Durch das Auftreten neuer Stämme resistenter Krankheitserreger ist die Suche nach neuartigen Wirkstoffen gegen diese, sich ständig weiter ausbreitende Bedrohung, dringend notwendig. Der interdisziplinäre Sonderforschungsbereich 630 der Universität Würzburg stellt sich dieser Aufgabe, indem hier neuartige Xenobiotika synthetisiert und auf ihre Wirksamkeit getestet werden. Die hier vorgelegte Dissertation fügt sich hierbei nahtlos in die verschiedenen Fachbereiche des SFB630 ein: Sie stellt eine Schnittstelle zwischen Synthese und Analyse der Effekte der im Rahmen des SFB630 synthetisierten Isochinolinalkaloid-Derivaten. Mit den hier angewandten bioinformatischen Methoden wurden zunächst die wichtigsten Stoffwechselwege von S. epidermidis R62A, S. aureus USA300 und menschlicher Zellen in sogenannten metabolischen Netzwerkmodellen nachgestellt. Basierend auf diesen Modellen konnten Enzymaktivitäten für verschiedene Szenarien an zugesetzten Xenobiotika berechnet werden. Die hierfür benötigten Daten wurden direkt aus Genexpressionsanalysen gewonnen. Die Validierung dieser Methode erfolgte durch Metabolommessungen. Hierfür wurde S. aureus USA300 mit verschiedenen Konzentrationen von IQ-143 behandelt und gemäß dem in dieser Dissertation vorgelegten Ernteprotokoll aufgearbeitet. Die Ergebnisse hieraus lassen darauf schließen, dass IQ-143 starke Effekte auf den Komplex 1 der Atmungskette ausübt – diese Resultate decken sich mit denen der metabolischen Netzwerkanalyse. Für den Wirkstoff IQ-238 ergaben sich trotz der strukturellen Ähnlichkeiten zu IQ-143 deutlich verschiedene Wirkeffekte: Dieser Stoff verursacht einen direkten Abfall der Enzymaktivitäten in der Glykolyse. Dadurch konnte eine unspezifische Toxizität dieser Stoffe basierend auf ihrer chemischen Struktur ausgeschlossen werden. Weiterhin konnten die bereits für IQ-143 und IQ-238 auf Bakterien angewandten Methoden erfolgreich zur Modellierung der Effekte von Methylenblau auf verschiedene resistente Stämme von P. falciparum 3D7 angewandt werden. Dadurch konnte gezeigt werden, dass Methylenblau in einer Kombination mit anderen Präparaten gegen diesen Parasiten zum einen die Wirkung des Primärpräparates verstärkt, zum anderen aber auch in gewissem Maße vorhandene Resistenzen gegen das Primärpräparat zu verringern vermag. Somit konnte durch die vorgelegte Arbeit eine Pipeline zur Identifizierung der metabolischen Effekte verschiedener Wirkstoffe auf unterschiedliche Krankheitserreger erstellt werden. Diese Pipeline kann jederzeit auf andere Organismen ausgeweitet werden und stellt somit einen wichtigen Ansatz um Netzwerkeffekte verschiedener, potentieller Medikamente aufzuklären. / With the emergence of new strains of resistant pathogens, the search for new compounds against this spreading threat is of utmost importance. The interdisciplinary special research field SFB630 of the University of Würzburg is ready to tackle this task by synthesizing and analysing the effects of xenobiotics. The presented dissertation is seamlessly integrated into the diverse range of special fields of the SFB630: it provides a gateway between synthesis and analysis of the effects of the newly synthesized isoquinoline alkaloid derivatives. The presented bioinformatic methods were used to build a so called metabolic network model of the most important pathways of S. epidermidis RP62A, S. aureus USA300 and human cells. Based on these models it was possible to calculate the enzyme activities for different scenarios of added xenobiotics. The data needed for these calculations were derived directly from gene expression analysis. Validation of this method was done by metabolomic measurements. In order to accomplish this, a strain of S. aureus USA300 was subjected to different concentrations of IQ-143 and processed according to the workflow also published in this dissertation. The results suggest that IQ-143 has very strong effects on the complex 1 of the oxidative phosphorylation – these results are consistent with the results obtained by the metabolic network analysis. Although IQ-238 is structurally a close relative to IQ-143, the effects of this compound are very different: it leads to a drop of the enzyme activities in the glycolysis. Therefore an unspecific toxicity of those compounds based on their chemical structure dould be ruled out. The methods used to model the effects of IQ-143 and IQ-238 on bacteria were furthermore successfully transferred to model the effects of methylene blue on several resistant strains of P. falciparum 3D7. It was shown that a combination of methylene blue and other malaria medications either enhances the effects of the primary medication, or – in the case of a resistant strain – methylene blue was able to mitigate the resistances against the primary medication. The presented dissertation was thus successfully able to build a pipeline to identify the metabolic effects of different compounds on various germs. This pipeline can be expanded to other organisms at any time and therefore yields an important approach to identify network effects of various potential drugs.

Nowadays, more than half of the biotherapeutics are produced in mammalian cell lines as a result of correct protein folding and assembly as well as their faculty to bring about a variety of post-translational modifications. The widespread progression of biosimilars has moved the focus in mammalian cell-culture process development. Thereby, the modulation of quality attributes of recombinant therapeutic proteins has increasingly gained importance from early process development stages. Protein quality directly shapes the clinical efficacy and safety in vivo, and therefore, the control of the complex post-translational modifications, such as glycosylation (e.g. high mannose, fucosylation, galactosylation and sialylation), charge variants, aggregates and low-molecular-weight species formation, is pivotal for efficient receptor binding and for triggering the desired immune responses in patients. In the frame of biosimilar development, product quality modulation methods using the potential of the host cell line are particularly sought after to match the quality profile of the targeted reference medicinal product (RMP) as closely as possible. The environment the cell is dwelling in directly influences its metabolism and the resulting quality profile of the expressed protein. Thereby the cell culture medium plays a central role in upstream manufacturing. In this work, concentration adjustment of selected media components and supplementation with a variety of compounds was performed to alter various metabolic pathways, enzyme activities and in some cases the gene expression levels of Chinese Hamster Ovary (CHO) cells in culture. The supplementation of cell culture medium with the trisaccharide raffinose in fed-batch cultures entailed an increase of the abundance of high mannose glycans in two different CHO cell lines. Raffinose especially favored mannose 5 glycans. At the same time, it impaired cell culture performance, induced changes on the intracellular nucleotide levels and even varied the expression levels of glycosylation-related genes. Supplementation with a number of galactosyltransferase inhibiting compounds, in particular fluorinated galactose analogs (alpha- and beta-2F-peracetyl-galactose), consistently decreased the production of galactosylated monoclonal antibodies (mAb). By means of targeted addition during the culture rather than at the beginning, the inhibition was further increased, while limiting detrimental effects on both growth and productivity. High-throughput screening in 96-deepwell plates showed that spermine and L-ornithine also reduced the level of galactosylation. On the other hand, exploratory screening of a variety of potentially disulfide-bridge-reducing agents highlighted that the inherent low-molecular-species level of the proprietary platform cell culture process was likely due to favored reduction. This hypothesis was reinforced by the observation that supplementation of cysteine and N-acetylcysteine promoted fragmentation. Additionally, fragmentation decreased with higher protein expression. At that point, aiming to improve the efficiency in process development, a rational experimental design method was developed to identify and to define the optimal concentration range of quality modulating compounds by calling on a combination of high throughput fed-batch testing and multivariate data analysis. Seventeen medium supplements were tested in five parallel 96-deepwell plate experiments. The selection process of promising modulators for the follow-up experiment in shake tubes consisted in a three-step procedure, including principal component analysis, quantitative evaluation of their performance with respect to the specifications for biosimilarity and selection following a hierarchical order of decisions using a decision tree. The method resulted in a substantial improvement of the targeted glycosylation profile in only two experimental rounds. Subsequent development stages, namely validation and transfer to industrial-scale facilities