic cells. Here we present STC1 as a BM microenvironment marker during acute lymphoblastic leukemia (ALL) by validating previous microarray data by quantitative RealTime-PCR. In view of the lack of functional and structural information on STC1 we performed (1) a yeast two hybrid screen in order to find some of the human STC1 interacting proteins and (2) a initial structural lowresolution characterization of this protein. We were able to construct a protein-protein interaction map, derived from the 22 interactants found in our yeast two-hybrid screen. The proteins found are located in several cellular compartments in which STC1 has already been shown to be present, and the new information might help to clarify how and which role it performs at these sites. As a means to provide structural information about STC1, we performed biochemical and structural analyses of recombinant STC1 6xHis tagged protein produced in insect cells by using the baculovirus system. Circular dichroism analysis confirmed the in silico predicted high alpha-helical content. By mass spectroscopy analysis we provided experimental data that confirmed the conserved disulfide pattern previously described for fish STC1. Finally Small Angle X-ray Scattering data demonstrated that STC1 adopts a dimeric, slightly elongated structure in solution, providing there by the first low resolution structural data of this family of proteins. Additionally, we could obtain enough protein of high purity to perform crystallization trials that resulted in crystals diffracting at good resolution. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular