Im gleichen Maße wie informatisches Wissen mehr und mehr in den wissenschaftlichen Alltag aller Lebenswissenschaften Einzug gehalten hat, hat sich der Schwerpunkt bioinformatischer Forschung in stärker mathematisch und informatisch-orientierte Themengebiete verschoben. Bioinformatik heute ist mehr als die computergestützte Verarbeitung großer Mengen an biologischen Daten, sondern hat einen entscheidenden Fokus auf der Modellierung komplexer biologischer Systeme. Zur Anwendung kommen hierbei insbesondere Theorien aus dem Bereich der Stochastik und Statistik, des maschinellen Lernens und der theoretischen Informatik. In der vorliegenden Dissertation beschreibe ich in Fallstudien die systematische Modellierung biologischer Systeme aus einem informatisch - mathematischen Standpunkt unter Anwendung von Verfahren aus den genannten Teilbereichen und auf unterschiedlichen Ebenen biologischer Abstraktion. Ausgehend von der Sequenzinformation über Transkriptom, Metabolom und deren regulatorischer Interaktion hin zur Modellierung von Populationseffekten werden hierbei aktuelle biologische Fragestellungen mit mathematisch - informatischen Modellen und einer Vielzahl experimenteller Daten kombiniert. Ein besonderer Augenmerk liegt dabei auf dem Vorgang der Modellierung und des Modellbegriffs als solchem im Rahmen moderner bioinformatischer Forschung. Im Detail umfassen die Projekte (mehrere Publikationen) die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Einbettung und Visualisierung von Multiplen Sequenz- und Sequenz-Strukturalignments, illustriert am Beispiel eines Hemagglutininalignments unterschiedlicher H5N1 Varianten, sowie die Modellierung des Transkriptoms von A. thaliana, bei welchem mit Hilfe einer kernelisierten nicht-parametrischen Metaanalyse neue, an der Infektionsabwehr beteiligten, Gene ausfindig gemacht werden konnten. Desweiteren ist uns mit Hilfe unserer Software YANAsquare eine detaillierte Untersuchung des Metabolismus von L. monocytogenes unter Aktivierung des Transkriptionsfaktors prfA gelungen, dessen Vorhersagen durch experimentelle 13C Isotopologstudien belegt werden konnten. In einem Anschlußprojekt war der Zusammenhang zwischen Regulation des Metabolismus durch Regulation der Genexpression und der Fluxverteilung des metabolischen Steady- State-Netzwerks das Ziel. Die Modellierung eines komplexen organismischen Phänotyps, der Zellgrößenentwicklung der Diatomee Pseudo-nitzschia delicatissima, schließt die Untersuchungen ab. / In the same way that informatical knowledge has made its way into almost all areas of research in the Life Sciences, the focus of bioinformatical research has shifted towards topics originating more in the fields of mathematics and theoretical computer science. Bioinformatics today is more than the computer-driven processing of huge amounts of biological data, but it has a special focus on the emphmodelling of complex biological systems. Of special importance hereby are theories from stochastics and statistics, from the field of machine learning and theoretical computer science. In the following dissertation, I describe the systematic modelling of biological systems from an informatical-mathematical point of view in a case studies approach, applying methods from the aforementioned areas of research and on different levels of biological abstraction. Beginning with the sequence information itself, followed by the transcriptome, metabolome and the interaction of both and finally population effects I show how current biological questions can be tackled with mathematical models and combined with a variety of different experimental datasets. A special focus lies hereby on the procedure of modelling and the concept and notion of a model as such in the framework of bioinformatical research. In more detail, the projects contained the development of a new approach for embedding and visualizing Multiple Sequence and Structure Alignments, which was illustrated using a hemagglutinin alignment from different H5N1 variants as an example. Furthermore we investigated the A. thaliana transcriptome by means of a kernelized non-parametric meta-analysis, thus being able to annotate several new genes as pathogen-defense related. Another major part of this work was the modelling of the metabolic network of L. monocytogenes under activation of the transcription factor prfA, establishing predictions which were later verified by experimental 13C isotopologue studies. Following this project we investigated the relationship between the regulation of metabolism by changes in the cellular genexpression patterns and the flux distributions of the metabolic steady-state network. Modelling of a complex organismal property, the cell size development of the planktonic diatom Pseudo-nitzschia delicatissima concludes this work.

Der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer ist ein Phänomen, welches erstmals 1948 von Theodor Förster beschrieben wurde. Mit der Entwicklung von Fluoreszenzproteinen konnten in Kombination mit Mikroskopietechniken Einblicke in zellbiologische Vorgänge gewonnen werden, die durch biochemische oder physiologische Experimente nicht möglich sind. Dabei spielt die hohe zeitliche und räumliche Auflösung eine wichtige Rolle. Auf dem Forschungsgebiet der GPCR, welche die größte Gruppe von Membranproteinen bei den Säugetieren darstellen, wurden insbesondere Erkenntnisse über Konformationsänderungen der Rezeptoren, die Kinetik der Rezeptoraktivierung und die Interaktion mit intrazellulären Signalproteinen gewonnen. Der µ-Opioidrezeptor gehört zur Familie der GPCR und stellt aufgrund seiner analgetischen Wirkungen eine wichtige pharmakologische Zielstruktur dar. Das Ziel dieser Arbeit war sowohl den Rezeptor als auch seine Signalwege mittels FRET-Mikroskopie zu untersuchen. Zunächst sollte ein intramolekularer FRET-Sensor des µ-Opioidrezeptors entwickelt werden, dazu wurden basierend auf den Kenntnissen über die Tertiärstruktur und dem Aufbau bereits bekannter GPCR-Sensoren verschiedene Rezeptorkonstrukte kloniert. Bei den Konstrukten wurden entweder zwei Fluoreszenzproteine oder ein Fluoreszenzprotein und ein Fluorophor-bindendes Tetracysteinmotiv kombiniert. Auch die Positionen der eingefügten Sequenzen wurden in den intrazellulären Domänen variiert, da der Rezeptor auf die Modifikationen mit beeinträchtigter Membranlokalisation reagierte. Durch die Optimierung wurden Rezeptoren konstruiert, die an der Zellmembran lokalisiert waren. Jedoch zeigte keines der Rezeptorkonstrukte Funktionalität im Hinblick auf die Rezeptoraktivierung. Im zweiten Teil wurden die pharmakologischen Effekte der Metabolite von Morphin am humanen µ-Opioidrezeptor systematisch analysiert. Dazu wurde die Fähigkeit der Metabolite, Gi-Proteine zu aktivieren und β-Arrestin2 zu rekrutieren, mittels FRET-basierter Messungen an lebenden Zellen untersucht. Außerdem wurde die Affinität der Metabolite zum humanen µ Opioidrezeptor anhand der Verdrängung eines radioaktiven Liganden analysiert. Meine Experimente identifizierten eine Gruppe mit stark agonistischen und eine mit schwach agonistischen Eigenschaften. Die starken Partialagonisten aktivieren den Rezeptor bereits bei nanomolaren Konzentrationen, während die schwachen Metabolite den Rezeptor erst bei Konzentrationen im mikromolaren Bereich aktivieren. Die Metabolite Normorphin, Morphin-6-Glucuronid und 6-Acetylmorphin zeigen geringere Potenz als Morphin bei der Gi-Aktivierung aber überraschenderweise höhere Potenz und Effizienz für die β-Arrestin-Rekrutierung. Dies deutet auf eine bevorzugte Aktivierung von β-Arrestin2 hin. Die aus diesen Studien gewonnenen Ergebnisse liefern Hinweise darauf, welche Metabolite bei der Signalverarbeitung am µ Opioidrezeptor in vivo beteiligt sind. / Fluorescence resonance energy transfer was first described by Theodor Förster in 1948. The discovery and development of intrinsic fluorescent proteins revolutionized cell and molecular biology. The FRET-technique allows the analysis of protein-protein interactions and intramolecular conformational changes. In this method, its high temporal and spatial resolution plays a crucial role. Especially in the research field of GPCR, which are the largest family of membrane proteins in mammals, insights into receptor conformational changes, kinetics of receptor activation and the interaction with intracellular proteins were obtained. The µ-opioid receptor belongs to the GPCR family and is involved in analgesia. Therefore, the receptor is an important pharmacological target. Its pharmacological properties were extensively analyzed in the current thesis by FRET. Engineering of an intramolecular MOR-biosensor was initially planned. Based on the knowledge about the tertiary receptor structure and earlier GPCR-sensors, different receptor constructs were cloned. For each receptor construct either two fluorescent proteins or one fluorescent protein and one fluorophore binding tetracysteine motif were combined. The insertion of the additional amino acid sequences prevented the membrane localization for some constructs. Hence, the insertion site of the amioacid sequences was varied in the intracellular loops. Ultimately, the optimization resulted in some membrane localized receptor constructs with the tetracysteine motif in the third intracellular loop. Nevertheless, none of the receptor constructs was functional in terms of measurable conformational change upon receptor activation. In the second part of this thesis, the pharmacological effects of morphine and its metabolites were studied. The analgesic effects of morphine are mainly mediated via the activation of the µ opioid receptor. This receptor activates inhibitory G-proteins and induces the recruitment of β-arrestin2. Therefore I analyzed activation of these two pathways induced by morphine metabolites using FRET-microscopy in living cells. Furthermore, radioligand binding studies were used to determine the affinity of each compound to the human µ-opioid receptor. This approach identified two groups of metabolites, which were classified into strong and weak ligands. Strong partial agonists showed efficacies in the nanomalar range. In contrast, weak metabolites activated µ opioid receptor pathways in the micromolar range. Normorphine, morphine-6-glucuronide and 6 acetylmorphine had lower potencies regarding Gi-protein activation but higher potencies and efficacies for β-arrestin2 recruitment than morphine. These findings indicate that these metabolites are biased towards β-arrestin2 pathways.

This study introduces a method for multiparallel analysis of small organic compounds in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii, one of the premier model organisms in cell biology. The comprehensive study of the changes of metabolite composition, or metabolomics, in response to environmental, genetic or developmental signals is an important complement of other functional genomic techniques in the effort to develop an understanding of how genes, proteins and metabolites are all integrated into a seamless and dynamic network to sustain cellular functions. The sample preparation protocol was optimized to quickly inactivate enzymatic activity, achieve maximum extraction capacity and process large sample quantities. As a result of the rapid sampling, extraction and analysis by gas chromatography coupled to time-of-flight mass spectrometry (GC-TOF) more than 800 analytes from a single sample can be measured, of which over a 100 could be positively identified. As part of the analysis of GC-TOF raw data, aliquot ratio analysis to systematically remove artifact signals and tools for the use of principal component analysis (PCA) on metabolomic datasets are proposed. Cells subjected to nitrogen (N), phosphorus (P), sulfur (S) or iron (Fe) depleted growth conditions develop highly distinctive metabolite profiles with metabolites implicated in many different processes being affected in their concentration during adaptation to nutrient deprivation. Metabolite profiling allowed characterization of both specific and general responses to nutrient deprivation at the metabolite level. Modulation of the substrates for N-assimilation and the oxidative pentose phosphate pathway indicated a priority for maintaining the capability for immediate activation of N assimilation even under conditions of decreased metabolic activity and arrested growth, while the rise in 4-hydroxyproline in S deprived cells could be related to enhanced degradation of proteins of the cell wall. The adaptation to sulfur deficiency was analyzed with greater temporal resolution and responses of wild-type cells were compared with mutant cells deficient in SAC1, an important regulator of the sulfur deficiency response. Whereas concurrent metabolite depletion and accumulation occurs during adaptation to S deprivation in wild-type cells, the sac1 mutant strain is characterized by a massive incapability to sustain many processes that normally lead to transient or permanent accumulation of the levels of certain metabolites or recovery of metabolite levels after initial down-regulation. For most of the steps in arginine biosynthesis in Chlamydomonas mutants have been isolated that are deficient in the respective enzyme activities. Three strains deficient in the activities of N-acetylglutamate-5-phosphate reductase (arg1), N2 acetylornithine-aminotransferase (arg9), and argininosuccinate lyase (arg2), respectively, were analyzed with regard to activation of endogenous arginine biosynthesis after withdrawal of externally supplied arginine. Enzymatic blocks in the arginine biosynthetic pathway could be characterized by precursor accumulation, like the amassment of argininosuccinate in arg2 cells, and depletion of intermediates occurring downstream of the enzymatic block, e.g. N2-acetylornithine, ornithine, and argininosuccinate depletion in arg9 cells. The unexpected finding of substantial levels of the arginine pathway intermediates N-acetylornithine, citrulline, and argininosuccinate downstream the enzymatic block in arg1 cells provided an explanation for the residual growth capacity of these cells in the absence of external arginine sources. The presence of these compounds, together with the unusual accumulation of N-Acetylglutamate, the first intermediate that commits the glutamate backbone to ornithine and arginine biosynthesis, in arg1 cells suggests that alternative pathways, possibly involving the activity of ornithine aminotransferase, may be active when the default reaction sequence to produce ornithine via acetylation of glutamate is disabled. / Entwicklung und Anwendung von Methoden zur multiparallelen Analyse von Metaboliten in der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, einem der wichtigsten Modellorganismen der Zellbiologie, sind Gegenstand dieser Arbeit. Metabolomanalyse, die umfassende Analyse von Veränderungen der Konzentrationen von Stoffwechselprodukten durch Umweltreize oder genetische und entwicklungsbedingte Signale, ist ein wichtiges Komplement anderer Genomanalysemethoden, um die Integration von Genen, Proteinen und Metaboliten in ein nahtloses und dynamisches Netzwerk zur Aufrechterhaltung der Lebensfunktionen eines Organismus zu verstehen. Die Methode wurde im Hinblick auf schnelle Inaktivierung enzymatischer Aktivität, Maximierung der Extraktionskapazität und Behandlung großer Probenmengen optimiert. Im Ergebnis der Probenaufarbeitung, Extraktion und Analyse mittels Gaschromatographie und Time-Of-Flight-Massenspektrometrie konnten mehr als 800 analytische Signale in Einzelproben dargestellt werden, von denen über 100 identifiziert werden konnten. Die Arbeit stellt methodische Innovationen zur systematischen Erkennung von Artefakten in GC-MS Chromatogrammen und Werkzeuge zur Anwendung der Hauptkomponentenanalyse auf Metabolom-Daten vor. Zellen unter Stickstoff- (N), Phosphor- (P), Schwefel- (S), oder Eisen- (Fe) Mangel zeigen deutliche Unterschiede in ihrer Metabolitenausstattung. Die Anpassung an die einzelnen Nährstoffmangelsituationen ist durch spezifische Änderungen einer Reihe von Metaboliten zentraler Prozesse des Primärstoffwechsels gekennzeichnet. Die Konzentrationsänderungen von Substraten für die Stickstoffassimilation und den oxidativen Pentosephosphatweg deuten darauf hin, dass die Fähigkeit zur schnellen Aktivierung der N-Assimilation auch unter Bedingungen herabgesetzter Stoffwechsel- und Wachstumsaktivität aufrechterhalten wird. Die Akkumulation von 4-Hydroxyprolin unter Schwefelmangel könnte im Zusammenhang stehen mit der Degradation von Proteinen der Chlamydomonas-Zellwand, deren wesentlicher Bestandteil hydroxyprolinreiche Glykoproteine sind und die unter Schwefelmangel aktiv umgebaut wird. Die Anpassung an Schwefelmangel wurde mit größerer zeitlicher Auflösung in Wildtyp-Zellen und Zellen des sac1-Stammes untersucht. SAC1 ist ein zentraler Regulator der Schwefelmangelantwort in Chlamydomonas. Zeitgleiche Ab- und Zunahme von Metaboliten ist ein charakteristisches Element der Anpassung an Schwefelmangel in Wildtypzellen. Die Reaktion von SAC1-Mutanten auf Schwefelmangel ist durch weit reichenden Verlust zur Steuerung von Prozessen gekennzeichnet, die normalerweise zur vorübergehenden oder dauerhaften Anreicherung bestimmter Metabolite führen. Die Verfügbarkeit von Chlamydomonas-Stämmen mit fehlender Enzymaktivität für fast jeden der Schritte der Argininbiosynthese eröffnet die Möglichkeit, das Potential der Metabolitenanalyse zur Untersuchung der Regulation der Aminosäurebiosynthese in photosynthetischen Eukaryoten zur Anwendung zu bringen. Drei Stämme, mit fehlender Aktivität für N-Acetylglutamat-5-phosphat Reduktase (arg1), N2 Acetylornithin-Aminotransferase (arg9) beziehungsweise Argininosuccinat Lyase (arg2) wurden in Bezug auf die Aktivierung ihrer endogenen Argininbiosynthese nach Entzug externer Argininquellen analysiert. Die einzelnen enzymatischen Blocks konnten durch Precursor-Anreicherung, wie die Anhäufung von Argininosuccinat in arg2-Zellen, und Erschöpfung von Intermediaten nachgelagerter Reaktionen, beispielsweise die deutliche Abnahme von N2-Acetylornithin, Ornithin und Argininosuccinat in arg9-Zellen charakterisiert werden. Das unerwartete Vorhandensein von zum Teil das Wildtyp-Niveau überschreitender Mengen von N2-Acetylornithin, Citrullin und Argininosuccinat, die Produkte bzw. Substrate dem enzymatischen Block nachgelagerter Reaktionen in arg1-Zellen sind, bot eine Erklärung für eine noch vorhandene Restkapazität zum Wachstum des arg1-Stamms auch ohne äußere Arginingabe. Der Nachweis dieser Verbindungen sowie die ungewöhnliche Anreicherung von N-Acetylglutamat, der ersten Verbindung, die das Glutamat-Gerüst für die Ornithin- und Argininsynthese bindet, in arg1-Zellen könnte auf alternative Reaktionen, möglicherweise unter Beteiligung von Ornithin-Aminotransferase, zur Synthese von Ornithin hindeuten, die in Erscheinung treten, wenn die Synthesekette nach Acetylierung von Glutamat blockiert ist.

The major aim of this thesis was to study the effect of nitrate on primary metabolism and in development of the model plant Arabidopsis thaliana. The present work has two separate topics. First, to investigate the GDH family, a small gene family at the interface between nitrogen and carbon metabolisms. Second, to investigate the mechanisms whereby nitrogen is regulating the transition to flowering time in Arabidopsis thaliana. To gain more insights into the regulation of primary metabolism by the functional characterization of the glutamate dehydrogenase (GDH) family, an enzyme putatively involved in the metabolism of amino acids and thus suggested to play different and essential roles in carbon and nitrogen metabolism in plants, knock out mutants and transgenic plants carrying RNA interference construct were generated and characterized. The effect of silencing GDH on carbon and nitrogen metabolisms was investigated, especially the level of carbohydrates and the amino acid pool were further analysed. It has been shown that GDH expression is regulated by light and/or sugar status therefore, phenotypic and metabolic analysis were developed in plants grown at different points of the diurnal rhythm and in response to an extended night period. In addition, we are interested in the effect of nutrient availability in the transition from vegetative growth to flowering and especially in nitrate as a metabolite that triggers widespread and coordinated changes in metabolism and development. Nutrient availability has a dramatic effect on flowering time, with a marked delay of flowering when nitrate is supplied (Stitt, 1999). The use of different mutants and transgenic plants impaired in flowering signalling pathways was crucial to evaluate the impact of different nitrate concentrations on flowering time and to better understand the interaction of nitrate-dependent signals with other main flowering signalling pathways. Plants were grown on glutamine as a constitutive source of nitrogen, and the nitrate supply varied. Low nitrate led to earlier flowering. The response to nitrate is accentuated in short days and in the CONSTANS deficient co2 mutant, whereas long days or overexpression of CONSTANS overrides the nitrate response. These results indicate that nitrates acts downstream of the known flowering signalling pathways for photoperiod, autonomy, vernalization and gibberellic acid. Global analyses of gene expression of two independent flowering systems, a light impaired mutant (co2tt4) and a constitutive over-expresser of the potent repressor of flowering (35S::FLC), were to be investigated under two different concentrations of nitrate in order to identify candidate genes that may be involved in the regulation of flowering time by nitrate. / Das Hauptziel dieser Doktorarbeit war die Untersuchung des Effekts von Stickstoff auf den Primärmetabolisms und auf die Entwicklung der Modellpflanze Arabidopsis thaliana. Die vorliegende Arbeit hat zwei Unterthemen: Auf der einen Seite wurde die GDH Familie untersucht, eine kleine Genfamilie an der Schnittstelle zwischen Stick –und Kohlenstoffmetabolismus. Auf der anderen Seite wurde der Mechanismus, bei dem Stickstoff die Blütezeit in Arabidopsis thaliana kontrolliert, untersucht. Um einen tieferen Einblick in die Regulierung des Primärmetabolismus zu erhalten, wurde eine funktionelle Charakterisierung der Glutamatdehydrogenase-Familie (GDH) mit Hilfe von knock-out Mutanten und transgenen Pflanzen, die ein RNA Interferenzkonstrukt tragen, durchgeführt. GDH ist höchstwahrscheinlich am Aminosäuremetabolismus beteiligt, wobei vermutet wird, dass es verschiedene wichtige Aufgaben im Pflanzenkohlen –und stickstoffmetabolismus übernimmt. Dabei wurde der Effekt des GDH Silencing auf den Kohlen- sowie Stickstoffmetabolismus untersucht und insbesondere die Anteile von Kohlenhydraten und Aminosäuren eingehend analysiert. In vorhergehenden Studien zeigte sich, dass die GDH-Expression durch Licht und/oder die Zuckerverfügbarkeit reguliert wird. Deshalb wurden phenotypische und metabolische Analysen an Pflanzen entwickelt, die zu verschiedenen Zeitpunkten des diurnalen Rhythmus und nach einer längeren Nachtperiode gezüchtet wurden. Ausserdem interesssiert uns der Effekt der Nährstoffverfügbarkeit im Übergang vom vegetativen Wachstum zur Blüte, und vor allen Dingen Nitrat als Metabolit, welches weitreichende und koordinierte Veränderungen im Metabolismus und in der Entwicklung hervorruft. Die Nährstoffverfügbarkeit hat einen dramatischen Effekt auf die Blütezeit, insbesondere führt eine Nitratzugabe zu einer deutlichen Verzögerung der Blüte (Stitt, 1999). Der Einsatz von verschiedenen Mutanten und transgenen Pflanzen, die eine Blockade im Blüte-Signalweg aufwiesen, war ausschlaggebend, um den Einfluss von unterschiedlichen Nitratkonzentrationen auf die Blütezeit zu beurteilen, und um zu einem besserem Verständnis des Zusammenspiels von nitratabhängigen Signalen und anderen Blüte-Signalwegen zu gelangen. Die Pflanzen wuchsen auf Glutamin, das als konstitutive Stickstoffquelle diente, wobei die Nitratversorgung variierte. Niedriger Nitratanteil führte zu einer früheren Blüte. Bei kurzer Tageslänge und bei CONSTANS defizienten Mutanten (co2) ist die Reaktion auf Nitratzugabe erhöht, wohingegen bei fortgeschrittener Tageslänge oder bei Überexpression von CONSTANS die Reaktion auf Nitrat unterbleibt. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Nitrat unterhalb der bekannten Blüte-Signalwege für Photoperiode, Autonomie, Vernalisierung und Gibberelinsäure fungiert. Globale Expressionsanalysen von zwei unterschiedlichen Blütensystemen, eine licht-unempfindliche Mutante (co2tt4) und eine Mutante mit konstitutiver Expression eines potentiellen Blüte-Repressors (35S::FLC), wurden bei zwei verschiedenen Nitratkonzentrationen durchgeführt, um Kandidatengene zu identifizieren, die eine wichtige Rolle in der Regulation der Blütezeit durch Nitrat spielen könnten.

Adenylates are metabolites with essential function in metabolism and signaling in all living organisms. As Cofactors, they enable thermodynamically unfavorable reactions to be catalyzed enzymatically within cells. Outside the cell, adenylates are involved in signalling processes in animals and emerging evidence suggests similar signaling mechanisms in the plants’ apoplast. Presumably, apoplastic apyrases are involved in this signaling by hydrolyzing the signal mediating molecules ATP and ADP to AMP. This PhD thesis focused on the role of adenylates on metabolism and development of potato (Solanum tuberosum) by using reverse genetics and biochemical approaches. To study the short and long term effect of cellular ATP and the adenylate energy charge on potato tuber metabolism, an apyrase from Escherichia coli targeted into the amyloplast was expressed inducibly and constitutively. Both approaches led to the identification of adaptations to reduced ATP/energy charge levels on the molecular and developmental level. These comprised a reduction of metabolites and pathway fluxes that require significant amounts of ATP, like amino acid or starch synthesis, and an activation of processes that produce ATP, like respiration and an immense increase in the surface-to-volume ratio. To identify extracellular enzymes involved in adenylate conversion, green fluorescent protein and activity localization studies in potato tissue were carried out. It was found that extracellular ATP is imported into the cell by an apoplastic enzyme complement consisting of apyrase, unspecific phosphatase, adenosine nucleosidase and an adenine transport system. By changing the expression of a potato specific apyrase via transgenic approaches, it was found that this enzyme has strong impact on plant and particular tuber development in potato. Whereas metabolite levels were hardly altered, transcript profiling of tubers with reduced apyrase activity revealed a significant upregulation of genes coding for extensins, which are associated with polar growth. The results are discussed in context of adaptive responses of plants to changes in the adenylate levels and the proposed role of apyrase in apoplastic purinergic signaling and ATP salvaging. In summary, this thesis provides insight into adenylate regulated processes within and outside non-photosynthetic plant cells. / Adenylate haben essentielle Funktionen in Stoffwechselprozessen und fungieren als Signalmoleküle in allen Organismen. Als Cofaktoren ermöglichen sie die Katalyse thermodynamisch ungünstiger Reaktionen innerhalb der Zelle, und außerhalb der Zelle wirken sie als Signalmoleküle in Tieren und nach neueren Forschungsergebnissen wohl auch in Pflanzen. Vermutlich wird die Signalwirkung von ATP und ADP durch Hydrolyse zu AMP unter Beteiligung apoplastische Apyrasen terminiert. Diese Arbeit behandelt den Einfluss der Adenylate auf Stoffwechsel- und Entwicklungsprozesse in der Kartoffelpflanze (Solanum tuberosum) mittels biochemischer und revers-genetischer Ansätze. Um kurzfristige und langfristige Einflüsse zellulären ATPs und der Energieladung auf den Stoffwechsel von Kartoffelknollen zu untersuchen, wurde eine mit einem plastidären Transitpeptid fusionierte Apyrase aus Escherichia coli induzierbar und dauerhaft exprimiert. Beide Ansätze führten zur Identifizierung von Anpassungen an eine reduzierte ATP Verfügbarkeit bzw. verringerte Energieladung. Die Anpassungen beinhalteten eine Reduzierung von ATP-verbrauchenden Stoffwechselaktivitäten und Stoffwechselprodukten, wie die Aminosäure- oder Stärkesynthese, und eine Aktivierung von Prozessen, welche die ATP-Bildung oder eine effizientere ATP-Bildung ermöglichen, wie Zellatmung und die Vergrößerung des Oberfächen/Volumen-Verhältnisses der Kartoffelknolle. Extrazelluläre Adenylat-umsetzende Enzyme wurden mit Hilfe des grün fluoreszierenden Proteins und Aktivitätsmessungen identifiziert und charakterisiert. Es wurde ein potentieller ATP Bergungsstoffwechselweg gefunden, der ATP über die Enzyme Apyrase, unspezifische Phosphatase und Adenosin-Nukleosidase zu Adenin umsetzt, welches über eine Purin-Permease in die Zelle transportiert wird. Transgene Manipulation der Aktivität der kartoffelspezifischen Apyrase zeigte, dass dieses Enzym einen großen Einfluss auf die Pflanzen-, insbesondere die Knollenentwicklung hat. Obwohl sich Stoffwechselaktivitäten kaum verändert hatten, führte die Verringerung der Apyrase Aktivität in den Knollen zur übermäßigen Expression von Extensin-Genen, die eine Funktion im polaren Wachstum von Pflanzenzellen besitzen. Die Ergebnisse wurden mit Hinblick auf Anpassungen der Pflanze an veränderte Adenylat-Spiegel und der potentiellen Beteiligung der endogenen Apyrase an einem apoplastischen ATP-Signalweg bzw. ATP-Bergungsstoffwechselweg diskutiert. Zusammengefasst, präsentiert diese Arbeit neue Einsichten in Adenylat-regulierte Prozesse in- und außerhalb nicht-photosynthetischer Pflanzenzellen.

Mathematical modeling of biological phenomena has experienced increasing interest since new high-throughput technologies give access to growing amounts of molecular data. These modeling approaches are especially able to test hypotheses which are not yet experimentally accessible or guide an experimental setup. One particular attempt investigates the evolutionary dynamics responsible for today's composition of organisms. Computer simulations either propose an evolutionary mechanism and thus reproduce a recent finding or rebuild an evolutionary process in order to learn about its mechanism. The quest for evolutionary fingerprints in metabolic and gene-coexpression networks is the central topic of this cumulative thesis based on four published articles. An understanding of the actual origin of life will probably remain an insoluble problem. However, one can argue that after a first simple metabolism has evolved, the further evolution of metabolism occurred in parallel with the evolution of the sequences of the catalyzing enzymes. Indications of such a coevolution can be found when correlating the change in sequence between two enzymes with their distance on the metabolic network which is obtained from the KEGG database. We observe that there exists a small but significant correlation primarily on nearest neighbors. This indicates that enzymes catalyzing subsequent reactions tend to be descended from the same precursor. Since this correlation is relatively small one can at least assume that, if new enzymes are no "genetic children" of the previous enzymes, they certainly be descended from any of the already existing ones. Following this hypothesis, we introduce a model of enzyme-pathway coevolution. By iteratively adding enzymes, this model explores the metabolic network in a manner similar to diffusion. With implementation of an Gillespie-like algorithm we are able to introduce a tunable parameter that controls the weight of sequence similarity when choosing a new enzyme. Furthermore, this method also defines a time difference between successive evolutionary innovations in terms of a new enzyme. Overall, these simulations generate putative time-courses of the evolutionary walk on the metabolic network. By a time-series analysis, we find that the acquisition of new enzymes appears in bursts which are pronounced when the influence of the sequence similarity is higher. This behavior strongly resembles punctuated equilibrium which denotes the observation that new species tend to appear in bursts as well rather than in a gradual manner. Thus, our model helps to establish a better understanding of punctuated equilibrium giving a potential description at molecular level. From the time-courses we also extract a tentative order of new enzymes, metabolites, and even organisms. The consistence of this order with previous findings provides evidence for the validity of our approach. While the sequence of a gene is actually subject to mutations, its expression profile might also indirectly change through the evolutionary events in the cellular interplay. Gene coexpression data is simply accessible by microarray experiments and commonly illustrated using coexpression networks where genes are nodes and get linked once they show a significant coexpression. Since the large number of genes makes an illustration of the entire coexpression network difficult, clustering helps to show the network on a metalevel. Various clustering techniques already exist. However, we introduce a novel one which maintains control of the cluster sizes and thus assures proper visual inspection. An application of the method on Arabidopsis thaliana reveals that genes causing a severe phenotype often show a functional uniqueness in their network vicinity. This leads to 20 genes of so far unknown phenotype which are however suggested to be essential for plant growth. Of these, six indeed provoke such a severe phenotype, shown by mutant analysis. By an inspection of the degree distribution of the A.thaliana coexpression network, we identified two characteristics. The distribution deviates from the frequently observed power-law by a sharp truncation which follows after an over-representation of highly connected nodes. For a better understanding, we developed an evolutionary model which mimics the growth of a coexpression network by gene duplication which underlies a strong selection criterion, and slight mutational changes in the expression profile. Despite the simplicity of our assumption, we can reproduce the observed properties in A.thaliana as well as in E.coli and S.cerevisiae. The over-representation of high-degree nodes could be identified with mutually well connected genes of similar functional families: zinc fingers (PF00096), flagella, and ribosomes respectively. In conclusion, these four manuscripts demonstrate the usefulness of mathematical models and statistical tools as a source of new biological insight. While the clustering approach of gene coexpression data leads to the phenotypic characterization of so far unknown genes and thus supports genome annotation, our model approaches offer explanations for observed properties of the coexpression network and furthermore substantiate punctuated equilibrium as an evolutionary process by a deeper understanding of an underlying molecular mechanism. / Die biologische Zelle ist ein sehr kompliziertes Gebilde. Bei ihrer Betrachtung gilt es, das Zusammenspiel von Tausenden bis Millionen von Genen, Regulatoren, Proteinen oder Molekülen zu beschreiben und zu verstehen. Durch enorme Verbesserungen experimenteller Messgeräte gelingt es mittlerweile allerdings in geringer Zeit enorme Datenmengen zu messen, seien dies z.B. die Entschlüsselung eines Genoms oder die Konzentrationen der Moleküle in einer Zelle. Die Systembiologie nimmt sich dem Problem an, aus diesem Datenmeer ein quantitatives Verständnis für die Gesamtheit der Wechselwirkungen in der Zelle zu entwickeln. Dabei stellt die mathematische Modellierung und computergestützte Analyse ein eminent wichtiges Werkzeug dar, lassen sich doch am Computer in kurzer Zeit eine Vielzahl von Fällen testen und daraus Hypothesen generieren, die experimentell verifiziert werden können. Diese Doktorarbeit beschäftigt sich damit, wie durch mathematische Modellierung Rückschlüsse auf die Evolution und deren Mechanismen geschlossen werden können. Dabei besteht die Arbeit aus zwei Teilen. Zum Einen wurde ein Modell entwickelt, dass die Evolution des Stoffwechsels nachbaut. Der zweite Teil beschäftigt sich mit der Analyse von Genexpressionsdaten, d.h. der Stärke mit der ein bestimmtes Gen in ein Protein umgewandelt, "exprimiert", wird. Der Stoffwechsel bezeichnet die Gesamtheit der chemischen Vorgänge in einem Organismus; zum Einen werden Nahrungsstoffe für den Organismus verwertbar zerlegt, zum Anderen aber auch neue Stoffe aufgebaut. Da für nahezu jede chemische Reaktion ein katalysierendes Enzym benötigt wird, ist davon auszugehen, dass sich der Stoffwechsel parallel zu den Enzymen entwickelt hat. Auf dieser Annahme basiert das entwickelte Modell zur Enzyme-Stoffwechsel-Koevolution. Von einer Anfangsmenge von Enzymen und Molekülen ausgehend, die etwa in einer primitiven Atmosphäre vorgekommen sind, werden sukzessive Enzyme und die nun katalysierbaren Reaktionen hinzugefügt, wodurch die Stoffwechselkapazität anwächst. Die Auswahl eines neuen Enzyms geschieht dabei in Abhängigkeit von der Ähnlichkeit mit bereits vorhandenen und ist so an den evolutionären Vorgang der Mutation angelehnt: je ähnlicher ein neues Enzym zu den vorhandenen ist, desto schneller kann es hinzugefügt werden. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis der Stoffwechsel die heutige Form angenommen hat. Interessant ist vor allem der zeitliche Verlauf dieser Evolution, der mittels einer Zeitreihenanalyse untersucht wird. Dabei zeigt sich, dass neue Enzyme gebündelt in Gruppen kurzer Zeitfolge auftreten, gefolgt von Intervallen relativer Stille. Dasselbe Phänomen kennt man von der Evolution neuer Arten, die ebenfalls gebündelt auftreten, und wird Punktualismus genannt. Diese Arbeit liefert somit ein besseres Verständnis dieses Phänomens durch eine Beschreibung auf molekularer Ebene. Im zweiten Projekt werden Genexpressionsdaten von Pflanzen analysiert. Einerseits geschieht dies mit einem eigens entwickelten Cluster-Algorithmus. Hier läßt sich beobachten, dass Gene mit einer ähnlichen Funktion oft auch ein ähnliches Expressionsmuster aufweisen. Das Clustering liefert einige Genkandidaten, deren Funktion bisher unbekannt war, von denen aber nun vermutet werden konnte, dass sie enorm wichtig für das Wachstum der Pflanze sind. Durch Experimente von Pflanzen mit und ohne diese Gene zeigte sich, dass sechs neuen Genen dieses essentielle Erscheinungsbild zugeordnet werden kann. Weiterhin wurden Netzwerke der Genexpressionsdaten einer Pflanze, eines Pilzes und eines Bakteriums untersucht. In diesen Netzwerken werden zwei Gene verbunden, falls sie ein sehr ähnliches Expressionsprofil aufweisen. Nun zeigten diese Netzwerke sehr ähnliche und charakteristische Eigenschaften auf. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher ein weiteres evolutionäres Modell entwickelt, das die Expressionsprofile anhand von Duplikation, Mutation und Selektion beschreibt. Obwohl das Modell auf sehr simplen Eigenschaften beruht, spiegelt es die beobachteten Eigenschaften sehr gut wider, und es läßt sich der Schluss ziehen, dass diese als Resultat der Evolution betrachtet werden können. Die Ergebnisse dieser Arbeiten sind als Doktorarbeit in kumulativer Form bestehend aus vier veröffentlichten Artikeln vereinigt.

Alexandra Flocke Untersuchung von Stoffwechselparametern und Lipoproteinen im Blutserum von einlings- und zwillingsträchtigen Merino- und Schwarzköpfigen Fleischschafen im peripartalen Zeitraum Medizinische Tierklinik, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig Eingereicht im Februar 2012 (94 Seiten, 15 Abbildungen, 8 Tabellen, 199 Literaturangaben, 12 Tabellen im Anhang) Schlüsselwörter: Lipoproteine, Schaf, Stoffwechsel, Endotoxin, Ketose Problemstellung: Der Lipoproteinstatus in der kritischen Phase der Hochträchtigkeit wurde beim Schaf bisher nur wenig untersucht. Die Fähigkeit der Lipoproteine, sowohl Lipide zu transportieren und im Körper umzuverteilen, als auch ihre Rolle in der Endotoxinneutralisation machen sie zu einem wichtigen Parameter in stoffwechselbelasteten Situationen. Das Ziel dieser Arbeit ist es, den Lipoproteinstatus zweier verschiedener Leistungsrassen zu analysieren und zu prüfen, ob und inwiefern peripartal Unterschiede bei Ein- und Zwillingsträchtigkeiten bestehen. Zusätzlich werden die Endotoxine der Tiere bestimmt und mögliche Zusammenhänge mit der Stoffwechselsituation und dem Lipoproteinstatus evaluiert. Tiere, Material und Methoden: Untersucht wurden gesunde einlingsträchtige Merinofleischschafe (MFS1), zwillingsträchtige Merinofleischschafe (MFS2) sowie zwillingsträchtige Schwarzköpfige Fleischschafe (SKF2). Im Abstand von je sieben Tagen wurden den Tieren im Zeitraum von der 5. Woche a.p. bis eine Woche p.p. Blutproben aus der V. jugularis externa entnommen. Aus dem Serum wurden die Konzentrationen von β-Hydroxybutyrat (BHB), Glucose, Freie Fettsäuren (FFS), Triacylglycerol (TG), Cholesterol, Bilirubin, Gesamtprotein (alle Hitachi 912), Insulin (RIA-Kit, Firma IBL, Hamburg), α- und β-Lipoproteine (LIPIDOPHOR All In12®, - ohne prä-β-Lipoproteine), freies Endotoxin (LAL-Test) und Anti-Lipid A Antikörper (ALAAK; ELISA) bestimmt. Ergebnisse: Die α-Lipoproteinkonzentration stieg bei den MFS1 vor dem Ablammen signifikant an und erreichte eine Konzentration von = 208,0 ± 40,1 mg/dl (1. Woche a.p.). Die MFS2 wiesen vor dem Lammen einen konstanten Verlauf zwischen = 180,4 ± 31,1 mg/dl (5. Woche a.p.) und = 196,1 ± 42,1 mg/dl (3. Woche a.p.) auf. Die SKF2 zeigten in der 5. Woche a.p. mit = 206,5 ± 39,0 mg/dl eine größtenteils signifikant höhere Konzentration gegenüber den folgenden Untersuchungszeitpunkten. Bei beiden Rassen ließ sich bei den Zwillingsmuttern nach dem Lammen ein signifikanter Abfall der α-Lipoproteinkonzentration auf = 144,3 ± 46,1 mg/dl (MFS2) bzw. = 170,2 ± 48,8 mg/dl (SKF2) feststellen. Es bestand eine gesicherte Korrelation zu Cholesterol. Die β-Lipoproteinkonzentration lag in der 1. Woche p.p. bei den Zwillingsmuttern (MFS2 und SKF2) signifikant niedriger als vor dem Lammen. Die SKF2 wiesen in der 5. und 4. Woche a.p. signifikant niedrigere Konzentrationen als die MFS1 auf. Gesicherte Korrelationen bestanden zu TG, Cholesterol und ALAAK (MFS1). Für die α-Lipoproteinkonzentration wurde ein Referenzbereich von 144,3 – 208,0 mg/dl und für die β-Lipoproteinkonzentration von 13,6 – 28,0 mg/dl bei Muttertieren der beschriebenen Rassen ermittelt. Ausgenommen die Insulinkonzentration in der 1. Woche a.p. bestanden keine signifikanten Differenzen zwischen MFS1 und MFS2. Im Vergleich der Rassen zeigten sich signifikante Differenzen in der Glucosekonzentration in der 2. Woche a.p. und in der Konzentration von Bilirubin in der 3. und 1. Woche a.p.. Die BHB-Konzentration zeigte einen konstanten Verlauf und stieg bei den MFS1 bis auf = 0,96 ± 0,36 mmol/l eine Woche p.p., bei den MFS2 auf = 0,73 ± 0,35 mmol/l und bei den SKF2 auf = 0,63 ± 0,14 mmol/l eine Woche a.p. signifikant an. Gesicherte Korrelationen bestanden zu FFS (MFS2) und Insulin (MFS2; SKF2). Die Glucosekonzentration zeigte sich bei den Zwillingsmuttern nach zunächst abfallenden Konzentrationen in der Hochträchtigkeit eine Woche p.p. signifikant höher ( = 3,63 ± 0,59 mmol/l; MFS2 und = 3,28 ± 0,42 mmol/l; SKF2) als vor dem Lammen. Gesicherte Korrelationen ließen sich zu FFS (MFS1; MFS2), BHB (MFS2) und dem Zeitpunkt der Untersuchung (MFS2; SKF2) feststellen. Die FFS-Konzentration stieg bei den SKF2 zur 1. Woche a.p. auf = 265 ± 131 μmol/l an, fiel eine Woche p.p. signifikant auf = 128 ± 95 μmol/l ab und korrelierte gesichert mit TG. Die TG-Konzentration fiel von der 1. Woche a.p. bis zur 1. Woche p.p. signifikant auf = 0,19 mmol/l (MFS1; SKF2) bzw. = 0,18 ± 0,05 mmol/l (MFS2) ab und korrelierte mit Gesamtprotein (MFS1), Cholesterol (MFS1; MFS2), β-Lipoproteinen (MFS1; MFS2) und freiem Endotoxin (MFS1). Die Cholesterolkonzentration fiel eine Woche p.p. bei den Zwillingsmuttern signifikant ab, bei den MFS1 war der Verlauf konstant. Die Bilirubinkonzentration stieg eine Woche p.p. signifikant an (MFS1; MFS2) und korrelierte mit der Konzentration von freiem Endotoxin. Das Gesamtprotein sank zum Zeitpunkt des Ablammens hin signifikant ab, erreichte jedoch eine Woche p.p. wieder seine Ausgangskonzentration. Eine gesicherte Korrelation konnte mit ALAAK festgestellt werden (MFS2; SKF2). Freies Endotoxin konnte zu jedem Zeitpunkt der Untersuchungsreihe nachgewiesen werden. Dabei lagen die festgestellten Konzentrationen bei x̃ = 0,06 – 1,30 EU/ml. Eine gesicherte Korrelation fand sich mit der Konzentration der ALAAK (MFS2). ALAAK konnten ebenfalls zu jedem Zeitpunkt in Konzentrationen von x̃ = 22,2 - 56,8 (OD-Wert) nachgewiesen werden. Fazit: Die Lipoproteinkonzentrationen in den einzelnen Gruppen zeigten sich a.p. zunächst regulativ den erhöhten peripartalen Belastungen des Lipidstoffwechsels angepasst, p.p. demonstrierte auch die Abnahme der Lipoproteinkonzentrationen das Ende der lipolytischen Aktivität bei den Schafen. Die vorliegenden Ergebnisse der Stoffwechselparameter lassen auf eine stärkere Belastung der Zwillingsmuttern schließen, welche auch die Lipoproteine mit einbezieht. Freies Endotoxin konnte auch bei gesunden Schafen zwar zu jedem Zeitpunkt