require tight control of product quality. Accordingly, further mechanistic understanding of the underlying processes was acquired by non-targeted metabolomic profiling of a CHO cell line expressing a mAb cultured in four distinct process formats. Univariate analysis of intra- and extracellular metabolite and temporal glycosylation profiles provided insights in various pathways. The numerous of parameters were the main driver to carry out principal component analysis, and then, using the methodology of partial-least-square (PLS) projection on latent structures, a multivariate model was built to correlate the extracellular data with the distinct glycosylation profiles. The PLS observation model proved to be reliable and showed its great benefit for glycan pattern control in routine manufacturing, especially at large scale. Rather than relying on post-production interpretation of glycosylation results, glycosylation can be predicted in real-time based on the extracellular metabolite levels in the bioreactor. Finally, for the bioactivity assessment of the glycan differences between the biosimilar and the reference medicinal product (RMP), the health agencies may ask for in the drug registration process, extended ranges of glycan variants need to be generated so that the in vitro assays pick up the changes. The developed glycosylation modulator library enabled the generation of extreme glycosylation variants, including high mannose, afucosylated, galactosylated as well as sialic acid species of both a mAb and an antibody fusion molecule with three N-glycosylation sites. Moreover, to create increased variety, enzymatic glycoengineering was explored for galactosylation and sialylation. The glyco variants induced significant responses in the respective in vitro biological activity assays. The data of this work highlight the immense potential of cell culture medium optimization to adjust product quality. Medium and feed supplementation of a variety of compounds resulted in reproducible and important changes of the product quality profile of both mAbs and a fusion antibody. In addition to the intermediate modulation ranges that largely met the requirements for new-biological-entity and biosimilar development, medium supplementation even enabled quick and straightforward generation of extreme glycan variants suitable for biological activity testing. / Mehr als die Hälfte der Biotherapeutika werden heutzutage aufgrund korrekter Proteinfaltung und korrektem Zusammenbau in tierischen Zelllinien hergestellt, welche zudem die Fähigkeit besitzen, verschiedene posttranslationale Modifikationen zu bewerkstelligen, hergestellt. Der ausgeprägte Aufschwung von Biosimilars hat den Entwicklungsschwerpunkt von Zellkulturverfahren verlagert. Dabei hat die Modulierung der Qualitätsattribute von rekombinanten Proteinen bereits in frühen Entwicklungsstadien eine wichtige Bedeutung erlangt. Die Qualitätsattribute beeinflussen die klinische Wirksamkeit und die In-Vivo-Sicherheit direkt. Somit ist die Regulierung der posttranslationalen Modifikationen, einschließlich der Glykosylierung (mannosereiche, fukosylierte, galaktosylierte und sialylierte Glykane), der Ladungsvarianten, sowie die Bildung von Aggregaten und niedermolekularen Spezien, für effiziente Rezeptorbindung und das Auslösen der gewünschten Immunantwort in Patienten entscheidend. Im Rahmen der Biosimilarentwicklung werden Methoden zur Anpassung der Produktqualität innerhalb des Potentials der Wirtszelle gesucht, um sie möglichst genau dem Referenzarzneimittel anzugleichen. Die Umgebung, in der die Zelle verweilt, beeinflusst ihren Metabolismus und das resultierende Produktqualitätsprofil. Dabei spielen Medien eine zentrale Rolle in der Zellkultur. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden durch Adjustierung von ausgewählten Medienbestandteilen und Ergänzung mit einer Vielfalt von Stoffen diverse Stoffwechselwege, Enzymaktivitäten und in einigen Fällen das Genexpressionsniveau von kultivierten Chinesischen Hamster-Ovarialzellen (CHO) verändert. Die Ergänzung von Zellkulturmedium mit Raffinose, ein Trisaccharid, führte zu einer Erhöhung des mannosereichen Glykosylierungsmusters in zwei unterschiedlichen CHO-Zelllinien. Raffinose begünstigte hauptsächlich Mannose-5-Spezien. Gleichzeitig wurde die Zellkulturleistung beeinträchtigt und zudem intrazelluläre Nukleotidkonzentrationen sowie das Expressionsniveau von Glykosylierungsgenen verändert. Ergänzung mit mehreren Inhibitoren der Galaktosyltransferase, insbesondere fluorierte Galaktosenachbildungen (Alpha- und Beta-2F-Peracetyl-Galaktose), verringerte stetig die Produktion von galaktosylierten monoklonalen Antikörpern (mAb). Durch gezielte Zugabe im Verlauf der Kultur, statt bereits am Anfang, wurde die Inhibition weiter erhöht, und dabei die Einwirkung auf das Zellwachstum und die Produktivität beschränkt. Ein Hochdurchsatz-Screening in 96-Deep-Well-Platten zeigte, dass Spermin und L-Ornithin auch das Ausmaß der Galaktosylierung reduzierte. Andererseits zeigten erste Nachforschungen anhand eines Screenings einer Auswahl von potenziellen Disulfidbrücken-Reduktionsmittel, dass wahrscheinlich begünstigte Reduktion das inhärente Niedermolekular-Speziesniveau des firmeneigenen Zellkulturplattformverfahrens verursacht. Die Hypothese wurde durch die Beigabe von Cystein und N-Acetylcystein bekräftigt. Diese Stoffe begünstigten die Fragmentierung, wohingegen sie bei höherer Proteinexpression abnahm. Mit dem Ziel die Entwicklungseffizienz zu steigern, wurde daraufhin zur Identifikation von qualitätsverändernden Stoffen und Bestimmung der optimalen Konzentrationsbereichen eine rationale Versuchsanordnungsmethode entwickelt. Dazu wurde eine Kombination von Hochdurchsatz-Fed-Batch-Tests und multivariater Datenanalyse herbeigezogen. Siebzehn Mediumergänzungsstoffe wurden in fünf parallelen 96-Deep-Well-Platten-Experimenten getestet. Das Auswahlverfahren von erfolgsversprechenden Modulatoren fürs Nachfolgeexperiment in Schüttelröhrchen umfasste drei Schritte: Hauptkomponentenanalyse, quantitative Evaluierung der Leistung der Modulatoren hinsichtlich der Biosimilaritätsspezifikationen und die Auswahl in Anlehnung an eine hierarchische Entscheidungsreihenfolge mit Hilfe eines Entscheidungsbaums. Die Methode führte in nur zwei Versuchsreihen zu einer erheblichen Annäherung an das gewünschte Glykosylierungsprofil. Anschließende Entwicklungsschritte (Validierung und Transfer in die großtechnische Anlage) erforden eine rigorose Kontrolle der Produktqualität. Demzufolge konnte dank der Non-Targeted Metabolomics Analyse von vier verschiedenen Herstellungsverfahren einer mAb exprimierenden CHO-Zelllinie weitere mechanistische Kenntnisse der zugrunde liegenden Vorgängen gewonnen werden. Univariate Analysen der intra- und extrazellulären Stoffwechselprodukte und die zeitliche Glykosylierungsprofile lieferten einen Einblick in verschiedene Stoffwechselwege. Die Vielzahl von Parametern führte dazu, nach dem Prinzip der Hauptkomponentenanalyse vorzugehen, und dann anhand der Partial Least Squares (PLS)-Projektion auf latente Strukturen ein multivariates Modell zu erstellen, das die extrazellulären Daten mit den individuellen Glykosylierungsprofilen korreliert. Das PLS Beobachtungsmodell stellte sich als verlässlich heraus und zeigte seinen außerordentlichen Nutzen zur Regulierung der Glykanen in der Routineherstellung, insbesondere in der Großanlage. Anstatt sich auf Glykosylierungsresultate nach dem Ende der Produktion zu verlassen, kann die Glykosylierung, basierend auf den Niveaus der extrazellulären Stoffwechselprodukte im Bioreaktor, in Echtzeit vorausgesagt werden. Schließlich können im Rahmen des Arzneigenehmigungsverfahrens Gesundheitsbehörden verlangen, die Glykanunterschiede zwischen dem Biosimilar und dem Referenzarzneimittel zu untersuchen. Damit der biologische Test die Unterschiede nachweisen kann, muss eine erweiterte Palette von Glykanvarianten hergestellt werden. Die entwickelte Glykosylierungsmodulierungsbibliothek ermöglichte, extreme Varianten für mannosereiche, afukosylierte, galaktosylierte und sialylierte Glykane von mAb und einem Antikörperfusionsmolekül mit drei N-Glykosylierungsstellen zu generieren. Für erhöhte Variantenvielfalt wurde die enzymatische Glykoengineering Technologie für die Galaktosylierung und Sialylierung untersucht. Die Glykanvarianten erzeugten signifikante Antworten in der jeweiligen In-Vitro-Bestimmung der biologischen Aktivität. Die Ergebnisse unterstreichen das immense Potential von Zellkulturmediumoptimierung zur Anpassung der Produktqualität. Ergänzung des Mediums und der Nährstofflösung brachte reproduzierbare und beträchtliche Veränderungen der Produktqualität von mAb und eines Fusionsantikörpers hervor. Zusätzlich zu den intermediären Modulierungsbereichen, die mehr als ausreichend den Anforderungen für die Entwicklung von neuen biologischen Wirkstoffen und Biosimilars genügen, ermöglichte die Mediumergänzung auf schnelle und einfache Art und Weise selbst extreme Glykanvarianten zu bilden, die für die Bestimmung der biologischen Aktivität geeignet waren.

Die vorliegende Arbeit präsentiert neue Erkenntnisse zur Biosynthese von 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon (DMHF) und 2,5-Dimethyl-4-methoxy-3(2H)-furanon (DMMF), zwei wichtigen Aromakomponenten in Erdbeeren. Potentielle, mit stabilen Isotopen markierte Vorläufersubstanzen wurden an Erdbeeren appliziert und drei Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Der Nachweis über den erfolgreichen Einbau erfolgte mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie. Anhand der Massenspektren von DMHF und DMMF, die aus den behandelten Erdbeeren mittels Festphasenextraktion isoliert wurden, konnte der Markierungsgrad der Verbindungen ermittelt werden und somit Rückschlüsse über die Effizienz der Metabolisierung der applizierten Zucker zu den beiden Furanonen DMHF und DMMF gezogen werden. Als mögliche Ausgangsstoffe dienten unterschiedlich markierte D-Glucose und D-Fructose, sowie Desoxyzucker, da diese als direkte Vorläufersubstanzen von DMHF und DMMF diskutiert werden. Isotopenmarkierte Desoxy-D-glucose oder Desoxy-D-fructose sind kommerziell nicht erhältlich, weshalb die Verbindungen [1-13C]-1-Desoxy-D-fructose, [6-2H1]-6-Desoxy-D-glucose und [5,6,6,6-2H4]-6-Desoxyhexulose-1-phosphat zuerst synthetisiert werden mussten. Nach Applikation der Desoxyzucker wurde keine Erhöhung des Markierungsgrades an stabilen Isotopen gegenüber dem natürlichen Isotopenverhältnis festgestellt. Somit können 6-Desoxy-D-glucose, 1-Desoxy-D-fructose und 6-Desoxy-D-fructose-1-phosphat als Prekursoren von DMHF und DMMF ausgeschlossen werden. Als gute Vorläufersubstanzen erwiesen sich D-Glucose und D-Fructose. Markierungen (13C und 2H) an Position C-1 oder C-6 der beiden Verbindungen wurden sowohl in DMHF als auch in dessen Methoxyderivat DMMF detektiert, wobei die Applikation von D-Fructose im Gegensatz zur D-Glucose einen höheren Markierungsgrad der Zielverbindungen zur Folge hatte. Durch den Einsatz positionsspezifisch markierter D-Glucose (2H-Markierung an Position C-1, C-2 oder C-4) sollten Aufschlüsse über den Metabolisierungsmechanismus gewonnen werden. Die Markierung der D-[2-2H]Glucose befand sich wie die der D-[1-2H]Glucose in den Methylgruppen der Furanone, was nur durch eine intramolekulare Verschiebung von C-2 nach C-1 erklärbar ist. Diese wurde bei der Glucosephosphatisomerase-katalysierten Umwandlung von D-Glucose-6-phosphat zu D-Fructose-6-phosphat beobachtet. Somit muss D-Glucose bei der Biosynthese von DMHF und DMMF zuerst in diese Intermediate überführt werden. Im Gegensatz zu an Position C-2 markierter D-Glucose ging das Proton an Position C-4 im Laufe der Metabolisierung verloren. Demzufolge findet der in der Natur verbreitete Desoxygenierungsmechanismus von Monosacchariden nicht statt und schließt die Beteiligung von Desoxyzuckern an der Biosynthese von DMHF und DMMF gänzlich aus. Nach Einsatz von uniform markierter D-Fructose konnte sechsfach markiertes DMHF und DMMF identifiziert werden, was durch den Einbau der intakten Kohlenstoffkette zu erklären ist. Dieser Befund und weitere Untersuchungen mit verschiedenen Glykolyse-regulierenden Substanzen deuteten darauf hin, dass die Furanone dem zentralen Kohlenhydratstoffwechsel, der Glykolyse, entspringen. Vor der Aldolase-katalysierten Spaltung in zwei C3-Einheiten muss jedoch eine Abzweigung erfolgen, da sonst die Kohlenstoffkette nicht unverändert vorliegen könnte. Im zweiten Teil der Arbeit ist erstmals mit Hilfe von molekularbiologischen Techniken die vollständige cDNA einer O-Methyltransferase (OMT) aus Erdbeeren isoliert worden. Hierfür wurde mRNA aus reifenden Erdbeeren extrahiert und eine cDNA Bibliothek hergestellt. Diese wurde mit einer OMT-spezifschen Sonde durchmustert, welche durch PCR mit degenerierten Primern synthetisiert worden war. Nach mehreren Vereinzelungs-Zyklen konnte die vollständige cDNA einer O-Methyltransferase (STOMT, Strawberry OMT) erhalten werden. Northern-Analysen ergaben, dass die entsprechende RNA ausschließlich in den verschiedenen Reifestadien der Frucht akkumuliert, mit den höchsten Transkriptmengen in der rot-werdenden und reifen Frucht. In anderen Gewebeteilen wie Wurzel, Blätter, Stängel und Blüte konnte keine STOMT-RNA nachgewiesen werden. Das korrespondierende Protein zeigte hohe Homologien zu Kaffeesäure-OMTs aus Weidengewächsen der Gattung Populus. Nach erfolgreicher, heterologer Expression von STOMT in E. coli wurde die Substratspezifität des Enzyms untersucht, dessen Temperaturoptimum bei 30°C lag. Alle eingesetzten Substrate mit phenolischem Grundgerüst, wie Brenzcatechin, Kaffeesäure, Kaffeeoyl-CoA und 3,4-Dihydroxybenzaldehyd, aber auch das Furanonderivat DMHF wurden von der rekombinanten O-Methyltransferase umgesetzt. Als bestes Substrat erwies sich 3,4-Dihydroxybenzaldehyd, das, im Gegensatz zu dessen Methylierungsprodukt Vanillin, bisher in Erdbeeren nicht nachgewiesen werden konnte. Kaffeesäure wurde ebenfalls effektiv methyliert, worin vermutlich die Hauptaufgabe von STOMT in der Pflanze liegt. Die Methylierung von Kaffeesäure oder 5-Hydroxyferulasäure ist ein wichtiger Prozess in der Entstehung von Lignin. Die Tatsache, dass Erdbeeren teilweise in den Leitbündeln und verstärkt in den Achenen lignifiziert sind, erklärt das Vorhandensein eines solchen Enzyms. DMHF, das als Dienol-Tautomer eine aromatische Struktur mit Hydroxylgruppen aufweist und somit strukturelle Ähnlichkeiten zu phenolischen Verbindungen zeigt, wurde ebenfalls von STOMT als Substrat akzeptiert. Die Bildung von DMMF, dem Methoxyderivat von DMHF erfolgte vergleichsweise langsam, war aber eindeutig auf die Methyltransferase-Aktivität zurückzuführen. STOMT ist aufgrund des Expressionsmusters als fruchtspezifisch und reifeinduziert einzustufen. Primäre Funktion ist vermutlich zu Beginn der Fruchtreifung die Lignifizierung der Leitbündel und später die der Achenen. Gleichzeitig scheint STOMT wesentlich an der Bildung der Aromastoffe DMMF und Vanillin in Erdbeeren beteiligt zu sein. / The present work reveals new insight in the biosynthesis of 2,5-dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone (DMHF) and 2,5-dimethyl-4-methoxy-3(2H)-furanone (DMMF), two important flavor compounds in strawberries. Isotopically labeled precursors were applied to detached strawberries and incubated for three days at room temperature. The successful incorporation of the isotopes was determined by gas chromatography-mass spectroscopy. On the basis of the mass spectra of DMHF and DMMF, isolated from treated strawberries by solid phase extraction, the ratio of labeled and unlabeled compounds was determined. Thus, the conversion of sugars to the furanones DMHF and DMMF could be analyzed in regard to efficiency of metabolism. Differently labeled D-glucose, D-fructose and deoxysugars were used as they are considered to be good precursors of DMHF and DMMF. [1-13C]-1-Deoxy-D-fructose, [6-2H1]-6-deoxy-D-glucose and [5,6,6,6-2H4]-6-deoxyhexulose-1-phosphate had to be synthesized first since these isotopically labeled deoxysugars are not commercially available. After application of the labeled deoxysugars, the ratio of stable isotopes did not change in comparison with the natural isotopic ratio. As a consequence 6-deoxy-D-glucose, 1-deoxy-D-fructose and 6-deoxyhexulose-1-phosphate can be ruled out as precursors of DMHF and DMMF. D-Glucose and D-fructose were converted efficiently to the furanones. The isotopic label (13C and 2H) from position C-1 and C-6 of both carbohydrates was detected in DMHF and its derivative DMMF. In contrast to D-glucose, D-fructose was metabolized more efficiently to the target molecules as the furanones showed a higher degree of labeling. The use of D-glucose labeled at different positions should provide information about the mechanism of the biosynthesis. The label of D-[2-2H]glucose as well as that of D-[1-2H]glucose was recovered in the methyl group of the furanones. This observation was explained by an intra molecular isotope shift from position C-2 to C-1 which was observed in the course of the conversion of D-glucose-6-phosphate to D-fructose-6-phosphate mediated by phosphohexose isomerase. Consequently, D-glucose has to be transformed into these intermediates prior to the formation of DMHF and DMMF. In contrast to D-glucose, which was labeled at position C-2, the label at position C-4 was lost during the transformation. Therefore, the natural mechanism of deoxygenation might not occur during the biosynthesis of DMHF and DMMF. After application of D-[U-13C6]fructose the incorporation of six 13C atoms into DMHF and DMMF was detected. This implies that the complete carbon skeleton is incorporated. These findings and additional studies with different regulatory substances of the glycolysis indicated that the central metabolism of carbohydrates (glycolysis) is involved in the biosynthesis of furanones. Prior to the final cleavage into two C3-fragments by aldolase, another pathway has to branch off, as otherwise the skeleton can not remain unchanged. In the second part of the thesis the complete cDNA of a O-methyltransferase from strawberry was isolated by the means of molecular techniques. First, mRNA was extracted from turning strawberries to construct a cDNA library. An OMT specific fragment, synthesized by PCR with degenerated primers, was used as probe in order to screen the cDNA library. After few cycles of separation a complete cDNA coding for a putative O-methyltransferase (STOMT, strawberry OMT) was obtained. Northern analysis revealed high abundance in the different stages of fruit ripening while highest RNA levels were found in turning and ripe fruit. On the contrary, there were no STOMT-RNA transcripts in other tissue such as root, leaf, petiole and flower. The corresponding protein showed high homology to caffeic acid OMTs from Salicacea (Populus). STOMT was successfully expressed in E. coli in order to determine the substrate specificity. The enzyme showed highest activity at 30°C. All tested phenolic compounds such as catechol, caffeic acid, caffeoyl CoA and protocatechuic aldehyde as well as the furanone derivative DMHF were accepted by the recombinant O-methyltransferase. STOMT converted most rapidly protocatechuic aldehyde, which has not been detected in strawberry yet, to its methylated counterpart vanillin. Caffeic acid was also accepted to a high degree, which is probably the main function in strawberry. The methylation of caffeic acid and 5-hydroxyferulic acid is an important process in the formation of lignin. The fact that the vascular bundles contain lignin and the achenes are strongly lignified explains the presence of such an enzyme in strawberry. The dienolic tautomer of DMHF exhibiting an aromatic structure with two hydroxy groups shows structural homology to phenolic compounds. Therefore, DMHF was accepted as substrate by STOMT. Although the conversion proceeds quite slowly, unequivocally the methoxy derivative descends from DMHF by OMT activity. In accordance with its expression pattern in strawberry, STOMT is fruit specific and induced during ripening. In the course of the maturation, the primary function of STOMT is probably the lignification of the vascular bundles in the beginning and later that of the achenes. On the other hand, STOMT seems to be substantially involved in the biosynthesis of the flavor compounds DMMF and vanillin, too.

