Staphylococcus spp. é uma das principais causas da mastite bovina, onde o uso de antimicrobianos tem sido comprometido por mecanismos de resistência bacteriana e geração de resíduos que alteram a qualidade e segurança alimentar do leite e derivados. Foi avaliada a atividade in vitro da nisina (NS), do brometo de dioctadecildimetilamônio (DDA) e do complexo NS/DDA contra Staphylococcus spp. resistentes isolados de mastite bovina. A CBM50 da nisina e DDA foi 50 e 4μg/mL, respectivamente, enquanto que a CBM50 do complexo NS/DDA foi 3/2μg/mL, com efeito parcialmente sinérgico. O estudo de time-kill revelou redução de 3 log10 UFC/mL após uma hora de interação entre NS/DDA e a bactéria. A microscopia de fluorescência confirmou uma perda da viabilidade após 6 horas de interação. A interação NS/DDA resultou na formação de nanopartículas (148,5 nm) catiônicas (+8,84 mV) cuja interação com a superfície bacteriana negativa (-27,32 mV) resultou em ação bactericida. NS/DDA pode ser uma alternativa promissora contra Staphylococcus spp. resistentes isolados de mastite bovina. / Staphylococcus spp. is a major cause of bovine mastitis, where the use of antimicrobials has been compromised by bacterial resistance mechanisms and waste generation that change the food quality and safety of milk and dairy products. The in vitro activity antibacterial was evaluated of the nisin (NS), of the dioctadecyldimethylammonium bromide (DDA) and of the NS/DDA complex against drug-resistant Staphylococcus spp. isolated from bovine mastitis. The CBM50 of nisin and DDA were 50 and 4μg/ml, respectively, while the CBM50 NS/DDA complex was 3/2mg/mL, with partially synergistic effect. The time-kill study showed reduction of 3log10 CFU/mL after an hour of interaction between NS/DDA and bacteria. Fluorescence microscopy confirmed a loss of viability after 6h of interaction. NS/DDA interaction resulted in formation of nanoparticles (148.5 nm) cationic (+8.84 mV) which interact with negative bacterial surface (-27.32 mV) resulted in bactericidal activity. NS/DDA may be a promising alternative against drug-resistant Staphylococcus spp. isolated from bovine mastitis.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os Staphylococcus coagulase-negativos (SCN) são encontrados na pele e mucosas de seres humanos e outros animais, já que algumas espécies são parte constituinte da microbiota normal destes mesmos sítios, e podem constituir um reservatório para SCN. A espécie Staphylococcus epidermidis, é reconhecida como grande oportunista e agente de graves infecções nosocomiais e comunitárias, além de associado com infecções em pacientes submetidos a implantes com dispositivos médicos, e a espécie Staphyloccus haemolyticus é a segunda espécie mais isolada de hemoculturas humanas, sendo uma das espécies que apresenta elevada resistência aos antimicrobianos. O presente estudo teve como objetivo principal investigar a presença de SCN em fômites (estetoscópios, termômetros e esfigmomanômetros) no ambiente hospitalar, identificar as espécies S. haemolyticus e S. epidermidis e correlacionar seus perfis de resistência aos antimicrobianos com a capacidade de produção de biofilme. A técnica de multiplex-mPCR foi empregada na determinação das espécies e a fenotipagem foi realizada pelos testes fenotípicos convencionais. Os perfis de resistência aos antimicrobianos foram verificados através do teste de disco-difusão, determinação da CIM (oxacilina e vancomicina), determinação da CBM e presença do gene mecA. A capacidade de produção de biofilme foi investigada pelos testes do Ágar Vermelho do Congo e ensaios de aderência em superfícies abióticas (poliestireno e vidro) na presença e ausência de oxacilina e vancomicina, além da PCR para o gene icaAD. Os resultados demonstraram que pelos testes bioquímicos convencionais, a espécie mais encontrada foi S. epidermidis (43,5%). Após a confirmação pela técnica de PCR, 29 amostras (82%) foram identificadas como S. epidermidis, e 6 amostras (18%) foram identificadas como S. haemolyticus. Todas as amostras foram multirresistentes, oxacilina resistentes e vancomicina sensíveis, sendo que apenas 5 amostras S. epidermidis (17,2%) foram tolerantes a oxacilina. A presença do gene mecA foi detectada em 71,4% das amostras. Apesar da maioria das amostras ter apresentado capacidade de produzir slime e/ou biofilme não foi observada total correlação com a presença do gene icaAD enfatizando a natureza multifatorial da produção de biofilme. As amostras aderiram melhor ao esfigmomanômetro, e também, neste fômites, foi encontrado a maior porcentagem de