nachgewiesen, eine gesicherte Korrelation mit der Lipoproteinkonzentration jedoch nicht festgestellt werden. / Alexandra Flocke Evaluation of metabolic parameters and lipoproteins in the serum of merino and blackhead sheep for meat production with one or two lambs in the peripartal period Large Animal Clinic for Internal Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Submitted in February 2012 (94 pages, 15 figures, 8 tables, 199 references, 12 tablets in the appendix) Keywords: lipoproteins, sheep, metabolism, endotoxin, ketosis Objective: The lipoprotein status in the critical phase of the peripartal period of sheep has been few reviewed. The ability of lipoproteins to transport and redistribute lipids in the organism and their capacity for endotoxinneutralisation makes them a considerable parameter in metabolic bonded situations. The objective of this research is to show the lipoprotein status of two competitive breeds and to proof if and to what extend differences between ewes with one and two lambs exist. Additionally, the endotoxic situation is assigned and possible correlations with the metabolic system and the lipoprotein status are evaluated. Animals, materials and methods: The research contains healthy merino sheep with one lamb (MFS1), merino sheep with two lambs (MFS2) and blackhead sheep with two lambs (SKF2). At intervals of seven days, blood samples out of the V. jugularis externa were taken from the animals in a period from the 5th week a.p. to one week p.p.. Concentrations in the serum of the following parameters were defined: β-hydroxybutyrat (BHB), glucose, free fatty acids (FFS), triacylglycerol (TG), cholesterol, bilirubin, total protein (all Hitachi 912), insulin (RIA-kit, IBL, Hamburg), α- and β-lipoprotein (LIPIDOPHOR All In12® - without pre-β-lipoprotein), free endotoxin (LAL-test) and anti-lipid A antibodies (ALAAK). Results: The concentration of α-lipoproteins of the MFS1 increased significantly before parturition and finally reached 208,0 ± 40,1 mg/dl (1st Week a.p.). The group of MFS2 showed a constant deviation between = 180,4 ± 31,1 mg/dl (5th Week a.p.) and = 196,1 ± 42,1 mg/dl (3rd week a.p.) before parturition. The SKF2 evidenced with a concentration of = 206,5 ± 39,0 mg/dl in the 5th week a.p. a predominantly significant higher result as during following points in time. Both groups carrying twins showed a significant decrease of the α-lipoprotein concentration down to = 144,3 ± 46,1 mg/dl (MFS2) or = 170,2 ± 48,8 mg/dl (SKF2) after parturition. There were statistically reliable correlations between the α-lipoprotein concentration and cholesterol. The β-lipoprotein concentration from both twin pregnant groups had been significantly lower one week after parturition than before parturition. The results of the SKF2 in week 5 and 4 a.p. were significantly lower than those of the MFS1. Reliable correlations could be determined with TG, cholesterol and ALAAK (MFS1). An α-lipoprotein reference range for ewes of the introduced breeds could be determined from 144,3 - 208,0 mg/dl and for β-lipoproteins from 13,6 - 28,0 mg/dl. There were no significant differences between MFS1 and MFS2 except the concentration of insulin in the 1st week a.p.. In the comparison of the different breeds, significant differences in the concentration of glucose (2nd week a.p.) and bilirubin (3rd week a.p. and 1st week a.p.) could be shown. The concentration of BHB showed a constant deviation and increased significantly to = 0,96 ± 0,36 mmol/l (MFS1; 1st week p.p.), = 0,73 ± 0,35 mmol/l (MFS2, 1st week a.p.) or = 0,63 ± 0,14 mmol/l (SKF2, 1st week a.p.), respectively. Reliable correlations existed with FFS (MFS2) and insulin (MFS2; SKF2). The concentration of glucose of the twin pregnant ewes decreased initially before parturition and increased significantly again in the 1st week p.p. ( = 3,63 ± 0,59 mmol/l; MFS2 and = 3,28 ± 0,42 mmol/l; SKF2). Reliable correlations had been determined with FFS (MFS1; MFS2), BHB (MFS2) and the time of sampling (MFS2; SKF2). Concentrations of FFS increased in the group of SKF2 to = 265 ± 131 μmol/l in the 1st week a.p., decreased again significantly to = 128 ± 95 μmol/l one week p.p. and showed a correlation with TG. The TG concentration decreased significantly from one week a.p. to one week p.p. down to = 0,19 mmol/l (MFS1; SKF2) and = 0,18 ± 0,05 mmol/l (MFS2), respectively. A reliable correlation existed between TG and total protein (MFS1), cholesterol (MFS1; MFS2), β-lipoproteins (MFS1; MFS2) and free endotoxin (MFS1). Both twin pregnant groups had a significant decrease in the cholesterol concentration one week after parturition, in contrast the group of MFS1 showed a constant deviation. The concentration of bilirubin increased significantly one week p.p. (MFS1; MFS2) and showed a reliable correlation with the concentration of free endotoxin. Total protein decreased significantly towards parturition, but reached its initial concentration again one week p.p.. A statistically reliable correlation could be determined with ALAAK (MFS2; SKF2). Free endotoxin could be detected at any point of the exploration. The observed concentrations ranged from x̃ = 0,06 – 1,30 EU/ml. A reliable correlation could be shown with the concentration of ALAAK (MFS2). ALAAK was detected as well in concentrations from x̃ = 22,2 - 56,8 (OD-value) in any taken sample. Conclusion: The lipoprotein concentrations in each group appeared a.p. initially adapted to the peripartal bonds of the increased lipid metabolism. After parturition, the decrease in lipoprotein concentrations, too, demonstrated the end of the lipolytic activity of the ewes. The results of the metabolic parameters lead to the conclusion of a stronger liability of the ewes with twins. This is also valid for the lipoproteins. Free endotoxin could be detected in healthy sheep at any time, but a reliable correlation with the concentration of lipoproteins was not visible.