Während der Kalbung kommt es neben physischen Belastungen auch zu weit reichenden Veränderungen auf hämatologischer und klinischchemischer Ebene. Durch verschiedene Prozesse kommt es zusätzlich zur Entstehung von oxidativem Stress. Zusammen hat dies einen entscheidenden Einfluss auf das Wohlbefinden, die Gesundheit und die Leistung der Kühe im postpartalen Zeitraum. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, die antioxidative Kapazität und den Stoffwechsel von Färsen im geburtsnahen Zeitraum unter Berücksichtigung des Geburtsverlaufes und des Gesundheitsstatus post partum zu analysieren.

In der vorliegenden Arbeit wurde der peripartale Stoffwechsel von Kühen und Färsen einer Hochleistungsherde untersucht. Es wurde überprüft, ob Kühe mit einer Laktationsleistung über 10000 Liter einen stabilen Stoffwechsel aufweisen können und welche Unterschiede im peripartalen Stoffwechsel erkrankter und gesunder Tiere bestehen. Die Untersuchung erfolgte in einem Milchviehbestand mit 354 Schwarzbunten-Milchkühen und einer durchschnittlichen Milchleistung von 11190 kg Milch pro Jahr. Die Kühe wurden abhängig vom Laktationsstadium in Gruppen gehalten und entsprechend differenziert gefüttert. Das Futter wurde mittels einer totalen Mischration einmal täglich vorgelegt. Die Futterkomponenten wurden wöchentlich im betriebseigenen Analyselabor untersucht und die Futterrationen danach entsprechend angepasst. Die Rückenfettdicke wurde per Ultraschallgerät 8, 3 und 1 Wo ap, zur Kalbung sowie 2, 4, 8 und 12 Wo pp (post partum) gemessen. Der Säure-Basen-Haushalt wurde durch Harnuntersuchungen am 21. und 7. d ap (ante partum) sowie am 3. und 14. d pp mittels fraktionierter Netto-Säure-Basenausscheidung bestimmt. Zur Erfassung der Stoffwechselsituation wurden am 21. und 7. d ap, zur Kalbung sowie am 3. und 14. d pp aus dem Blut folgende klinisch-chemischen Parameter analysiert: GLDH (Glutamat-Dehydrogenase), GGT (Gamma Glutamyl Transferase), AST (Aspartat Amino Transferase), AP (Alkalische Phosphatase), LDH (Lactat-Dehydrogenase), Protein, Albumin, Harnstoff, CK (Creatinkinase), Kreatinin, FFS (Freie Fettsäuren), BHB (Beta-Hydroxy-Butyrat), Bilirubin, Cholesterol, Glucose, Lactat, Ca, P und Mg. Der Energiestoffwechsel der klinisch gesunden Hochleistungskühe war belastet, was sich in erhöhten Konzentrationen der FFS zeigte. Die Medianwerte der BHB-, Bilirubin und Cholesterol-Konzentrationen bewegten sich innerhalb der Toleranzgrenzen. Der Leber-, Eiweiß-, Muskelstoffwechsel sowie Säure-Basen-Haushalt der gesunden Tiere wies nur unbedeutende Veränderungen auf. Die Ergebnisse zeigen beispielhaft, dass Kühe mit hohen Milchleistungen einen physiologischen Stoffwechsel im peripartalen Zeitraum aufweisen und dass die bekannten Toleranzgrenzen für die Laborparameter auch bei Hochleistungskühen im peripartalen Zeitraum angewendet werden können. Das Vorliegen einer Gesundheitsgefährdung wird durch die festgestellte Erkrankungshäufigkeit der Tiere belegt. Von 93 untersuchten Tieren erkrankten 24,7 % an Ovarialzysten, 23,7 % an Puerperalstörungen, 12,9 % an inapparenten Eutererkrankungen, 7,5 % an Labmagenverlagerungen, und 5,4 % kamen zum Festliegen. Diese Morbiditätsrate ist vergleichsweise zu Kühen niedrigerer Leistungsbereiche nicht erhöht. Die Krankheitsgefährdung der Kühe spiegelte sich generell in hohen Konzentrationen freier Fettsäuren ante partum, niedrigen Cholesterolkonzentrationen 3 d pp, einer Unterkonditionierung der Kühe zur Kalbung sowie erhöhten Proteinkonzentrationen 21 d ap wider. Ein bei Hochleistungskühen ausgeprägter „relativer Diabetes der Milchkuh“ stellt möglicherweise einen weiteren Risikofaktor für das Auftreten peripartaler Erkrankungen dar. Im Gegensatz zu den klinisch gesunden Kühen konnte bei den peripartal zum Festliegen gekommenen Kühen eine stärkere Hypophosphatämie sowie eine tendenziell stärkere Belastung des Energiestoffwechsels nachgewiesen werden. Des Weiteren konnten bei diesen Tieren antepartal signifikant niedrigere AP-Aktivitäten gesichert werden. Die an Labmagenverlagerung erkrankten Kühe wiesen im Vergleich zu den gesunden Kühen am 14. d pp lediglich erhöhte BHB-Konzentrationen und erniedrigte Mg-Konzentrationen auf. Die klinisch-chemischen Parameter der an Puerperalstörungen, an inapparenten Eutererkrankungen und an Ovarialzysten erkrankten Tiere wiesen in allen untersuchten Funktionskreisen einen stabilen Stoffwechsel auf. Auffallend und abweichend von den klinisch gesunden Tieren zeigten an Ovarialzysten erkrankte Tiere 4-8 Wo pp einen gesteigerten Rückenfettdickenabbau, und Kühe mit einer inapparenten Eutererkrankung wiesen bereits ab der 8. Wo pp eine Zunahme der Rückenfettauflage auf. Schlussfolgernd ist festzustellen: 1. Hochleistungskühe mit Milchleistungen um 11000 kg/Jahr können trotz starker Belastung des Stoffwechsels im peripartalen Zeitraum ihren Stoffwechsel regulieren. 2. Die bekannten Toleranzgrenzen für Stoffwechselparameter (FÜRLL 2004, 2005) sind zur Anwendung bei Hochleistungskühen gut geeignet. 3. Eine stärkere Gefährdung für Erkrankungen des Fettmobilisationssyndroms konnte festgestellt werden. 4. Retrospektiv betrachtet ließ kein untersuchter Parameter ante partum ein ausreichend frühdiagnostisches Potenzial zur Erkennung einer postpartalen Erkrankung erkennen. / In the present study the metabolism of high yielding dairy cows and heifers in the peripartum period has been examined. The first aim of this study was to investigate if cows with milk yields above 10.000 kg milk per year can have a physiological metabolism. The second aim was to investigate the differences between the metabolism of healthy and unhealthy animals. The data were collected in a commercial dairy farm milking 354 cows with an average milk yield of 11.190 kg per year. The cows were grouped and fed according to their lactation period. The fodder was lined with a total mixed ration once a day and the components were analysed weekly so that the rations could be adapted to the requirements of the animals. The back fat thickness was measured via ultrasonic at 8, 3 and 1 week ap, at birth and 2, 4, 8 and 12 weeks pp. The acid-base-metabolism was analysed by urine examination on day 21 and 7 ap and on day 3 and 14 pp. To know about the metabolic situation of the cows the following blood parameters were measured on day 21 and 7 ap, at birth and on day 3 and 14 pp: glutamate dehydrogenase, gamma glutamyl transferase, aspartate aminotransferase, alkaline phosphatase, lactate dehydrogenase, protein, albumin, blood urea nitrogen, creatine kinase, creatinine, free fatty acids, beta-hydroxybutyrate, bilirubin, cholesterol, glucose, lactate, Ca, P, Mg The energy metabolism of the healthy cows showed a metabolic stress. A complete deviation from the physiological energy metabolism could not be proved. On the whole, the liver metabolism, protein metabolism, muscle metabolism, mineral metabolism and acid-base-balance