Submitted by AYDIR CECILIA MARINHO MONTEIRO null (aydircecilia@hotmail.com) on 2016-10-30T22:55:48Z No. of bitstreams: 1 Tese (versão final).pdf: 3741275 bytes, checksum: a56941e558bffd4fb2e51986a89824c4 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-11-04T17:30:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 monteiro_acm_dr_bot.pdf: 3643091 bytes, checksum: 5dae4f73de940fc181da5d34fc678e3b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-04T17:30:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 monteiro_acm_dr_bot.pdf: 3643091 bytes, checksum: 5dae4f73de940fc181da5d34fc678e3b (MD5) Previous issue date: 2016-10-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A rápida e precisa identificação de micro-organismos causadores de infecções da corrente sanguínea é uma das funções mais importantes do laboratório de microbiologia clínica. Com o objetivo de diminuir o tempo gasto para se identificar esses micro-organismos, vários equipamentos foram desenvolvidos, entre eles o sistema VITEK® 2, usado na rotina de diversos laboratórios de microbiologia clínica para a identificação de isolados de amostras clínicas. Inúmeros micro-organismos são isolados de hemoculturas e as bactérias pertencentes ao grupo dos cocos Gram-positivos aeróbios são os principais agentes etiológicos das infecções de correntes sanguíneas, principalmente em pacientes mantidos em unidades de terapia intensiva (UTIs). Este trabalho comparou sistemas de identificação de espécies de micro-organismos isolados a partir de hemoculturas e acompanhou os pacientes com hemoculturas positivas para Estafilococos coagulase-negativa (ECN). A partir dessas hemoculturas positivas coletadas de 216 pacientes foram isolados e identificados 400 microorganismos, dentre eles 5 bacilos Gram-positivos, 15 leveduras, 165 bacilos Gram-negativos e 215 cocos Gram-positivos. Essa identificação foi realizada pelo sistema VITEK® 2 e os resultados foram comparados com os obtidos em provas fenotípicas convencionais e nos métodos genotípicos. Os pacientes com hemoculturas positivas para ECN foram acompanhados durante sua permanência no hospital com a coleta de seus dados clínicos dos prontuários. O sistema automatizado VITEK® 2 identificou corretamente 94,7% das amostras, os cartões YST e GN apresentaram 100% de identificações corretas das leveduras e dos bacilos Gram-negativos, respectivamente, ao passo que o GP identificou corretamente 92,6% dos cocos Gram-positivos. A sensibilidade apresentada pelo sistema VITEK® 2 e a análise estatística permitem concluir que esse equipamento é uma opção viável na rotina de laboratórios de microbiologia clínica para a identificação de micro-organismos. A análise multivariada para o desfecho óbito no estudo de coorte dos pacientes que apresentaram hemocultura positiva para ECN revelou associações positivas com AIDS e com hemocultura positiva para S. hominis, enquanto o uso de meropenem mostrou associação negativa. Na análise do desfecho múltiplas hemoculturas positivas para ECN, foi verificada associação positiva com pacientes em choque que necessitavam de droga vasoativa. Isso sugere que a gravidade da sepse (choque) é um preditor da significância clínica de ECN com o isolamento em mais de uma hemocultura, um dos critérios mais utilizados para valorização clínica desses micro-organismos quando isolados da corrente sanguínea. A análise da curva de sobrevida dos pacientes incluídos na coorte revelou que pacientes com hemocultura positiva para a espécie S. hominis apresentaram menor sobrevida quando comparados com pacientes com hemoculturas para outras espécies de ECN, indicando a importância dessa espécie na gravidade das infecções da corrente sanguínea. / The rapid and accurate identification of microorganisms which cause bloodstream infections is one of the major roles of the clinical microbiology laboratory. Aiming at reducing the time spent in identifying such microorganisms, several devices have been developed, including the VITEK® 2 system, which is routinely used in a number of clinical microbiology laboratories for identifying isolates from clinical specimens. A lot of microorganisms are isolated from blood cultures; bacteria belonging to the group of aerobic Gram-positive cocci are the main etiological agents of bloodstream infections, especially in patients kept in intensive care units (ICUs). The objectives of this study were to compare the performance of (manual and automated) species identification systems for microorganisms isolated from blood cultures by evaluating the performance of VITEK® 2 system and also to conduct a cohort study of patients who had blood cultures positive for Coagulase-negative staphylococci (CoNS) in order to address two outcomes: isolation of CoNS in more than one blood culture as opposed to a single blood culture and the factors associated with patient prognosis. Four hundred