amostras positivas para a produção de slime. Para aderência ao vidro e aderência ao poliestireno não foi encontrada correlação com os fômites. Foram isoladas amostras S. epidermidis de todos os sítios hospitalares estudados e S. haemolyticus só não foi encontrado em Enfermaria de Clínica Médica. Em relação aos fômites, S. epidermidis foi encontrado em todos os fômites estudados, e S. haemolyticus, apenas foi encontrado em esfigmomanômetro e em outros fômites. Os fômites estão servindo como fontes de transmissão e disseminação de micro-organismos, sendo necessário maiores estudos a respeito. / Coagulase-negative staphylococci ( SCN ) are found in the skin and mucous membranes of humans and other animals , since some species are a constituent part of the normal flora of these same sites, which may constitute a reservoir for SCN. Staphylococcus epidermidis species, is recognized as a major opportunistic infections and serious nosocomial and community staff, as well as associated with infections in patients undergoing implants with medical devices, and Staphylooccus haemolyticus is the second species most frequent species of human blood cultures, one of species that has a high antimicrobial resistance. The present study aimed to investigate the presence of SCN on fomites (stethoscopes, thermometers and sphygmomanometers) in the hospital environment, identify the species S. haemolyticus and S. epidermidis and correlate their antimicrobial resistance profiles with the ability to produce biofilm. The technique of multiplex mPCR was used in the determination of the species and phenotyping was performed by conventional phenotypic tests. The antimicrobial resistance profiles were checked by the disk diffusion test, MIC determination (oxacillin and vancomycin), determination of MBC and the presence of the mecA gene. The capacity of the biofilm was investigated by testing the Congo Red agar and adhesion assays abiotic surfaces (glass and polystyrene) in the presence and absence of oxacillin and vancomycin in addition to the PCR icaAD gene. The results demonstrated that the conventional biochemical tests, it was found more species S. epidermidis (43,5%). After confirmation by PCR , 29 samples (82%) were identified as S. epidermidis, and 6 samples (18%) were identified as S. haemolyticus. All samples were multiresistant, oxacillin-resistant and vancomycin-sensitive, and only 5 samples S. epidermidis (17,2%) were tolerant to oxacillin. The presence of the mecA gene was detected in 71,4% of samples. Although most of the samples have shown the ability to produce slime and/or biofilm not fully correlate with the presence of the gene was observed icaAD emphasizing the multifactorial nature of biofilm production. Samples adhered better to the sphygmomanometer, and that too, in this fomites, found the highest percentage of samples positive for slime production. For adhesion to glass and adherence to polystyrene was found no correlation with fomites. S. epidermidis samples of all hospital sites studied, and S. haemolyticus were isolated not only found in Infirmary Medical Clinic. Regarding fomites, S. epidermidis was found in all studied fomites, and S. haemolyticus, have been found only on sphygmomanometer and other fomites. The fomites are serving as sources of transmission and spread of microorganisms, and further study concerning necessary.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os Staphylococcus coagulase-negativos (SCN) são encontrados na pele e mucosas de seres humanos e outros animais, já que algumas espécies são parte constituinte da microbiota normal destes mesmos sítios, e podem constituir um reservatório para SCN. A espécie Staphylococcus epidermidis, é reconhecida como grande oportunista e agente de graves infecções nosocomiais e comunitárias, além de associado com infecções em pacientes submetidos a implantes com dispositivos médicos, e a espécie Staphyloccus haemolyticus é a segunda espécie mais isolada de hemoculturas humanas, sendo uma das espécies que apresenta elevada resistência aos antimicrobianos. O presente estudo teve como objetivo principal investigar a presença de SCN em fômites (estetoscópios, termômetros e esfigmomanômetros) no ambiente hospitalar, identificar as espécies S. haemolyticus e S. epidermidis e correlacionar seus perfis de resistência aos antimicrobianos com a capacidade de produção de biofilme. A técnica de multiplex-mPCR foi empregada na determinação das espécies e a fenotipagem foi realizada pelos testes fenotípicos convencionais. Os perfis de resistência aos antimicrobianos foram verificados através do teste de disco-difusão, determinação da CIM (oxacilina e vancomicina), determinação da CBM e presença do gene mecA. A capacidade de produção de biofilme foi investigada pelos testes do Ágar Vermelho do Congo e ensaios de aderência em superfícies abióticas (poliestireno e vidro) na presença e ausência de oxacilina e vancomicina, além da PCR para o gene icaAD. Os resultados demonstraram que pelos testes bioquímicos convencionais, a espécie mais encontrada foi S. epidermidis (43,5%). Após a confirmação pela técnica de PCR, 29 amostras (82%) foram identificadas como S. epidermidis, e 6 amostras (18%) foram identificadas como S. haemolyticus. Todas as amostras foram multirresistentes, oxacilina resistentes e vancomicina sensíveis, sendo que apenas 5 amostras S. epidermidis (17,2%) foram tolerantes a oxacilina. A presença do gene mecA foi detectada em 71,4% das amostras. Apesar da maioria das amostras ter apresentado capacidade de produzir slime e/ou biofilme não foi observada total correlação com a presença do gene icaAD enfatizando a natureza multifatorial da produção de biofilme. As amostras aderiram melhor ao esfigmomanômetro, e também, neste fômites, foi encontrado a maior porcentagem de amostras positivas para a produção de slime. Para aderência ao vidro e aderência ao poliestireno não foi encontrada correlação com os fômites. Foram isoladas amostras S. epidermidis de todos os sítios hospitalares estudados e S. haemolyticus só não foi encontrado em Enfermaria de Clínica Médica. Em relação aos fômites, S. epidermidis foi encontrado em todos os fômites estudados, e S. haemolyticus, apenas foi encontrado em esfigmomanômetro e em outros fômites. Os fômites estão servindo como fontes de transmissão e disseminação de micro-organismos, sendo necessário maiores estudos a respeito. / Coagulase-negative staphylococci ( SCN ) are found in the skin and mucous membranes of humans and other animals , since some species are a constituent part of the normal flora of these same sites, which may constitute a reservoir for SCN. Staphylococcus epidermidis species, is recognized as a major opportunistic infections and serious nosocomial and community staff, as well as associated with infections in patients undergoing implants with medical devices, and Staphylooccus haemolyticus is the second species most frequent species of human blood cultures, one of species that has a high antimicrobial resistance. The present study aimed to investigate the presence of SCN on fomites (stethoscopes, thermometers and sphygmomanometers) in the hospital environment, identify the species S. haemolyticus and S. epidermidis and correlate their antimicrobial resistance profiles with the ability to produce biofilm. The technique of multiplex mPCR was used in the determination of the species and phenotyping was performed by conventional phenotypic tests. The antimicrobial resistance profiles were checked by the disk diffusion test, MIC determination (oxacillin and vancomycin), determination of MBC and the presence of the mecA gene. The capacity of the biofilm was investigated by testing the Congo Red agar and adhesion assays abiotic surfaces (glass and polystyrene) in the presence and absence of oxacillin and vancomycin in addition to the PCR icaAD gene. The results demonstrated that the conventional biochemical tests, it was found more species S. epidermidis (43,5%). After confirmation by PCR , 29 samples (82%) were identified as S. epidermidis, and 6 samples (18%) were identified as S. haemolyticus. All samples were multiresistant, oxacillin-resistant and vancomycin-sensitive, and only 5 samples S. epidermidis (17,2%) were tolerant to oxacillin. The presence of the mecA gene was detected in 71,4% of samples. Although most of the samples have shown the ability to produce slime and/or biofilm not fully correlate with the presence of the gene was observed icaAD emphasizing the multifactorial nature of biofilm production. Samples adhered better to the sphygmomanometer, and that too, in this fomites, found the highest percentage of samples positive for slime production. For adhesion to glass and adherence to polystyrene was found no correlation with fomites. S. epidermidis samples of all hospital sites studied, and S. haemolyticus were isolated not only found in Infirmary Medical Clinic. Regarding fomites, S. epidermidis was found in all studied fomites, and S. haemolyticus, have been found only on sphygmomanometer and other fomites. The fomites are serving as sources of transmission and spread of microorganisms, and further study concerning necessary.

Staphylococcus spp. é uma das principais causas da mastite bovina, onde o uso de antimicrobianos tem sido comprometido por mecanismos de resistência bacteriana e geração de resíduos que alteram a qualidade e segurança alimentar do leite e derivados. Foi avaliada a atividade in vitro da nisina (NS), do brometo de dioctadecildimetilamônio (DDA) e do complexo NS/DDA contra Staphylococcus spp. resistentes isolados de mastite bovina. A CBM50 da nisina e DDA foi 50 e 4μg/mL, respectivamente, enquanto que a CBM50 do complexo NS/DDA foi 3/2μg/mL, com efeito parcialmente sinérgico. O estudo de time-kill revelou redução de 3 log10 UFC/mL após uma hora de interação entre NS/DDA e a bactéria. A microscopia de fluorescência confirmou uma perda da viabilidade após 6 horas de interação. A interação NS/DDA resultou na formação de nanopartículas (148,5 nm) catiônicas (+8,84 mV) cuja interação com a superfície bacteriana negativa (-27,32 mV) resultou em ação bactericida. NS/DDA pode ser uma alternativa promissora contra Staphylococcus spp. resistentes isolados de mastite bovina. / Staphylococcus spp. is a major cause of bovine mastitis, where the use of antimicrobials has been compromised by bacterial resistance mechanisms and waste generation that change the food quality and safety of milk and dairy products. The in vitro activity antibacterial was evaluated of the nisin (NS), of the dioctadecyldimethylammonium bromide (DDA) and of the NS/DDA complex against drug-resistant Staphylococcus spp. isolated from bovine mastitis. The CBM50 of nisin and DDA were 50 and 4μg/ml, respectively, while the CBM50 NS/DDA complex was 3/2mg/mL, with partially synergistic effect. The time-kill study showed reduction of 3log10 CFU/mL after an hour of interaction between NS/DDA and bacteria. Fluorescence microscopy confirmed a loss of viability after 6h of interaction. NS/DDA interaction resulted in formation of nanoparticles (148.5 nm) cationic (+8.84 mV) which interact with negative bacterial surface (-27.32 mV) resulted in bactericidal activity. NS/DDA may be a promising alternative against drug-resistant Staphylococcus spp. isolated from bovine mastitis.

A pesquisa de Staphylococcus spp. coagulase negativa (CNS) em alimentos não é prevista na legislação, entretanto, estas bactérias têm emergido como patógenos oportunistas e sua capacidade enterotoxigênica já foi documentada. O queijo destaca-se entre os principais derivados lácteos associados a intoxicações alimentares e a presença de cepas enterotoxigênicas do gênero Staphylococcus neste alimento representa um risco ao consumidor. O queijo colonial, tradicionalmente consumido pelos gaúchos, não possui regulamento técnico específico e poucos são os estudos relacionados ao risco do consumo desse alimento, bem como, à identificação de micro-organismos presentes nessa matriz. Sendo assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) identificar as espécies de Staphylococcus spp. coagulase negativa, presentes em queijo colonial inspecionado; (ii) pesquisar a presença de genes codificadores de enterotoxinas clássicas (SE), bem como de resistência à penicilina e à meticilina nas cepas isoladas desta matriz. Para tanto, no período de novembro de 2014 a maio de 2015, foram analisadas 205 amostras de queijos coloniais inspecionados, sendo 121 adquiridas em Feiras Modelo e 84 em bancas do Mercado Público de Porto Alegre, compreendendo 17 marcas distintas. O isolamento inicial de Staphylococcus spp. foi realizado de acordo com o protocolo ISO 6888-1:1999, adicionado da triagem fenotípica para CNS. A identificação genotípica dos isolados foi realizada pela amplificação da região V1-V2 do gene 16S rRNA, seguida de sequenciamento e comparação das sequências obtidas no GenBank. A pesquisa de genes de enterotoxinas clássicas foi realizada por amplificação dos genes sea, seb, sec, sed e see. A determinação de resistência à penicilina foi avaliada a partir da amplificação do gene blaZ. Para resistência à meticilina, foi realizado teste de triagem frente à cefoxitina, e confirmação pela pesquisa do gene mecA. O armazenamento sob refrigeração foi observado em quase 90% das amostras coletadas. Entre as 179 colônias retiradas do ágar Baird-Parker, 59 apresentaram-se fenotipicamente compatíveis com CNS e foram identificadas genotipicamente. Treze espécies foram identificadas, sendo Macrococcus caseolyticus (40%) a mais frequente. Das 35 cepas confirmadas como CNS, S. equorum e S. vitulinus foram as espécies predominantes seguidas de S. hyicus, S. saprophyticus e S. epidermidis. O gene blaZ foi detectado em cinco cepas de CNS e em uma cepa de M. caseolyticus, sendo relativamente mais frequente em S. hyicus e S. epidermidis. O gene mecA não foi detectado. Oito cepas de CNS