of the healthy cows showed only negligible deviations. The results illustrate that the known laboratory references for parameters in blood and urine can be used for high yielding dairy cows and that these cows can have a steady metabolism in the peripartum period. The risk of falling ill is reflected by the high rate of diseased cows and heifers. Out of 93 examined animals, 24.7 % suffered from ovarian cysts, 23.7 % from puerperal disturbances, 12.9 % from subclinical mastitis, 7.5 % from a displaced abomasum and 5.4 % developed clinical symptoms of parturient paresis. This examination could detect high concentrations of free fatty acids ante partum, low concentrations of cholesterol on day 3 pp, an under conditioning at birth and high ante partum protein concentrations which are usually described as being serious health risks for animals. A marked relative insulin resistance (diabetes-like-state) may also be considered a health risk. Compared with healthy cows, the animals with symptoms of parturient paresis showed greater hypophosphataemia and a tendentially greater impairment of the energy metabolism. Thus the observed disease pattern is equal to the atypical and hypophosphataemic form. These animals showed significantly lower AP-activities in comparison with the healthy ones. Animals with displaced abomasum showed increased beta-hydroxybutyrate- and lower Mg-concentrations than healthy cows on day 14 pp. Cows with puerperal disturbances, subclinical mastitis and cystic ovarian diseases had a steady metabolism in all investigated spheres of action. Much to the contrary of healthy animals, individuals with ovarian cysts showed a remarkable increased back fat mobilization in week 4-8 pp. In contrast, the cows with subclinical mastitis had a gain of back fat thickness starting from week 8 pp. The results of these studies have shown the following: 1. Dairy cows with a milk yield above 10.000 kg/year can have a steady metabolism in the peripartum period despite high metabolic stress. 2. The known laboratory references for blood and urine parameters (FÜRLL 2004, 2005) are appropriate for high yielding dairy cows in the peripartum period. 3. A higher risk of falling ill with the fat mobiliation syndrom in the peripartum period could be found for the examined dairy cows. 4. Retrospectively, none of the examined parameter showed a sufficient capability for early screening of postpartal diseases ante partum.

Seit Anfang der Siebzigerjahre werden weltweit in Rinderbetrieben in vielfältigen Variationen und Anwendungen Stoffwechseluntersuchungen durchgeführt. Das Hauptaugenmerk lag dabei stets auf Seiten der Energie- und Mineralstoffversorgung. Die Superoxid-Dismutase (SOD) fand hier bislang keine Berücksichtigung. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, die SOD-Aktivität in Stoffwechsel-untersuchungen bei klinisch gesunden Kühen mit ein zu beziehen sowie den Einfluss von Laktation und Jahreszeit zu prüfen. Versuchsanordnung: Insgesamt wurden bei 125 SB/HF-Kühen (7990 kg fettkorregierte Milch/Jahr) folgende drei Gruppen analysiert: Gruppe 1: Im Verlauf eines Jahres wurden im Abstand von 6 Wochen jeweils 10 gesunde Kühe, die sich alle 1-2 Wochen post partum (pp) befanden, untersucht. Zusätzlich wurden die Stall- und die Außentemperaturen berücksichtigt. Gruppe 2: Zur Kontrolle des Laktationsverlaufes wurden 10 Kühe zum Zeitpunkt 4-5 Wochen ante partum (ap), 1 Woche ap, 1-2 Wochen pp, 4 Wochen pp und 8-12 Wochen pp untersucht. Gruppe 3: Um jahreszeitlich bedingte Schwankungen des Stoffwechsels und der SOD-Aktivität in Gruppe 2 auszuschließen, wurden an einem Entnahmetag jeweils sieben verschiedene Kühe zum Zeitpunkt 4-5 Wochen ap, 1 Woche ap, 1-2 Wochen pp, 4 Wochen pp, und 8-12 Wochen pp geprüft. Die Tiere aller drei Gruppen wurden nach der klinischen Untersuchung hämatologisch sowie klinisch-chemisch (SOD, β-Hydroxybutyrat (BHB), Glucose, Cholesterol, Bilirubin, Glutamat-Dehydrogenase (GLDH), Aspartat-aminotransferase (ASAT), Creatinkinase (CK), Protein, Albumin, Harnstoff, Calcium, anorganisches Phosphat, Magnesium, Natrium, Kalium, Chlorid, Eisen) getestet. Auch die Fütterung fand durch Anfertigung einer Rationsberechnung Berücksichtigung. Ergebnisse: Die Ergebnisse der Stoffwechseluntersuchungen und der SOD-Aktivität im Jahresverlauf (Gruppe 1) deuten auf eine verminderte Futteraufnahme in den Sommermonaten infolge Hitzestresses hin. Vor allem ein Absinken der Harnstoff-, Glucose- (positive Korrelation zur SOD-Aktivität), Phosphat- (positive Korrelation zur SOD-Aktivität) und Cholesterolkonzentrationen bei gleichzeitig ansteigenden BHB- (negative Korrelation zur SOD-Aktivität) und Bilirubinkonzentrationen weisen auf eine negative Energiebilanz in diesen Monaten hin. Die Calcium- und Magnesiumkonzentrationen liegen bei allen Tieren im unteren Referenzbereich. Die SOD-Aktivität klinisch gesunder Kühe im Jahresverlauf beträgt 501 bis 978 U/ml Erythrozytenlysat (Interzentilbereich). In Gruppen 2 und Gruppe 3 sind ebenfalls deutliche Schwankungen der Stoffwechselparameter Protein, Harnstoff, Bilirubin, Glucose, BHB und Cholesterol zu beobachten, wobei die stärksten Schwankungen im Zeitraum 1 Woche ap bis 4 Wochen pp vorhanden sind. Auch dies ist durch die reduzierte Futteraufnahme peripartal sowie steigende Futteraufnahme in der Frühlaktation zu erklären. Die SOD-Aktivität der Kühe aus Gruppe 2 zeigt die entsprechenden Schwankungen mit niedrigen Aktivitäten 4-5 Wochen ap bis 1-2 Wochen pp und einen deutlichen Anstieg bis 4 Wochen pp. Die Calcium- und Magnesiumkonzentrationen befinden sich auch in dieser Gruppe im unteren Referenzbereich. In der Gruppe 3 fällt bei den Kühen 4 Wochen pp eine deutliche Stoffwechselbelastung mit erhöhten Bilirubin- und BHB-Konzentrationen sowie ASAT- und GLDH-Aktivitäten auf. In dieser Gruppe sind die Calcium- und Magnesiumkonzentrationen physiologisch. Die SOD-Aktivitäten differieren nur gering mit einer tendenziell höheren Aktivität 4 Wochen pp. Insgesamt fallen im Vergleich zu Gruppe 1 und 2 deutlich höhere SOD-Aktivitäten zwischen 835 und 1758 U/ml Erythrozytenlysat (Interzentilbereich) auf, welche mit den höheren Calcium- und Magnesiumkonzentrationen in Beziehung stehen können. Schlussfolgerungen: Schwankungen von Stoffwechselparametern im Jahres- und Laktationsverlauf betreffen vor allem fütterungsabhängige Parameter. Die SOD-Aktivität verhält sich entsprechend dieser fütterungsabhängigen Parameter mit niedrigerer Aktivität bei längeren Belastungsphasen sowie im geburtsnahen Zeitraum. Statistisch gesicherte Korrelationen ergaben sich mit folgenden fütterungs-abhängigen Parametern: im Jahresverlauf mit BHB, Glucose und anorganischem Phosphat, im Laktationsverlauf in Gruppe 2 mit BHB, Cholesterol, Protein, Glucose, Magnesium und Milchharnstoff und in Gruppe 3 zu BHB und Magnesium. Die Analyse der SOD-Aktivität bereichert die Informationen bei Stoffwechselkontrollen sinnvoll.