microorganisms isolated from blood cultures were identified: 5 Gram-positive bacilli, 15 yeasts, 165 Gram-negative bacilli, and 215 Gram-positive cocci. This identification was carried out by the VITEK® 2 system and the results were compared with those obtained from conventional phenotypic tests and genotypic methods. Patients with blood cultures positive for CoNS were followed during their stay in hospital with collecting the clinical data from their medical records. The automated VITEK® 2 system accurately identified 94.7% of the specimens. The YST and GN ID cards had 100% accurate identifications of the yeasts and the Gram-negative bacilli respectively, whereas the GP ID card accurately identified 92.6% of the Gram-positive cocci. The susceptibility of the VITEK® 2 system and the statistical analysis allow the conclusion that this instrument is a viable option in the routine of clinical microbiology laboratories for microorganism identification. The multivariate analysis for death as the outcome in the cohort study of patients with CoNS positive blood culture revealed positive associations with AIDS and with blood culture positive for S. hominis, while the use of meropenem showed a negative association. In analyzing the outcome of multiple blood cultures positive for CoNS, a positive association was observed in patients with shock (requiring vasoactive drugs). It suggests that the sepsis (shock) severity is a predictor of CoNS clinical significance with the isolation in more than one blood culture, which is one of the most commonly used criteria for clinical recovery of the microorganisms when isolated from the bloodstream. The analysis of the survival curve of patients included in the cohort revealed that patients with blood cultures positive for S. hominis species showed lower survival compared to patients with blood cultures for other species of CoNS, which indicates the importance of this species in the severity of bloodstream infections. / FAPESP: 2012/15366-8

Orientador: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza Cunha / Resumo: A rápida e precisa identificação de micro-organismos causadores de infecções da corrente sanguínea é uma das funções mais importantes do laboratório de microbiologia clínica. Com o objetivo de diminuir o tempo gasto para se identificar esses micro-organismos, vários equipamentos foram desenvolvidos, entre eles o sistema VITEK® 2, usado na rotina de diversos laboratórios de microbiologia clínica para a identificação de isolados de amostras clínicas. Inúmeros micro-organismos são isolados de hemoculturas e as bactérias pertencentes ao grupo dos cocos Gram-positivos aeróbios são os principais agentes etiológicos das infecções de correntes sanguíneas, principalmente em pacientes mantidos em unidades de terapia intensiva (UTIs). Este trabalho comparou sistemas de identificação de espécies de micro-organismos isolados a partir de hemoculturas e acompanhou os pacientes com hemoculturas positivas para Estafilococos coagulase-negativa (ECN). A partir dessas hemoculturas positivas coletadas de 216 pacientes foram isolados e identificados 400 microorganismos, dentre eles 5 bacilos Gram-positivos, 15 leveduras, 165 bacilos Gram-negativos e 215 cocos Gram-positivos. Essa identificação foi realizada pelo sistema VITEK® 2 e os resultados foram comparados com os obtidos em provas fenotípicas convencionais e nos métodos genotípicos. Os pacientes com hemoculturas positivas para ECN foram acompanhados durante sua permanência no hospital com a coleta de seus dados clínicos dos prontuários. O sis... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Staphylococcus spp. é uma das principais causas da mastite bovina, onde o uso de antimicrobianos tem sido comprometido por mecanismos de resistência bacteriana e geração de resíduos que alteram a qualidade e segurança alimentar do leite e derivados. Foi avaliada a atividade in vitro da nisina (NS), do brometo de dioctadecildimetilamônio (DDA) e do complexo NS/DDA contra Staphylococcus spp. resistentes isolados de mastite bovina. A CBM50 da nisina e DDA foi 50 e 4μg/mL, respectivamente, enquanto que a CBM50 do complexo NS/DDA foi 3/2μg/mL, com efeito parcialmente sinérgico. O estudo de time-kill revelou redução de 3 log10 UFC/mL após uma hora de interação entre NS/DDA e a bactéria. A microscopia de fluorescência confirmou uma perda da viabilidade após 6 horas de interação. A interação NS/DDA resultou na formação de nanopartículas (148,5 nm) catiônicas (+8,84 mV) cuja interação com a superfície bacteriana negativa (-27,32 mV) resultou em ação bactericida. NS/DDA pode ser uma alternativa promissora contra Staphylococcus spp. resistentes isolados de mastite bovina. / Staphylococcus spp. is a major cause of bovine mastitis, where the use of antimicrobials has been compromised by bacterial resistance mechanisms and waste generation that change the food quality and safety of milk and dairy products. The in vitro activity antibacterial was evaluated of the nisin (NS), of the dioctadecyldimethylammonium bromide (DDA) and of the NS/DDA complex against drug-resistant Staphylococcus spp. isolated from bovine mastitis. The CBM50 of nisin and DDA were 50 and 4μg/ml, respectively, while the CBM50 NS/DDA complex was 3/2mg/mL, with partially synergistic effect. The time-kill study showed reduction of 3log10 CFU/mL after an hour of interaction between NS/DDA and bacteria. Fluorescence microscopy confirmed a loss of viability after 6h of interaction. NS/DDA interaction resulted in formation of nanoparticles (148.5 nm) cationic (+8.84 mV) which interact with negative bacterial surface (-27.32 mV) resulted in bactericidal activity. NS/DDA may be a promising alternative against drug-resistant Staphylococcus spp. isolated from bovine mastitis.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os Staphylococcus coagulase-negativos (SCN) são encontrados na pele e mucosas de seres humanos e outros animais, já que algumas espécies são parte constituinte da microbiota normal destes mesmos sítios, e podem constituir um reservatório para SCN. A espécie Staphylococcus epidermidis, é reconhecida como grande oportunista e agente de graves infecções nosocomiais e comunitárias, além de associado com infecções em pacientes submetidos a implantes com dispositivos médicos, e a espécie Staphyloccus haemolyticus é a segunda espécie mais isolada de hemoculturas humanas, sendo uma das espécies que apresenta elevada resistência aos antimicrobianos. O presente estudo teve como objetivo principal investigar a presença de SCN em fômites (estetoscópios, termômetros e esfigmomanômetros) no ambiente hospitalar, identificar as espécies S. haemolyticus e S. epidermidis e correlacionar seus perfis de resistência aos antimicrobianos com a capacidade de produção de biofilme. A técnica de multiplex-mPCR foi empregada na determinação das espécies e a fenotipagem foi realizada pelos testes fenotípicos convencionais. Os perfis de resistência aos antimicrobianos foram verificados através do teste de disco-difusão, determinação da CIM (oxacilina e vancomicina), determinação da CBM e presença do gene mecA. A capacidade de produção de biofilme foi investigada pelos testes do Ágar Vermelho do Congo e ensaios de aderência em superfícies abióticas (poliestireno e vidro) na presença e ausência de oxacilina e vancomicina, além da PCR para o gene icaAD. Os resultados demonstraram que pelos testes bioquímicos convencionais, a espécie mais encontrada foi S. epidermidis (43,5%). Após a confirmação pela técnica de PCR, 29 amostras (82%) foram identificadas como S. epidermidis, e 6 amostras (18%) foram identificadas como S. haemolyticus. Todas as amostras foram multirresistentes, oxacilina resistentes e vancomicina sensíveis, sendo que apenas 5 amostras S. epidermidis (17,2%) foram tolerantes a oxacilina. A presença do gene mecA foi detectada em 71,4% das amostras. Apesar da maioria das amostras ter apresentado capacidade de produzir slime e/ou biofilme não foi observada total correlação com a presença do gene icaAD enfatizando a natureza multifatorial da produção de biofilme. As amostras aderiram melhor ao esfigmomanômetro, e também, neste fômites, foi encontrado a maior porcentagem de amostras positivas para a produção de slime. Para aderência ao vidro e aderência ao poliestireno não foi encontrada correlação com os fômites. Foram isoladas amostras S. epidermidis de todos os sítios hospitalares estudados e S. haemolyticus só não foi encontrado em Enfermaria de Clínica Médica. Em relação aos fômites, S. epidermidis foi encontrado em todos os fômites estudados, e S. haemolyticus, apenas foi encontrado em esfigmomanômetro e em outros fômites. Os fômites estão servindo como fontes de transmissão e disseminação de micro-organismos, sendo necessário maiores estudos a respeito. / Coagulase-negative staphylococci ( SCN ) are found in the skin and mucous membranes of humans and other animals , since some species are a constituent part of the normal flora of these same sites, which may constitute a reservoir for SCN. Staphylococcus epidermidis species, is recognized as a major opportunistic infections and serious nosocomial and community staff, as well as associated with infections in patients undergoing implants with medical devices, and Staphylooccus haemolyticus is the second species most frequent species of human blood cultures, one of species that has a high antimicrobial resistance. The present study aimed to investigate the presence of SCN on fomites (stethoscopes, thermometers and sphygmomanometers) in the hospital environment, identify the species S. haemolyticus and S. epidermidis and correlate their antimicrobial resistance profiles with the ability to produce biofilm. The technique of multiplex mPCR was used in the