Infertilität stellt in unserer heutigen Gesellschaft ein zunehmendes Problem dar. Bei der Suche nach den der Infertilität zugrunde liegenden Ursachen gerät immer mehr die Epigenetik in den Fokus. Epigenetische Prozesse sind nicht nur in die Embryo-nalentwicklung und Wachstumsprozesse des Kindes involviert, sondern auch in korrekte Funktionsweisen von Gameten. Störungen können die Fertilität beeinträch-tigen. Eine besondere Rolle spielen geprägte Gene, die auf einem ihrer Allele, je nach parentaler Herkunft, ein Imprint in Form von DNA-Methylierung tragen. Fehl-regulationen solcher geprägter Gene können zu Imprinting-Erkrankungen führen. Seit Einführung der In-vitro-Fertilisation (IVF) wurden verschiedene assistierte Re-produktionstechniken (ART) entwickelt, um infertilen Paaren zu helfen. Die Sicher-heit dieser Techniken ist nicht abschließend geklärt. Immer wieder wird von nach ART-Behandlung gehäuft auftretenden Imprinting-Erkrankungen berichtet. Diese Erkrankungen stehen jedoch eher in Zusammenhang mit der zugrunde liegenden Infertilität, als mit ART selbst. Dennoch ist es notwendig zu untersuchen inwieweit sich ART eventuell auf den Gesundheitszustand dieser Kinder auswirken könnte. In der hier vorgelegten Arbeit wurde der Zusammenhang von Epigenetik, Infertilität und ART von verschiedenen Standpunkten aus beleuchtet. In humanen Spermien wurde die DNA-Methylierung verschiedener geprägter Gene hinsichtlich Epimutationen untersucht. ICSI (intracytoplasmatic sperm injection) und IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) sind verschiedene Techniken zur Selektion von Spermien für eine ART-Behandlung. Hier wurde un-tersucht, ob IMSI epigenetisch bessere Spermien selektiert als die konventionelle ICSI-Methode. Außerdem ist bekannt, dass in Spermienköpfen fertiler und infertiler Männer Vakuolen vorkommen können, deren epigenetische Bedeutung jedoch un-bekannt ist. Ob diese Vakuolen in Zusammenhang mit Epimutationen stehen könn-ten, wurde ebenfalls überprüft. Dazu wurde bisulfitkonvertierte DNA weniger Sper-mien (11 je Probe) mithilfe der Limiting Dilution (LD)–Technik und Pyrosequenzie-rung analysiert. Insgesamt standen 880 Spermien für diese Untersuchung zur Ver-fügung. Es konnte kein Unterschied zwischen IMSI- und ICSI-selektierten Spermien gefunden werden. Vorhandene Vakuolen im Spermienkopf beeinträchtigten nicht die DNA-Methylierung der Gene hGTL2, hLIT1 und hPEG3. Ein weiteres Projekt befasste sich mit der Frage, inwieweit die Technik der In-vitro-Maturation (IVM) DNA-Methylierung in humanen Oocyten beeinflussen könnte. Bisulfitkonvertierte DNA einzelner humaner Oocyten wurde mit LD und Pyrose-quenzierung analysiert. Verglichen wurden IVM und in vivo gereifte Oocyten. Hier-für standen 139 Oocyten zur Verfügung, wovon 90 mittels IVM und 49 in vivo gereift waren. Untersucht wurden vier geprägte Gene (hGTL2, hLIT1, hPEG3 und hSNRPN) und drei nicht geprägte Gene (hDNMT3Lo, hNANOG und hOCT4). Es konnten keine IVM-bedingten Epimutationen gefunden werden. Im dritten Projekt wurde untersucht, ob sich die DNA-Methylierung normaler Sper-mien von Spermien aus Oligozoospermie-Asthenozoospermie-Teratozoospermie (OAT)–Syndrom-Patienten unterscheidet. Eine weitere Frage war, ob Epimutationen einen Einfluss auf den ART-Ausgang haben. Untersucht wurden 54 Spermienpro-ben von Paaren in ART-Behandlung. Zur Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster der geprägten Gene hGTL2 und hPEG3 sowie der beiden nicht geprägten Pluripotenzgene hNANOG und hOCT4 wurde die Methode Deep Bisulfite Sequencing (DBS) verwendet. Dies ist eine Next Generation Sequencing (NGS)–Technik, angewandt an bisulfitkonvertierter DNA. Diese Technik ermöglicht es mehrere Proben sowie Gene gleichzeitig zu analysieren. Es zeigte sich, dass OAT-Spermien, die zu einer Lebendgeburt geführt hatten, sich epigenetisch nicht von normalen Spermien unterschieden. Besonders viele Epimutationen konnten hingegen in OAT-Spermien gefunden werden, die zu keiner Schwangerschaft ge-führt hatten. Zwischen Spermien die zu einer Lebendgeburt oder keiner Schwan-gerschaft geführt hatten, zeigten sich Unterschiede in der Häufigkeit von hGTL2-Epimutationen. Über die Häufigkeit von Epimutationen konnte eine prädiktive Aus-sage zum ART-Ausgang getroffen werden. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit festgestellt werden, dass sich eine Häu-fung von Epimutationen darauf auswirkt, ob eine Schwangerschaft erreicht werden kann oder nicht. Diese Epimutationen liegen bereits im parentalen Genom vor. Sie werden nicht durch ART verursacht. Allerdings muss man Techniken finden, mit denen man Gameten mit möglichst wenig Epimutationen selektiert, um eine Über-tragung solcher auf das Kind zu verhindern. / Infertility is an increasing problem in today’s society. The search for the underlying causes of infertility reveals more and more the role of epigenetics. Epigenetic pro-cesses are involved in embryo development and growth, but also in the proper func-tion of gametes. Disturbances have been shown to impair fertility. Imprinted genes play an important role. They carry a parental-specific DNA methylation imprint on one of their alleles. Deregulation of these genes leads to imprinting diseases. Since the introduction of in vitro fertilisation (IVF), different assisted reproductive technologies (ART) have been developed to treat infertile couples. The safety of these techniques is not finally solved. Increased rates of imprinting diseases in ART offspring have been reported, but seem more likely to be linked to the underlying parental infertility problems than to ART itself. Nevertheless it is of importance to in-vestigate how ART could affect the health of those children. In the work presented here the relations between epigenetics, infertility and ART have been investigated from different points of view. Firstly, the DNA methylation pattern of different imprinted genes has been investi-gated in human sperm with regard to the frequency of epimutations. ICSI (intracyto-plasmatic sperm injection) and IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) are different techniques to select sperm for ART treatment. It was analysed whether IMSI selects epigenetically superior sperm than the conventional ICSI method. Furthermore it is known that sperm from fertile and infertile men can carry vacuoles in their sperm heads. Their epigenetic relevance is unknown. Whether these vacuoles are linked to epimutations has also been investigated here. Bisulfite converted DNA of a few sperm (11 per sample) was analysed using the Limiting Dilution (LD) technique followed by pyrosequencing. In total 880 sperm were available for analysis. No difference between IMSI and ICSI selected sperm was found. Further, no influence of sperm head vacuoles on the DNA methylation patterns of the genes hGTL2, hLIT1 and hPEG3 could be observed. Secondly, it was of interest whether the in vitro maturation (IVM) technique has an influence on DNA methylation in human oocytes. Bisulfite converted DNA of single human oocytes was analysed with LD and pyrosequencing. IVM oocytes were com-pared to in vivo grown oocytes. A total of 139 oocytes were available, of which 90 oocytes were IVM treated while 49 oocytes were grown in vivo. Four imprinted genes (hGTL2, hLIT1, hPEG3 and hSNRPN) and three non-imprinted genes (hDNMT3Lo, hNANOG and hOCT4) were analysed. No IVM-induced epimutations were detected. Finally, it was investigated whether DNA methylation patterns of normal sperm would differ from sperm of oligozoospermia-asthenozoospermia-teratozoospermia (OAT) syndrome patients. Furthermore it was of interest whether epimutations would influence the ART outcome. A total of 54 sperm samples from couples undergoing ART treatment were investigated. To analyse DNA methylation of the imprinted genes hGTL2 and hPEG3 as well as the non-imprinted pluripotency genes hNANOG and hOCT4, Deep Bisulfite Sequencing (DBS) was applied. This is a Next Generation Sequencing (NGS) technique applied on bisulfite converted DNA, al-lowing the analysis of several samples and genes at once. The obtained results showed that OAT samples, which had led to a live-birth, did not differ epigenetically from normal sperm. Much more epimutations were found in OAT sperm which had failed to achieve a pregnancy. Sperm not being able to achieve a pregnancy differed from sperm that had led to a live-birth with regard to hGTL2 epimutation frequency. In addition, ART outcome can be predicted using the frequency of epimutations. Taken together this work shows that the amount of epimutations influences whether a pregnancy can be achieved or not. Epimutations already exist within the parental genome. They are not caused by ART. Nevertheless, one needs to find techniques with which gametes with as few as possible epimutations are being selected to pre-vent the transmission of these onto the offspring.