In der Literatur wird immer wieder eine gesteigerte Morbidität zu bestimmten Jahreszeiten beschrieben, obwohl generell eine qualitativ und quantitativ ausgewogene Fütterung vorhanden ist. Das Ziel der vor-liegenden Untersuchungen war es, im Verlaufe eines Jahres systematische Stoffwechsel- sowie Leistungskontrollen bei Hochleistungskühen durchzuführen und diese in Beziehung zur Morbidität zu stellen. Dazu wurden bei 118 Schwarzbunten Milchkühen (52 Färsen, 66 Kühe; x̃ 8925 kg FCM/a, Laufstallhaltung) 10 Tage ante partum (d a.p.), drei sowie 28 Tage post partum (d p.p.) Kontrollen in Vollblut (V. jugularis) und Serum sowie Harn (Katheter) durchgeführt. Im Serum wurden die Beta-Hydroxybutyrat- (BHB)-, Glucose-, Freie Fettsäuren (FFS)-, Bilirubin-, Cholesterol-, Gesamtprotein-, Albumin-, Harn-stoff-, Kreatinin-, Calcium (Ca)-, anorganische Phosphat (Pi)-, Magnesium (Mg)-, Natrium (Na)-, Kalium (K)-, Chlorid (Cl-) Konzentrationen, die Creatinkinase (CK)-, Aspartat-Amino-Transferase (AST)- Akti-vitäten und Anti-Lipid A-Antikörper (ALA-AK)- Titer sowie im Harn die pH-Werte, fraktionierte NSBA-, Ca-, Pi-, Mg-, Na-, K- und Kreatininkonzentrationen ermittelt. Für die Mineralstoffe wurde die Fraktio-nierte Elimination (FE) berechnet. Weiterhin wurden Leistungsdaten und die Morbidität erfasst. Von 14 d a.p. bis drei d p.p. wurde die Futterration 1, jeweils totale Misch-Ration (TMR), und von drei d bis 28 d p.p. die Futterration 2 dargeboten. Ihre Kennzahlen schwankten im Verlaufe des Jahres wie folgt: Futter-ration 1 - Netto-Energie-Laktation (NEL) 66,0-72,7 MJ; Rohprotein (XP) 1469-1612 g; Rohfaser (XF) 1460-1669 g; Futterration 2 - NEL 140,3-153,9 MJ; XP 3182-3528 g; XF 2979-3564 g. Die klinisch gesunden Färsen und Kühe hatten vor der Kalbung im Harn pH-Werte und K-Konzentrationen über dem physiologischen Bereich im Sinne einer alkalotischen Belastung. Nach der Kalbung zeigten erhöhte BHB-, FFS-, erniedrigte Albumin- und Mg-Konzentrationen im Serum einen belasteten Energie- und Mineralstoffwechsel bei erhöhtem Kreatinin im Harn (p<0,05). Die BHB-, FFS-, Bilirubin-Konzentrationen, CK- und AST-Aktivitäten waren drei d p.p. signifikant am höchsten, die Cholesterol-, Albumin-, Ca-, Glucose-Konzentrationen, die ALA-AK-Titer im Serum und die pH-Werte, die NSBA-, Basen-, K-Konzentrationen und FE K im Harn signifikant am niedrigsten. Vier Wochen nach der Kalbung erreichten die Cholesterol-, Protein-, Harnstoff-, Mg-Konzentrationen im Serum, Mg-Konzentrationen im Harn und FE Mg signifikant das Maximum und die Kreatinin-, Na-, Cl-Konzentrationen im Serum signifikant das Minimum. An allen drei Kontrollzeitpunkten vor und nach der Kalbung lagen die Glucosekonzentrationen im Serum, die Kreatininkonzentrationen im Harn, die Zahl der neutrophilen Gra-nulozyten über und die Zahl der Lymphozyten unterhalb des Referenzbereiches. Im Vergleich zwischen Färsen und Kühen fielen bei den Kühen an mind. zwei von drei Kontrollzeit-punkten signifikant niedrigere Glucose- (min. 2,98/ 3,43 mmol/l) und ALA-AK-Titer im Serum (min. 74/ 109), Pi-Konzentrationen (min. 0,09/ 0,29 mmol/l) im Harn, höhere Albuminkonzentrationen (min. 28,35/ 29,55 g/l) im Serum sowie FE Ca (min. 0,31/ 0,24 %) als bei den Färsen auf. Diese Unterschiede sind vor allem durch die höhere Milcheinsatzleistung der Kühe bedingt. Dem entsprachen auch u. a. tendenziell drei d p.p. höhere BHB-, FFS- und Proteinkonzentrationen und niedrigere Pi-Konzentrationen im Serum. Es bestanden keine gesicherten Unterschiede an allen drei Kontrollzeitpunkten zwischen Färsen und Kü-hen bei den AST-Aktivitäten, Bilirubin-, Kreatinin-, Cl-Konzentrationen im Serum, Basenkonzentratio-nen im Harn, FE Mg sowie pH-Werten im Harn. Im Jahresverlauf traten Stoffwechselstörungen gehäuft in den Monaten Mai/Juni sowie September bis Februar auf: Die pH-Werte und die NSBA-Konzentrationen waren im Mai/Juni im Bereich starker azido-tischer Belastung und von September bis Dezember nahe der physiologischen Obergrenze. Die FFS-, Bilirubin- und Cholesterolkonzentrationen waren in den Monaten November bis Februar am höchsten und wiesen auf eine stärkere Energie-Fettstoffwechsel-Belastung hin. Im Mai/Juni waren sie am niedrigsten. Ähnlich verhielten sich die Harnstoff-, Ca-, Mg-, Na- bzw. K-Konzentrationen. Die CK-Aktivitäten wa-ren in den Monaten September bis Februar am höchsten; die ALA-AK-Titer hatten im Novem-ber/Dezember die höchsten Titer. Die Veränderungen korrelierten vor allem mit Rohfaser- und Tempera-turschwankungen. Die Morbidität betrug insgesamt bei Endometritis 27,1 %, Mastitis 19,5 %, Klauenerkrankungen 15,3 %, Fruchtbarkeitsstörungen 14,4 %, Retentio sec. 6,8 %, Gebärparese 4,2 %, Ovarzysten 5,1 % und bei Harnwegserkrankungen 3,4 %. Im Jahresverlauf wurden gehäuft Mastitiden im Mai/Juni während einer Hitzeperiode beobachtet, die durch azidotische Belastungen infolge Reduzierung des Rohfaser- zu Gunsten eines höheren Kraftfutter-anteils gefördert wurden. Bei Kühen, die im Mai/Juni abkalbten, traten auch die meisten späteren Fruchtbarkeitsstörungen auf. Klauenerkrankungen und Endometritiden häuften sich in den Monaten Nov bis Feb. Sie gingen mit Störungen im Energiestoffwechsel einher. Frühdiagnostisch fielen die Kühe mit späterer klinscher Mastitis vor der Kalbung durch signifikant höhe-re Glucosekonzentrationen (3,84 mmol/l) im Serum gegenüber den gesunden Kühen (3,53 mmol/l) im Sinne einer relativen Insulinresistenz auf. Drei und 28 d nach der Kalbung waren bei diesen Kühen be-sonders signifikant niedrigere pH-Werte und NSBA-Konzentrationen im Harn und 28 d p.p. signifikant höhere Protein- (88,4 g/l), Glucose- (3,84 mmol/l), Ca-Konzentrationen (2,53 mmol/l) bzw. ALA-AK-Titer (157,5) im Serum sowie Pi-Konzentrationen im Harn (1,03 mmol/l) als Ausdruck azidotischer Be-lastungen mit Entzündungsreaktionen unter Endotoxinbelastung auffällig. Die Kühe mit späterer Gebär-parese zeigten 10 d a.p. schon eine verminderte Futteraufnahme in Verbindung mit einer vermehrten Lipolyse durch gesteigerte Bilirubin- sowie reduzierte Pi- und NSBA-Konzentrationen. Drei d p.p. domi-nierte das Krankheitsgeschehen das Stoffwechselbild. Die Kühe mit einer Retentio sec. hatten gegenüber gesunden drei d p.p. signifikant niedrigere Na- (141,7/ 144,8 mmol/l) und Cl-Konzentrationen (97,5/ 101,0 mmol/l) im Serum sowie Na-Konzentrationen im Harn (1,0/ 8,5 mmol/l). Auch Kühe mit späteren Ovarzysten zeigten drei d p.p. signifikant niedrigere Na-Konzentrationen (0,8/ 8,5 mmol/l) und FE Na (0,007/ 0,115 %) im Harn als die gesunden Kühe. Dies deutet auf eine unzureichende Na-Aufnahme hin. Kühe mit einer subklinischen Endometritis 28 d p.p. fielen mit signifikant niedrigeren pH-Werten (8,18/ 8,41), NSBA- (70,7/ 116,5 mmol/l) und Basenkonzentrationen (161,0/ 218,0 mmol/l) im Harn auf, was auf eine verminderte Futteraufnahme hindeutet. Kühe mit späteren subklinischen Fruchtbarkeitsstörun-gen hatten schon vor der Kalbung signifikant höhere CK-Aktivitäten (81,8 U/l) im Serum als Zeichen einer stärkeren Belastung der Skelett- bzw. Uterusmuskulatur. Die Kühe mit Totgeburten hatten an allen drei Kontrollzeitpunkten höhere CK-Aktivitäten gegenüber den Kühen mit Lebendgeburten. Die Unter-schiede war drei d (160,1/ 98,9 U/l) bzw. 28 d p.p. (89,9/ 74,7 U/l) signifikant verschieden. Kühe mit Klauenerkrankungen, überwiegend Dermatitis digitalis, zeigten gegenüber gesunden Kühen vor der Kalbung signifikant höhere Kreatininkonzentrationen (110,0/ 130,5 µmol/l) im Serum als Zeichen eines erhöhten Muskelabbaus. Nach der Kalbung wiesen signifikant höhere BHB-Konzentrationen im Serum auf eine stärkere Belastung des Energiestoffwechsels hin. Insgesamt ergaben die Untersuchungen hauptsächlich engere Beziehungen zwischen Stoffwechsel und Morbidität in Form von höherer Mastitisinzidenz im Mai/Juni als Folge azidotischer Belastung nach Roh-faserreduzierung im Futter. Diese Phase schloss den Zeitraum schlechtester Gesundheit - einschließlich Fruchtbarkeit - ein. Gehäufte Klauenerkrankungen und Endometritiden gingen im letzten Jahresquartal in Verbindung mit stärkeren Belastungen des Energiestoffwechsels und Endotoxin-Belastung (ALA-AK-Titer) einher.