determination of the species and phenotyping was performed by conventional phenotypic tests. The antimicrobial resistance profiles were checked by the disk diffusion test, MIC determination (oxacillin and vancomycin), determination of MBC and the presence of the mecA gene. The capacity of the biofilm was investigated by testing the Congo Red agar and adhesion assays abiotic surfaces (glass and polystyrene) in the presence and absence of oxacillin and vancomycin in addition to the PCR icaAD gene. The results demonstrated that the conventional biochemical tests, it was found more species S. epidermidis (43,5%). After confirmation by PCR , 29 samples (82%) were identified as S. epidermidis, and 6 samples (18%) were identified as S. haemolyticus. All samples were multiresistant, oxacillin-resistant and vancomycin-sensitive, and only 5 samples S. epidermidis (17,2%) were tolerant to oxacillin. The presence of the mecA gene was detected in 71,4% of samples. Although most of the samples have shown the ability to produce slime and/or biofilm not fully correlate with the presence of the gene was observed icaAD emphasizing the multifactorial nature of biofilm production. Samples adhered better to the sphygmomanometer, and that too, in this fomites, found the highest percentage of samples positive for slime production. For adhesion to glass and adherence to polystyrene was found no correlation with fomites. S. epidermidis samples of all hospital sites studied, and S. haemolyticus were isolated not only found in Infirmary Medical Clinic. Regarding fomites, S. epidermidis was found in all studied fomites, and S. haemolyticus, have been found only on sphygmomanometer and other fomites. The fomites are serving as sources of transmission and spread of microorganisms, and further study concerning necessary.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os Staphylococcus coagulase-negativos (SCN) são encontrados na pele e mucosas de seres humanos e outros animais, já que algumas espécies são parte constituinte da microbiota normal destes mesmos sítios, e podem constituir um reservatório para SCN. A espécie Staphylococcus epidermidis, é reconhecida como grande oportunista e agente de graves infecções nosocomiais e comunitárias, além de associado com infecções em pacientes submetidos a implantes com dispositivos médicos, e a espécie Staphyloccus haemolyticus é a segunda espécie mais isolada de hemoculturas humanas, sendo uma das espécies que apresenta elevada resistência aos antimicrobianos. O presente estudo teve como objetivo principal investigar a presença de SCN em fômites (estetoscópios, termômetros e esfigmomanômetros) no ambiente hospitalar, identificar as espécies S. haemolyticus e S. epidermidis e correlacionar seus perfis de resistência aos antimicrobianos com a capacidade de produção de biofilme. A técnica de multiplex-mPCR foi empregada na determinação das espécies e a fenotipagem foi realizada pelos testes fenotípicos convencionais. Os perfis de resistência aos antimicrobianos foram verificados através do teste de disco-difusão, determinação da CIM (oxacilina e vancomicina), determinação da CBM e presença do gene mecA. A capacidade de produção de biofilme foi investigada pelos testes do Ágar Vermelho do Congo e ensaios de aderência em superfícies abióticas (poliestireno e vidro) na presença e ausência de oxacilina e vancomicina, além da PCR para o gene icaAD. Os resultados demonstraram que pelos testes bioquímicos convencionais, a espécie mais encontrada foi S. epidermidis (43,5%). Após a confirmação pela técnica de PCR, 29 amostras (82%) foram identificadas como S. epidermidis, e 6 amostras (18%) foram identificadas como S. haemolyticus. Todas as amostras foram multirresistentes, oxacilina resistentes e vancomicina sensíveis, sendo que apenas 5 amostras S. epidermidis (17,2%) foram tolerantes a oxacilina. A presença do gene mecA foi detectada em 71,4% das amostras. Apesar da maioria das amostras ter apresentado capacidade de produzir slime e/ou biofilme não foi observada total correlação com a presença do gene icaAD enfatizando a natureza multifatorial da produção de biofilme. As amostras aderiram melhor ao esfigmomanômetro, e também, neste fômites, foi encontrado a maior porcentagem de amostras positivas para a produção de slime. Para aderência ao vidro e aderência ao poliestireno não foi encontrada correlação com os fômites. Foram isoladas amostras S. epidermidis de todos os sítios hospitalares estudados e S. haemolyticus só não foi encontrado em Enfermaria de Clínica Médica. Em relação aos fômites, S. epidermidis foi encontrado em todos os fômites estudados, e S. haemolyticus, apenas foi encontrado em esfigmomanômetro e em outros fômites. Os fômites estão servindo como fontes de transmissão e disseminação de micro-organismos, sendo necessário maiores estudos a respeito. / Coagulase-negative staphylococci ( SCN ) are found in the skin and mucous membranes of humans and other animals , since some species are a constituent part of the normal flora of these same sites, which may constitute a reservoir for SCN. Staphylococcus epidermidis species, is recognized as a major opportunistic infections and serious nosocomial and community staff, as well as associated with infections in patients undergoing implants with medical devices, and Staphylooccus haemolyticus is the second species most frequent species of human blood cultures, one of species that has a high antimicrobial resistance. The present study aimed to investigate the presence of SCN on fomites (stethoscopes, thermometers and sphygmomanometers) in the hospital environment, identify the species S. haemolyticus and S. epidermidis and correlate their antimicrobial resistance profiles with the ability to produce biofilm. The technique of multiplex mPCR was used in the determination of the species and phenotyping was performed by conventional phenotypic tests. The antimicrobial resistance profiles were checked by the disk diffusion test, MIC determination (oxacillin and vancomycin), determination of MBC and the presence of the mecA gene. The capacity of the biofilm was investigated by testing the Congo Red agar and adhesion assays abiotic surfaces (glass and polystyrene) in the presence and absence of oxacillin and vancomycin in addition to the PCR icaAD gene. The results demonstrated that the conventional biochemical tests, it was found more species S. epidermidis (43,5%). After confirmation by PCR , 29 samples (82%) were identified as S. epidermidis, and 6 samples (18%) were identified as S. haemolyticus. All samples were multiresistant, oxacillin-resistant and vancomycin-sensitive, and only 5 samples S. epidermidis (17,2%) were tolerant to oxacillin. The presence of the mecA gene was detected in 71,4% of samples. Although most of the samples have shown the ability to produce slime and/or biofilm not fully correlate with the presence of the gene was observed icaAD emphasizing the multifactorial nature of biofilm production. Samples adhered better to the sphygmomanometer, and that too, in this fomites, found the highest percentage of samples positive for slime production. For adhesion to glass and adherence to polystyrene was found no correlation with fomites. S. epidermidis samples of all hospital sites studied, and S. haemolyticus were isolated not only found in Infirmary Medical Clinic. Regarding fomites, S. epidermidis was found in all studied fomites, and S. haemolyticus, have been found only on sphygmomanometer and other fomites. The fomites are serving as sources of transmission and spread of microorganisms, and further study concerning necessary.

Staphylococcus spp. é uma das principais causas da mastite bovina, onde o uso de antimicrobianos tem sido comprometido por mecanismos de resistência bacteriana e geração de resíduos que alteram a qualidade e segurança alimentar do leite e derivados. Foi avaliada a atividade in vitro da nisina (NS), do brometo de dioctadecildimetilamônio (DDA) e do complexo NS/DDA contra Staphylococcus spp. resistentes isolados de mastite bovina. A CBM50 da nisina e DDA foi 50 e 4μg/mL, respectivamente, enquanto que a CBM50 do complexo NS/DDA foi 3/2μg/mL, com efeito parcialmente sinérgico. O estudo de time-kill revelou redução de 3 log10 UFC/mL após uma hora de interação entre NS/DDA e a bactéria. A microscopia de fluorescência confirmou uma perda da viabilidade após 6 horas de interação. A interação NS/DDA resultou na formação de nanopartículas (148,5 nm) catiônicas (+8,84 mV) cuja interação com a superfície bacteriana negativa (-27,32 mV) resultou em ação bactericida. NS/DDA pode ser uma alternativa promissora contra Staphylococcus spp. resistentes isolados de mastite bovina. / Staphylococcus spp. is a major cause of bovine mastitis, where the use of antimicrobials has been compromised by bacterial resistance mechanisms and waste generation that change the food quality and safety of milk and dairy products. The in vitro activity antibacterial was evaluated of the nisin (NS), of the dioctadecyldimethylammonium bromide (DDA) and of the NS/DDA complex against drug-resistant Staphylococcus spp. isolated from bovine mastitis. The CBM50 of nisin and DDA were 50 and 4μg/ml, respectively, while the CBM50 NS/DDA complex was 3/2mg/mL, with partially synergistic effect. The time-kill study showed reduction of 3log10 CFU/mL after an hour of interaction between NS/DDA and bacteria. Fluorescence microscopy confirmed a loss of viability after 6h of interaction. NS/DDA interaction resulted in formation of nanoparticles (148.5 nm) cationic (+8.84 mV) which interact with negative bacterial surface (-27.32 mV) resulted in bactericidal activity. NS/DDA may be a promising alternative against drug-resistant Staphylococcus spp. isolated from bovine mastitis.