amplificaram algum gene para SE, sendo seb o mais frequente, seguido por sed, sea e see. O gene para enterotoxina C não foi detectado. Onze cepas apresentaram pelo menos um dos genes investigados, das quais, seis cepas apresentaram genes para SE e blaZ, concomitantemente. Os perfis seb/blaZ (n=4) e blaZ (n=3) foram os mais frequentes. Foi possível confirmar a diversidade de Staphylococcus spp. coagulase negativa em queijos coloniais inspecionados, além da baixa frequência de cepas carreadoras de genes para enterotoxinas clássicas e resistência à penicilina e à meticilina. / The investigation of coagulase-negative Staphylococcus spp. (CNS) is not included in food monitoring; although these bacteria have emerged as significant opportunistic pathogens and their toxigenic capacity has been documented. Among the dairy products, cheese features as one of the most involved in food poisoning outbreaks. The presence of enterotoxigenic strains of Staphylococcus in this food therefore represents a hazard for the consumers. Colonial cheese, which is a traditionally consumed cheese type in Rio Grande do Sul, does not have a specific technical regulation, and there are few studies targeting the risk for consumers, or aiming to identify its typical microbiota. Thus, the objectives of this study were: (i) to identify coagulase-negative Staphylococcus spp. species in inspected colonial cheese (ii) to investigate the presence of genes encoding classical enterotoxins (SE), and resistance to penicillin and methicillin in strains obtained from this food. For this purpose, from November 2014 to May 2015, 205 cheese samples were analyzed, 121 of which were acquired in street fairs and 84 in Central Market. The samples belonged to 17 different brands. The isolation of Staphylococcus spp. was performed according to the ISO 6888-1: 1999 protocol, followed by the phenotypic screening of CNS. The genotype identification of the isolates was performed by amplification of the V1-V2 region of the 16S rRNA gene, followed by sequencing and the sequences comparison with the GenBank database. Classical enterotoxin genes were investigated by amplification of sea, seb, sec, sed and see genes. The determination of penicillin resistance was evaluated by the amplification of blaZ gene. For methicillin resistance, a screening test with cefoxitin was conducted followed by confirmation through the mecA amplification. The majority (89,7%) of the collected samples were stored under refrigeration. Among the 179 atypical colonies obtained from Baird-Parker agar, 59 were phenotypically compatible with CNS and were further subjected to genotyping. Thirteen bacterial species were identified, being Macrococcus caseolyticus the most frequent (40%). Thirty-five strains were confirmed as CNS, being S. equorum and S. vitulinus the most prevalent followed by S. hyicus, S. saprophyticus and S. epidermidis. The gene blaZ was detected in five strains of CNS and in one strain of M. caseolyticus, being relatively more frequent in S. hyicus and S. warneri. The mecA gene was not detected. Eight CNS strains amplified SE gene: SEB was the most frequent, followed by SED, SEA and SEE. There was no enterotoxin C gene detected. Eleven strains carried at least one of the genes investigated; six strains presented genes for SE and blaZ, concomitantly. The profiles SEB/blaZ (n = 4) and blaZ (n = 3) were the most frequent. The diversity of CNS in inspected colonial cheeses was confirmed. In addition, the low frequency of strains carrying genes for enterotoxins and resistance to penicillin and methicillin was observed.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:38:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Mirna Miyamoto.pdf: 3227973 bytes, checksum: 7f5d27c4ca1e753ebe05cec66ce51343 (MD5) Previous issue date: 2010-06-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Staphylococcus aureus is a potential pathogen, accounting for 60% of infections in ICU`s and can be found in the nasopharyngeal region and also in the nasal cavity, especially in health care workers who become sources of dissemination of these microorganisms in hospital. However, the indiscriminate use of antibiotics to combat these pathogens, has caused the emergence of bacteria possessing resistance genes such as mecA. Of which are about 30 to 50% of the strains of S. aureus and more than 50% of coagulase-negative staphylococci. The CONS are increasingly becoming the target of concern in hospital environments, increasing the need for screening, prevention and control of resistant strains. Therefore, the objective of this work was the characterization of Staphylococcus sp., looking for the resistance gene and genetic mapping of S. aureus in clinical samples from the