Das Verfahren der intracytoplasmatischen Spermainjektion (ICSI) wird seit 1995 an der Universitäts-Frauenklinik Würzburg angewandt. Diese Studie untersuchte die physische und psychische Entwicklung von 73 ICSI-Kindern sowie die Lebenszufriedenheit ihrer Mütter. Anhand des Enzephalopathie-Fragebogens von Meyer-Probst, des Mann-Zeichen-Tests nach Ziler sowie einiger demographischer Variablen konstatierten wir eine durchschnittliche Entwicklung der ICSI-Kinder. Bei den Risikokindern (Mehrlinge, Frühgeborene und Kinder mit zu geringem Geburtsgewicht) zeichnete sich ein Trend zu schlechteren Ergebnissen ab. Ein signifikanter Unterschied errechnete sich nur zwischen Einlingen und Mehrlingen (Irrtumswahrscheinlichkeit < 5 %). Eine erhöhte Fehlbildungsrate, wie in der Literatur häufig beschrieben, konnten wir nicht verzeichnen. Die Lebenszufriedenheit der ICSI-Mütter entsprach dem Vergleichskollektiv, die höchste Zufriedenheit konstatierten wir bezüglich der Freude mit ihren Kindern. Mehrlingsmütter zeigten sich trotz der erhöhten Belastung nicht unzufriedener. Frauen, die sich mehreren Zyklen unterziehen mussten, bis es zu einer erfolgreichen Schwangerschaft kam, weisen immer noch eine geringere Selbstzufriedenheit auf. / Intracytoplasmic sperm injection has been in use at the Women’s Hospital of the University of Wuerzburg since 1995. This study investigated the physical and psychological development of 73 ICSI-children and their mothers’ well-being. Applying the encephalopathy-questionnaire by Meyer-Probst, the man-drawing-test by Ziler and some demographic variables, we found that ICSI children do not display any developmental delay. The high-risk children (multiples, preterms and low birth-weight infants) tend to have poorer outcomes. Significant differences were only found between singletons and twins. A higher rate of malformations in ICSI-children as frequently documented in earlier studies wasn´t observed in this collective. The mothers’ well-being was equal to the comparison group, the highest satisfaction we assessed concerning their happiness with their children. Mothers of multiples didn´t appear to be less contented despite the higher burden. Women who had to undergo several cycles until a pregnancy was achieved, still have lower scores in their satisfaction with their selves.

Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von Endometriose sowie den Einfluss einer vollständigen Endometriose-Resektion auf morphokinetische, mit dem Implantationserfolg korrelierende Aspekte der Embryonenqualität zu untersuchen. Für die zugrundeliegende retrospektive Studie wurden 258 im Rahmen von IVF- und/oder ICSI-Zyklen befruchtete und kultivierte Embryonen von 44 Patientinnen mit histologisch gesicherter Endometriose und 43 Patientinnen mit laparoskopisch ausgeschlossener Endometriose ausgewertet. Sowohl Endometriose als auch die vollständige Endometriose-Resektion wurden als Einflussfaktor der frühen Embryonalentwicklung untersucht. Hierfür wurde unter Anwendung des KIDScore\(^{TM}\) D3 und D5 Implantationsdaten-Algorithmus die Morphokinetik der jeweiligen Embryonen verglichen. Die Analyse ergab keine signifikanten Unterschiede bei den medianen KIDScores\(^{TM}\) D3 zwischen den drei Gruppen aus Patientinnen ohne Endometriose, Patientinnen mit vollständig resezierter Endometriose und Patientinnen ohne vollständige operative Entfernung ihrer Endometriose. Bei den KIDScores\(^{TM}\) D5 erreichten die Embryonen von Patientinnen mit Endometriose ohne vollständige Resektion einen Medianwert von 2,6 (auf einer Skala von 1 bis 9,9), während die Embryonen der Kontrollgruppe aus Patientinnen ohne Endometriose einen Wert von 6,8 erreichten (p = 0,003). Der Medianwert für Embryonen von Endometriose-Patientinnen mit vollständiger chirurgischer Entfernung ihrer Endometriose betrug 7,2, was einen signifikanten Anstieg im Vergleich zu Embryonen von Patientinnen ohne vollständige Resektion darstellt (p = 0,002). Die Umrechnung in die Effektstärke d (Cohens d) ergab einen mittleren Effekt (d = 0,639) für „keine Endometriose“ versus „Endometriose ohne Resektion“ sowie einen großen Effekt (d = 0,93) für „Endometriose-Komplettresektion“ versus „Endometriose ohne Resektion“. In einer Fallserie aus vier Patientinnen, die sich sowohl vor als auch nach vollständiger Resektion ihrer Endometriose IVF-/ICSI-Zyklen unterzogen hatten, zeigten drei von vier Patientinnen eine deutliche Verbesserung der KIDScores\(^{TM}\) nach vollständiger Resektion. Die Schwangerschafts- und Abortraten zwischen Frauen mit und ohne Endometriose(resektion) wichen nicht signifikant voneinander ab. Zusammenfassend scheint die vollständige Resektion der Endometriose die ansonsten tendenziell verminderte Embryonenqualität von Patientinnen, die sich einer künstlichen Befruchtung unterziehen, zu verbessern. Die Daten sprechen daher dafür, Patientinnen mit Endometriose vor IVF oder ICSI zu einem chirurgischen Eingriff zu raten. / The objective of this work was to investigate the effect of endometriosis and its complete resection on embryo quality as assessed by morphokinetic parameters predictive of implantation success. For the underlying retrospective study, 258 embryos fertilized and cultured during IVF and/or ICSI cycles from 44 patients with histologically confirmed endometriosis and 43 patients with laparoscopically excluded endometriosis were evaluated. Endometriosis and complete resection of endometriosis were analyzed as factors influencing early embryonic development. For this purpose, morphokinetic parameters of the respective embryos were compared using the KIDScore\(^{TM}\) D3 and D5 implantation data algorithm. The analysis showed no significant differences in median KIDScores\(^{TM}\) D3 between the three groups of patients without endometriosis, patients with completely resected endometriosis and patients without full surgical removal of endometriosis. For KIDScoresTM D5, embryos from patients with endometriosis without complete resection achieved a median score of 2.6 (on a scale from 1 to 9.9), whereas control group embryos from patients without endometriosis achieved a score of 6.8 (p = 0.003). The median score for embryos from endometriosis patients with complete surgical removal of endometriosis was 7.2, representing a significant increase compared to embryos from patients without complete resection (p = 0.002). Conversion to effect size d (Cohen's d) showed a medium effect (d = 0.639) for "no endometriosis" versus "endometriosis without resection" and a large effect (d = 0.93) for "endometriosis complete resection" versus "endometriosis without resection". In a case series of four patients who underwent IVF/ICSI cycles before and after complete resection, three out of four patients showed a significant improvement in KIDScores\(^{TM}\) after surgery. Pregnancy and miscarriage rates between women with and without endometriosis (resection) did not differ significantly. In conclusion, complete resection of endometriosis appears to improve the otherwise presumably impaired embryo quality in patients undergoing assisted reproduction. The data therefore support recommending surgery prior to IVF or ICSI to patients with endometriosis-associated infertility.

In der Studie wurde untersucht, wie relevant eine durch hohe Milchleistung bedingte höhere Stress- bzw. Stoffwechselbelastung für das Ausbleiben der Fruchtbarkeit bei ansonsten klinisch gesunden Milchkühen ist und inwieweit eine längere freiwillige Wartezeit die Bereitschaft der Kühe für eine wiederholte Trächtigkeit verbessern kann. Die Kühe mit einer freiwilligen Wartezeit von 120 Tagen konnten alle innerhalb von 60 Tagen nach Beendigung der freiwilligen Wartezeit besamt werden, während es in der Vergleichsgruppe nur 92 % waren. Die Trächtigkeitsrate nach der ersten Besamung lag bei 120-tägiger Wartezeit mit 40,7 % um 10,3 % höher als in der Vergleichsgruppe. In der spät besamten Gruppe traten keine embryonalen Fruchtverluste auf, während dieses in der Vergleichsgruppe 8,9 % der Trächtigkeiten betraf. Redaktionsschluss: 26.03.2020

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