Fertilitätsstörungen bei Hochleistungsmilchrindern, welche oft in Folge einer negativen Energiebilanz im peripartalen Zeitraum auftreten, können die Ökonomie von Milcherzeugerbetrieben nachhaltig in Frage stellen. Ziel dieser Untersuchung war es deshalb a) in einem Betrieb mit schlechter Fruchtbarkeit den Stoffwechselstatus umfassend zu prüfen, b) den Stoffwechsel bei fruchtbarkeitsgestörten Kühen zu charakterisieren und c) zu untersuchen, ob der Einsatz von Conjugierter Linolsäure (CLA) im peripartalen Zeitraum geeignet ist, den Stoffwechsel der Kühe zu stabilisieren und somit das peripartale Energiedefizit sowie die Fruchtbarkeit positiv zu beeinflussen. Die Untersuchungen wurden in drei Teilen in einer Milchviehanlage in Sachsen mit einer Jahresmilchleistung von ca. 9000 kg Milch pro Kuh durchgeführt: a) Die Stoffwechselcharakteristik erfolgte an 103 frisch abgekalbten Kühen 2-4 d p.p. (Blutprobe und Rückenfettdicke - RFD), 6-7 Wo p.p. (Blutprobe und Milchprobe), nach der Diagnose „nicht tragen aus der ersten Besamung “ (Blutprobe) sowie zweimal im Abstand von 3 Monaten bei jeweils 10 Kühen durch Harn- und Haarproben. 21-28 d p.p. erfolgte eine rektalpalpatorische Puerperalkontrolle (PK). Es wurden die Fruchtbarkeitskennzahlen (FKZ) Zwischentragezeit (ZTZ), Trächtigkeitsindex (TI) und Erstbesamungserfolg (EBE) bestimmt. Bei 10 Färsen im besamungsfähigen Alter aus dem externen Aufzuchtstall erfolgten Blut-, Harn- und Haarkontrollen. b) Bei 30 Kühen (bis dahin nicht untersucht), die auf Grund der Diagnose „nicht tragen aus der ersten Besamung “als „fruchtbarkeitsgestört“ eingeordnet wurden, wurde eine weitere Blutprobe entnommen. c) Weiterhin wurde die stoffwechselstabilisierende Wirkung von CLA geprüft: 29 Kühe erhielten ab der 3. Wo a.p. bis zur Kalbung 25 g und von der Kalbung bis 4 Wo p.p. 50 g CLA-Gemisch (20 % lipidummantelte CLA; 50 % cis-9, trans-11 CLA und 50 % trans-10, cis-12 CLA). Die Kontrollgruppe ohne CLA-Gabe bildeten 28 Kühe. Die CLA-Effekte wurden klinisch (inklusive RFD-Messung 2-5 d p.p. sowie FKZ) und labordiagnostisch (Blutproben 3 Wo a.p., 1 Wo a.p., 2-5 d p.p., 2 Wo p.p. und 4 Wo p.p., Milchproben 2 und 4 Wo p.p.) kontrolliert. Labordiagnostisch wurden erfasst: im Blutserum: FFS, Bilirubin, BHB, Cholesterol, Harnstoff, Albumin, Protein, Glucose, Pi, Ca, K, Na, ASAT, GLDH, CK, TEAC; in den Harnproben: pHWert, BSQ, K, Na; in den Milchproben: Fett%, Eiweiß%, Laktose, ZZ, Harnstoff, FEQ und in den Haarproben: Eisen, Mangan, Cupfer, Zink sowie Selen. Ergebnisse: Zusammenfassung 102 a) Bei den Untersuchungen an Frischabkalbern wurde die schlechte Fruchtbarkeitslage des Bestandes deutlich. Der EBE lag bei 39,7 %, der TI bei 2,23 ± 1,43 und die ZTZ bei 113 d (1. Quartil - Qu: 86,0; 3. Qu: 172). Außerdem wiesen zur PK bereits 17,2 % der Kühe eine Zyste bzw. eine Zyste in Kombination mit einer Endometritis auf. Klinisch war die Verfettung auffällig (31,8 % der Tiere RFD>30 mm). Die Blutuntersuchungen zeigten einen starken Energiemangel und eine massive Lipidmobilisation der Tiere p.p., was bis zur 6-7. Wo p.p. anhielt. Die FFS-Konzentration lag 2-5 d p.p. mit einem Median von 734 μmol/l (1. Qu: 584; 3. Qu: 1095) weit über dem Grenzwert, ebenso wie die Bilirubinkonzentration mit 7,80 μmol/l (1. Qu: 5,90; 3. Qu: 10,2) und die BHB-Konzentration mit 0,92 mmol/l (1. Qu: 0,73; 3. Qu: 1,16). 6-7 Wo p.p. war die BHB-Konzentration mit 0,64 mmol/l (1. Qu: 0,49; 3. Qu: 0,81) immer noch leicht erhöht. 56,5 % der Tiere bewegten sich immer noch bezüglich der FFSKonzentration außerhalb des physiologischen Bereichs. Die Glucosekonzentrationen im Serum waren zu allen Entnahmezeitpunkten erhöht, was auf eine relative Insulinresistenz schließen lässt. Die Ca-Konzentrationen im Serum waren zu allen Entnahmezeitpunkten erniedrigt. Die Ergebnisse der Milchuntersuchungen (Fett% 4,5 ± 1,79 %, Protein% 2,95 ± 0,23 %, FEQ 1,40; 1. Qu: 1,25; 3. Qu: 1,77) bestätigten ebenfalls das Bestehen des Energiemangels auch 6-7 Wo p.p. Bei den Aufzuchtfärsen waren im Blutserum erhöhte Harnstoff- (6,74 ± 0,84 mmol/l) und Glucosekonzentrationen (4,21 ± 0,21 mmol/l) sowie im Harn gesteigerte K-Konzentrationen auffällig. b) Die Blutuntersuchungen an den fruchtbarkeitsgestörten Tieren zeigten keine stärkeren Abweichungen. Lediglich die BHB- (0,71 ± 0,30 mmol/l), die Harnstoff- (5,15 ± 1,37 mmol/l) und die Glucosekonzentrationen (4,24 ± 0,82 mmol/l) waren leicht erhöht sowie die Ca- Konzentration (2,28 ± 0,17 mmol/l) gering erniedrigt. c) Die CLA-Gabe (VG) bewirkte keine signifikante Verbesserung der Fruchtbarkeitsleistung und des peripartalen Stoffwechsels. Trotzdem waren die Fruchtbarkeitsparameter tendenziell besserer: ZTZ der VG 133 d (1. Qu: 112; 3. Qu: 178) vs. KG 159 d (1. Qu: 90,0; 3. Qu: 224), Rastzeit (RZ) der VG 86,5 d (1. Qu: 61,8; 3. Qu: 111) vs. KG 90,0 d (1. Qu: 66,3; 3. Qu: 99,3), EBE in der VG 33,3 % vs. KG 25,0 %. Der Energiestoffwechsel wurde von der CLAFütterung p.p. ebenfalls tendenziell verbessert: FFS (2 Wo p.p.) VG 408 μmol/l (1. Qu: 313; 3. Qu: 639) vs. KG 541 μmol/l (1. Qu: 404; 3. Qu: 754). Bezüglich des Bilirubins und auch des BHB hatten die Tiere der VG 2-5 d und auch 2 Wo p.p. tendenziell geringere Konzentrationen im Serum. Die Cholesterolkonzentrationen waren bei den Versuchstieren (2-5 d p.p.: 2,52 ± 0,56 mmol/l, 2 Wo p.p.: 3,31 ± 0,91 mmol/l) zu diesen Zeitpunkten tendenziell höher als bei den Kontrolltieren (2-5 d p.p.: 2,28 ± 0,55 mmol/l, 2 Wo p.p.: 3,17 ± 0,85mmol/l). Ebenso hatten die Versuchstiere 2 Wo p.p. tendenziell geringere ASATAktivitäten und 2 sowie auch 4 Wo p.p. tendenziell geringere GLDH-Aktivitäten. Eine signifikante Milchfettdepression setzte erst 4 Wo p.p. ein und fiel mit 6,6 % relativ gering aus. Die Milchprotein- und Milchlactosekonzentrationen blieben unbeeinflusst. Auffällig war, dass alle diese Differenzen bei den FKZ sowie den Blut- und Milchparametern meist nur bei den Färsen bestanden, wohingegen bei den Kühen kaum Unterschiede zwischen VG und KG auftraten. Schlussfolgerungen: Durch die Fütterung dieser CLA-Dosis ließen sich keine signifikanten Veränderungen der Fertilität und des Energiestoffwechsels im peripartalen Zeitraum erzielen. Es konnte jedoch ein Trend in Richtung einer besseren Konzeption und eines geringeres Energiedefizits Zusammenfassung 103 nachgewiesen werden. Eine gering ausgeprägte Milchfettdepression trat erst 4 Wo nach der Kalbung auf.