cities of Manaus and Porto Velho. The techniques used were biochemical tests, antibiogram, PCR (for 16 rRNA gene and mecA) and MLST. The four strains of CONS were found, three of Staphylococcus sciuri and S. epidermidis, characterized by phenotypic and genotypic tests. They were possessed of the methicillin resistance gene mecA. As for S. aureus studied, failed to detect the presence of the mecA gene, but gene mapping was performed from these samples with the technique of MLST, using five housekeeping genes. In this analysis we observed the formation of two large clusters between the cities of Manaus and Porto Velho, and two samples showed genetic divergence from other, thus demonstrating genetic variability between the cities of northern Brazil. The evidence related in the scientific literature, little research related to knowledge and epidemiological characterization of strains existing in the Amazon region, in this research, we discussed some questions of phenotypic analysis, characterization of new resistant strains and preparation of database for future development of biotechnological tools. / Staphylococcus aureus é um patógeno em potencial, sendo responsável por 60% das infecções nos CTIs, podendo ser encontrado na região da nasofaringe e também nas fossas nasais, principalmente em profissionais da saúde que se tornam fontes de disseminação desses micro-organismos no ambiente hospitalar. No entanto, o uso indiscriminado de antimicrobianos no combate desses patógenos, tem ocasionado o surgimento de bactérias possuidoras de genes de resistência, como o gene mecA, entre as quais, cerca de 30 a 50% das cepas de S. aureus e mais de 50% são de estafilococos coagulase-negativos são portadores deste gene. Os CONS estão cada vez mais se tornando alvo de preocupação nos ambientes hospitalares, aumentando a necessidade de rastreamento, prevenção e controle das cepas resistentes. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização de Staphylococcus sp., quanto a presença do gene de resistência e mapeamento genético de S. aureus em amostras clínicas das cidades de Manaus e Porto Velho. As técnicas aplicadas foram testes bioquímicos, antibiograma, PCR (para gene 16S rRNA e gene mecA) e MLST. Neste trabalho, encontramos quatro cepas de CONS, três de Staphylococcus sciuri e um S. epidermidis, caracterizados por testes fenotípicos e genotípicos, sendo estas possuidoras do gene de resistência a meticilina mecA. Quanto aos S. aureus estudados, não se detectou a presença do gene mecA, mas foi realizado o mapeamento gênico destas amostras com a técnica de MLST, utilizando cinco genes constitutivos. Nesta análise, foi observada a formação de dois grandes agrupamentos principais (clusters) entre as cidades de Manaus e Porto Velho, e duas amostras apresentaram divergência gênica das outras, demonstrando assim, variabilidade genética entre essas cidades da Região Norte do Brasil. Diante das evidências científicas na literatura, escassas pesquisas relacionadas ao conhecimento epidemiológico e caracterização das linhagens existentes na região Amazônica, nesta pesquisa, foram discutidas algumas questões de análise fenotípica, caracterizações de novas cepas resistentes e elaboração de banco de dados para futuro desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas.

A pesquisa de Staphylococcus spp. coagulase negativa (CNS) em alimentos não é prevista na legislação, entretanto, estas bactérias têm emergido como patógenos oportunistas e sua capacidade enterotoxigênica já foi documentada. O queijo destaca-se entre os principais derivados lácteos associados a intoxicações alimentares e a presença de cepas enterotoxigênicas do gênero Staphylococcus neste alimento representa um risco ao consumidor. O queijo colonial, tradicionalmente consumido pelos gaúchos, não possui regulamento técnico específico e poucos são os estudos relacionados ao risco do consumo desse alimento, bem como, à identificação de micro-organismos presentes nessa matriz. Sendo assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) identificar as espécies de Staphylococcus spp. coagulase negativa, presentes em queijo colonial inspecionado; (ii) pesquisar a presença de genes codificadores de enterotoxinas clássicas (SE), bem como de resistência à penicilina e à meticilina nas cepas isoladas desta matriz. Para tanto, no período de novembro de 2014 a maio de 2015, foram analisadas 205 amostras de queijos coloniais inspecionados, sendo 121 adquiridas em Feiras Modelo e 84 em bancas do Mercado Público de Porto Alegre, compreendendo 17 marcas distintas. O isolamento inicial de Staphylococcus spp. foi realizado de acordo com o protocolo ISO 6888-1:1999, adicionado da triagem fenotípica para CNS. A identificação genotípica dos isolados foi realizada pela amplificação da região V1-V2 do gene 16S rRNA, seguida de sequenciamento e comparação das sequências obtidas no GenBank. A pesquisa de genes de enterotoxinas clássicas foi realizada por amplificação dos genes sea, seb, sec, sed e see. A determinação de resistência à penicilina foi avaliada a partir da amplificação do gene blaZ. Para resistência à meticilina, foi realizado teste de triagem frente à cefoxitina, e confirmação pela pesquisa do gene mecA. O armazenamento sob refrigeração foi observado em quase 90% das amostras coletadas. Entre as 179 colônias retiradas do ágar Baird-Parker, 59 apresentaram-se fenotipicamente compatíveis com CNS e foram identificadas genotipicamente. Treze espécies foram identificadas, sendo Macrococcus caseolyticus (40%) a mais frequente. Das 35 cepas confirmadas como CNS, S. equorum e S. vitulinus foram as espécies predominantes seguidas de S. hyicus, S. saprophyticus e S. epidermidis. O gene blaZ foi detectado em cinco cepas de CNS e em uma cepa de M. caseolyticus, sendo relativamente mais frequente em S. hyicus e S. epidermidis. O gene mecA não foi detectado. Oito cepas de CNS amplificaram algum gene para SE, sendo seb o mais frequente, seguido por sed, sea e see. O gene para enterotoxina C não foi detectado. Onze cepas apresentaram pelo menos um dos genes investigados, das quais, seis cepas apresentaram genes para SE e blaZ, concomitantemente. Os perfis seb/blaZ (n=4) e blaZ (n=3) foram os mais frequentes. Foi possível confirmar a diversidade de Staphylococcus spp. coagulase negativa em queijos coloniais inspecionados, além da baixa frequência de cepas carreadoras de genes para enterotoxinas clássicas e resistência à penicilina e à meticilina. / The investigation of coagulase-negative Staphylococcus spp. (CNS) is not included in food monitoring; although these bacteria have emerged as significant opportunistic pathogens and their toxigenic capacity has been documented. Among the dairy products, cheese features as one of the most involved in food poisoning outbreaks. The presence of enterotoxigenic strains of Staphylococcus in this food therefore represents a hazard for the consumers. Colonial cheese, which is a traditionally consumed cheese type in Rio Grande do Sul, does not have a specific technical regulation, and there are few studies targeting the risk for consumers, or aiming to identify its typical microbiota. Thus, the objectives of this study were: (i) to identify coagulase-negative Staphylococcus spp. species in inspected colonial cheese (ii) to investigate the presence of genes encoding classical enterotoxins (SE), and resistance to penicillin and methicillin in strains obtained from this food. For this purpose, from November 2014 to May 2015, 205 cheese samples were analyzed, 121 of which were acquired in street fairs and 84 in Central Market. The samples belonged to 17 different brands. The isolation of Staphylococcus spp. was performed according to the ISO 6888-1: 1999 protocol, followed by the phenotypic screening of CNS. The genotype identification of the isolates was performed by amplification of the V1-V2 region of the 16S rRNA gene, followed by sequencing and the sequences comparison with the GenBank database. Classical enterotoxin genes were investigated by amplification of sea, seb, sec, sed and see genes. The determination of penicillin resistance was evaluated by the amplification of blaZ gene. For methicillin resistance, a screening test with cefoxitin was conducted followed by confirmation through the mecA amplification. The majority (89,7%) of the collected samples were stored under refrigeration. Among the 179 atypical colonies obtained from Baird-Parker agar, 59 were phenotypically compatible with CNS and were further subjected to genotyping. Thirteen bacterial species were identified, being Macrococcus caseolyticus the most frequent (40%). Thirty-five strains were confirmed as CNS, being S. equorum and S. vitulinus the most prevalent followed by S. hyicus, S. saprophyticus and S. epidermidis. The gene blaZ was detected in five strains of CNS and in one strain of M. caseolyticus, being relatively more frequent in S. hyicus and S. warneri. The mecA gene was not detected. Eight CNS strains amplified SE gene: SEB was the most frequent, followed by SED, SEA and SEE. There was no enterotoxin C gene detected. Eleven strains carried at least one of the genes investigated; six strains presented genes for SE and blaZ, concomitantly. The profiles SEB/blaZ (n = 4) and blaZ (n = 3) were the most frequent. The diversity of CNS in inspected colonial cheeses was confirmed. In addition, the low frequency of strains carrying genes for enterotoxins and resistance to penicillin and methicillin was observed.