In der vorliegenden Studie wurde bei Tiroler Milchkühen verschiedener Rassen [Braunvieh (BV), Red Friesian (RF), Holstein Frisian (HF), Grauvieh (GV), Fleckvieh (FV)] hinterfragt in welcher Beziehung Energie- und Proteinstoffwechsel zur Fruchtbarkeit stehen und ob sich signifikante Unterschiede zwischen den Rassen und den verschiedenen peripartalen Entnahmezeitpunkten aufzeigen lassen. Die Untersuchungen erfolgten in 27 Tiroler Milchviehbetrieben an insgesamt 252 Milchrindern (154 BV, 42 RF, 14 HF, 15 FV, 27 GV). Bei allen Betrieben kann eine durchschnittliche Stallfütterungsperiode von 200 Tagen festgehalten werden. Das restliche Jahr verbringen die Kühe auf stallnahen Weiden oder Almen. Insgesamt wurde den Kühen fünfmal Blut aus der Vena jugularis externa entnommen. Die erste Blutprobenentnahme erfolgte im Herbst bei der Einstallung, die zweite 1-2 ante partum (Wo a.p.), dann 2-5 Tage post partum (d p.p.), danach 4-7 Wo p.p. und die fünfte Probe wurde im Frühjahr vor dem Weideaustrieb entnommen. Bei jeder Probe wurde der allgemeine Untersuchungsgang nach BAUMGARTNER (2005) durchgeführt sowie der BCS, und dabei bestehende Krankheiten gegebenenfalls protokolliert. Klinisch-chemisch wurden bei jedem Tier die Parameter freie Fettsäuren (FFS), Betahydroxybutyrat (BHB), Bilirubin (BILI), Cholesterol (CHOL), Gesamtprotein (PROT), Albumin (ALB), Harnstoff (HST), Kreatinin (CREA), Aspartat-Amino-Transferase (AST), Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT), Glutamat-Dehydrogenase (GLDH), alkalische Phosphatase (AP) und Kreatinkinase (CK) analysiert (HITACHI 911). Die Tiere wurden für die Auswertung in die unterschiedlichen Rassen und zudem noch in zwei Gruppen eingeteilt, ohne die Rassen zu berücksichtigen, d.h., in „gesund“ und „krank“. Die FFS,- BHB,- BILI,- PROT,- ALB,- HST- und CREA-Konzentrationen sowie AST,- GGT,- GLDH,- und AP-Aktivitäten zeigten zu keiner Zeit signifikante Differenzen bei den verschiedenen Probenentnahmen zwischen gesunden und kranken Kühen. Die CHOL- Konzentration zeigte zum Entnahmezeitpunkt Herbst und 4-7 Wo p.p. signifikante 82 Zusammenfassung Differenzen zwischen gesunden und kranken Kühen. Bei der CK-Aktivität bestanden bei der Probenentnahme Frühjahr zwischen gesunden und kranken Kühen signifikante Unterschiede. Bei den verschiedenen Rassen haben nur die FFS- und BHB-Konzentrationen signifikante Unterschiede gezeigt. Die BHB-Serumkonzentrationen von Milchrindern verschiedener Rasse weisen bei allen Entnahmen, außer bei der Entnahme 1-2 Wo a.p., signifikante Differenzen zwischen den Rassen auf. Bei der Probe Herbst gibt es zwischen HF und den anderen Rassen, außer dem BV, und bei der Entnahme 2-5 d p.p. zwischen BV und RF geringfügige, aber statistisch gesicherte Differenzen. Zum Probezeitpunkt 4-7 Wo p.p. konnte eine deutliche Signifikanz (p≤ 0,05) zwischen RF und GV nachgewiesen werden. Bei der Entnahme Frühjahr weisen GV und BV eine geringfügige, aber statistisch gesicherte Differenzen auf und GV und RF eine deutliche, statistisch ebenfalls gesicherte Differenz. Zwischen den Entnahmezeitpunkten konnten für alle Rassen, außer HF teilweise signifikante Unterschiede nachgewiesen werden. Zwischen den einzelnen Rassen wurde bei der Entnahme Herbst eine deutliche Signifikanz (p≤ 0,05) zwischen den Red Friesiankühen und den restliche Rassen berechnet. Zum Entnahmezeitpunkt Frühjahr zeigen sich signifikante Unterschiede zwischen RF und BV bzw. GV. Zwischen den einzelnen Entnahmezeitpunkten konnten bei allen Rassen Signifikanzen (p≤ 0,05) festgestellt werden. Die BHB- und FFS-Serumkonzentrationen zeigen in Beziehung zu unterschiedlichen Geburtsverläufen, p.p. Erkrankungen, Fruchtbarkeitsstatus und Trächtigkeitsstatus keine signifikanten Differenzen auf. ZTZ und Milchleistung zeigen bei Rindern mit verschiedenen Geburtsverläufen und solchen mit Fruchtbarkeitsstörungen keine signifikanten Differenzen auf. Die ZTZ weist zwischen Rindern ohne Fruchtbarkeitsstörungen und denen mit Stillbrunst, Ovarzysten und C.l. persistens signifikante Unterschiede auf. Außerdem haben Rinder mit Endometritis eine signifikante Differenz (p≤ 0,05) zu Rindern mit Ovarzysten oder C.l. persistens. Die Milchleistung weist signifikante Unterschiede zwischen Rindern ohne Fruchtbarkeitsstörungen und Rindern mit Ovarzysten auf. Generell zeigen die untersuchten Kühe etwas unerwartete Ergebnisse mit fast ausschließlich fehlenden gesicherten Unterschieden zwischen gesunden und kranken Kühen. Ursache könnte der durch die gegebenen Fütterungsbedingungen weniger belastete Energiestoffwechsel sein im Vergleich zu HF-Kühen mit dominanter Maissilagefütterung. Zudem enthält die Gruppe „krank“ auch Störungen, die bekannterweise kaum mit Stoffwechselabweichungen verbunden sind. Weiterhin deuten sich rassebedingte Unterschiede gegenüber den HF-Kühen an.

Ziel der Untersuchungen war es, im Rahmen einer umfangreichen Bestandsanalyse, mögliche Haupteinflüsse auf die Stoffwechselsituation der Kühe zu ermitteln. Die Frage, ob hochleistende Tiere stärker belastet sind, sollte näher beleuchtet werden. Dazu wurden bei 758 Tieren aus einem Bestand Gesundheitsstatus, Parität und Milchleistung in Beziehung zu Stoffwechsel-, Fruchtbarkeits-, Milchleistungsparametern und Körperkondition gesetzt. Die Parameter des Energiestoffwechsels und die Körperkondition decken eine Energiemangelsituation im untersuchten Bestand auf, deren Folge eine hohe Morbidität und unbefriedigende Fruchtbarkeit ist. Kühe hoher und niedriger Milchleistung haben die höchste Morbidität und die stärksten Abweichungen der Energiestoffwechselparameter (Freie Fettsäuren, Betahydroxybutyrat, Bilirubin). Unterschiede zwischen Kühen und Färsen bestehen häufig und bedürfen besonderer Beachtung im Herdenmanagement. Bei höheren Milchleistungen besteht ein stärkerer und längerer Körpermasseverlust, dementsprechend verschlechtern sich mit höherer Milchleistung die Fruchtbarkeitsparameter.