A pesquisa de Staphylococcus spp. coagulase negativa (CNS) em alimentos não é prevista na legislação, entretanto, estas bactérias têm emergido como patógenos oportunistas e sua capacidade enterotoxigênica já foi documentada. O queijo destaca-se entre os principais derivados lácteos associados a intoxicações alimentares e a presença de cepas enterotoxigênicas do gênero Staphylococcus neste alimento representa um risco ao consumidor. O queijo colonial, tradicionalmente consumido pelos gaúchos, não possui regulamento técnico específico e poucos são os estudos relacionados ao risco do consumo desse alimento, bem como, à identificação de micro-organismos presentes nessa matriz. Sendo assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) identificar as espécies de Staphylococcus spp. coagulase negativa, presentes em queijo colonial inspecionado; (ii) pesquisar a presença de genes codificadores de enterotoxinas clássicas (SE), bem como de resistência à penicilina e à meticilina nas cepas isoladas desta matriz. Para tanto, no período de novembro de 2014 a maio de 2015, foram analisadas 205 amostras de queijos coloniais inspecionados, sendo 121 adquiridas em Feiras Modelo e 84 em bancas do Mercado Público de Porto Alegre, compreendendo 17 marcas distintas. O isolamento inicial de Staphylococcus spp. foi realizado de acordo com o protocolo ISO 6888-1:1999, adicionado da triagem fenotípica para CNS. A identificação genotípica dos isolados foi realizada pela amplificação da região V1-V2 do gene 16S rRNA, seguida de sequenciamento e comparação das sequências obtidas no GenBank. A pesquisa de genes de enterotoxinas clássicas foi realizada por amplificação dos genes sea, seb, sec, sed e see. A determinação de resistência à penicilina foi avaliada a partir da amplificação do gene blaZ. Para resistência à meticilina, foi realizado teste de triagem frente à cefoxitina, e confirmação pela pesquisa do gene mecA. O armazenamento sob refrigeração foi observado em quase 90% das amostras coletadas. Entre as 179 colônias retiradas do ágar Baird-Parker, 59 apresentaram-se fenotipicamente compatíveis com CNS e foram identificadas genotipicamente. Treze espécies foram identificadas, sendo Macrococcus caseolyticus (40%) a mais frequente. Das 35 cepas confirmadas como CNS, S. equorum e S. vitulinus foram as espécies predominantes seguidas de S. hyicus, S. saprophyticus e S. epidermidis. O gene blaZ foi detectado em cinco cepas de CNS e em uma cepa de M. caseolyticus, sendo relativamente mais frequente em S. hyicus e S. epidermidis. O gene mecA não foi detectado. Oito cepas de CNS amplificaram algum gene para SE, sendo seb o mais frequente, seguido por sed, sea e see. O gene para enterotoxina C não foi detectado. Onze cepas apresentaram pelo menos um dos genes investigados, das quais, seis cepas apresentaram genes para SE e blaZ, concomitantemente. Os perfis seb/blaZ (n=4) e blaZ (n=3) foram os mais frequentes. Foi possível confirmar a diversidade de Staphylococcus spp. coagulase negativa em queijos coloniais inspecionados, além da baixa frequência de cepas carreadoras de genes para enterotoxinas clássicas e resistência à penicilina e à meticilina. / The investigation of coagulase-negative Staphylococcus spp. (CNS) is not included in food monitoring; although these bacteria have emerged as significant opportunistic pathogens and their toxigenic capacity has been documented. Among the dairy products, cheese features as one of the most involved in food poisoning outbreaks. The presence of enterotoxigenic strains of Staphylococcus in this food therefore represents a hazard for the consumers. Colonial cheese, which is a traditionally consumed cheese type in Rio Grande do Sul, does not have a specific technical regulation, and there are few studies targeting the risk for consumers, or aiming to identify its typical microbiota. Thus, the objectives of this study were: (i) to identify coagulase-negative Staphylococcus spp. species in inspected colonial cheese (ii) to investigate the presence of genes encoding classical enterotoxins (SE), and resistance to penicillin and methicillin in strains obtained from this food. For this purpose, from November 2014 to May 2015, 205 cheese samples were analyzed, 121 of which were acquired in street fairs and 84 in Central Market. The samples belonged to 17 different brands. The isolation of Staphylococcus spp. was performed according to the ISO 6888-1: 1999 protocol, followed by the phenotypic screening of CNS. The genotype identification of the isolates was performed by amplification of the V1-V2 region of the 16S rRNA gene, followed by sequencing and the sequences comparison with the GenBank database. Classical enterotoxin genes were investigated by amplification of sea, seb, sec, sed and see genes. The determination of penicillin resistance was evaluated by the amplification of blaZ gene. For methicillin resistance, a screening test with cefoxitin was conducted followed by confirmation through the mecA amplification. The majority (89,7%) of the collected samples were stored under refrigeration. Among the 179 atypical colonies obtained from Baird-Parker agar, 59 were phenotypically compatible with CNS and were further subjected to genotyping. Thirteen bacterial species were identified, being Macrococcus caseolyticus the most frequent (40%). Thirty-five strains were confirmed as CNS, being S. equorum and S. vitulinus the most prevalent followed by S. hyicus, S. saprophyticus and S. epidermidis. The gene blaZ was detected in five strains of CNS and in one strain of M. caseolyticus, being relatively more frequent in S. hyicus and S. warneri. The mecA gene was not detected. Eight CNS strains amplified SE gene: SEB was the most frequent, followed by SED, SEA and SEE. There was no enterotoxin C gene detected. Eleven strains carried at least one of the genes investigated; six strains presented genes for SE and blaZ, concomitantly. The profiles SEB/blaZ (n = 4) and blaZ (n = 3) were the most frequent. The diversity of CNS in inspected colonial cheeses was confirmed. In addition, the low frequency of strains carrying genes for enterotoxins and resistance to penicillin and methicillin was observed.

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