Stoffwechsel und antioxidativer Status bei Merinofleischschafen im peripartalen Zeitraum Medizinische Tierklinik, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig Eingereicht im Juni 2010 (99 Seiten, 28 Abbildungen, 38 Tabellen, 357 Literaturangaben) Problem- und Zielstellung: Dem antioxidativen System wird im Rahmen von Stoffwech-seluntersuchungen bei Schafen nur wenig Bedeutung geschenkt, jedoch gewinnt es als Schutz- und Regulationssystem zunehmend an Bedeutung. Besonders die Trächtigkeit und die Frühlaktation bei Mutterschafen sowie die postnatale Entwicklung der Lämmer stellen enorme Anforderungen an die Energieversorgung und an das antioxidative System. Das Ziel dieser Arbeit ist, die Bewältigung dieser Anforderungen darzustellen und zu zei-gen, ob und wie stark Zwillingsträchtigkeiten ein Belastung für Mutterschafe darstellen, und ob Lämmer aus einer Zwillingsträchtigkeit möglicherweise benachteiligt sind. Tiere, Material und Methoden: Untersucht wurden insgesamt 23 trächtige Merinofleisch-schafe und zwölf Merinofleischschaflämmer. Bei 13 Muttertieren wurde sonografisch eine Einlingsträchtigkeit (M1) und bei zehn eine Zwillingsträchtigkeit (M2) festgestellt. Bei den Lämmern stammten sechs Tiere aus einer Einlingsgeburt (L1) und sechs aus Zwillingsge-burten (L2). Den Muttertieren wurden von der 5. Woche a.p. bis 1 Woche a.p. wöchentlich sowie 2 Wochen p.p., den Lämmern eine, vier und zwölf Wochen post natum Blutproben entnommen. Im Serum wurden die Konzentrationen von Betahydroxybutyrat (BHB), Glu-cose, Bilirubin, freien Fettsäuren (FFS), Gesamtprotein und Albumin, die Aktivitäten der Glutamatdehydrogenase (GLDH), sowie im Vollblut die Aktivitäten der Superoxiddismutase (SOD) und der Glutathionperoxidase (GPX) gemessen. Ergebnisse: Die SOD- und GPX-Aktivitäten stiegen gleichermaßen bei einlingsträchtigen und zwillingsträchtigen Muttertieren signifikant an. Die SOD-Aktivitäten stiegen bei M1 von 488,2 ± 28 vier Wochen a.p. auf 524,8 ± 96,1 U/g Hb eine Woche a.p. und bei M2 von 447,4 ± 65,1 fünf Wochen a.p. auf 619,4 ± 141,1 U/g Hb zwei Wochen p.p. an. Die GPX-Aktivitäten bei M1 stiegen von 782,1 ± 220,5 eine Woche a.p. auf 1037,62 ± 382,9 U/ml Hk zwei Wochen p.p.. M2 zeigten eine tendenziell niedrigere Aktivität, welche von 641,8 ± 118,4 auf 911,8 ± 168,5 U/ml Hk anstieg. Es bestanden signifikante Zusammenhänge der SOD mit FFS, BHB und Gesamtprotein sowie der GPX mit Bilirubin, FFS und GLDH. Für die SOD-Aktivität wurde ein Referenzbereich von 328,10 bis 837,25 U/g Hb und für die GPX-Aktivität von 473,38 bis 1259,05 U/ml Hk bei Muttertieren ermittelt. Ausgenommen die Glucosekonzentration eine Woche a.p. bestanden keine signifikanten Differenzen zwi-schen M1 und M2. Die BHB-Konzentrationen zeigten bis zur Lammung einen konstanten Verlauf und stiegen bei M1 eine Woche a.p. auf 0,59 ± 0,27 mmol/l sowie bei M1 und M2 zwei Wochen p.p. auf 0,76 ± 0,29 mmol/l (M1) bzw. 0,77 ± 0,25 mmol/l (M2) signifikant an. Gesicherte Korrelationen bestanden zu FFS, Gesamtprotein und Glucose. Die Gesamtprotein- und Albuminkonzentrationen verliefen über den gesamten Untersuchungszeitraum nahezu konstant. Die Albuminkonzentration sank bei M1 nach einem kontinuierlichen An-stieg von einer Woche a.p. (37,2 ± 2,9 g/l) zu zwei Wochen p.p. (35,3 ± 3,6 g/l) signifikant ab. Gesicherte Korrelationen bestanden zu Glucose, SOD, BHB, Bilirubin und FFS. Die Glucose- Konzentrationen stiegen bei M1 bis eine Woche a.p. auf 4,84 ± 1,17 mmol/l sig-nifikant an, korrelierten neben den Proteinen mit Bilirubin und fallen 2 Wochen p.p. wieder auf ihren Ausgangswert ab, der bei M2 konstant blieb. Die Bilirubinkonzentrationen verlie-fen konstant, die der FFS fielen nach einem Anstieg eine Woche a.p. (M1) signifikant ab. Die GLDH-Aktivitäten zeigten a.p. einen konstanten Verlauf und p.p. einen signifikanten Anstieg auf 20,61 ± 14,11 U/l bei M2. Zwischen L1 und L2 bestanden zu keinem Zeitpunkt signifikante Unterschiede. Die SOD zeigte abnehmende Aktivitäten mit zunehmendem Lebensalter, - bei L1 von 757,7 ± 94,4 eine Woche p.p. auf 597,8 ± 255,0 U/g Hb 4 Wochen p.p. und bei L2 von 487,17 ± 353,3 auf 464,0 ± 330,9 U/g Hb. Sie korrelierte gesichert mit Albumin und Glucose in der ersten Lebenswoche. Die GPX-Aktivitäten stiegen mit zunehmendem Lebensalter bei statistisch gesicherter Korrelation mit Glucose von 724,3 ± 199,8 auf 1011,5 ± 132,9 U/ml Hk bei L1 und von 693,3 ± 120,8 auf 1052,0 ± 146,9 U/ml Hk bei L2. Für Lämmer wurden als Refe-renzwerte 43,00 bis 932 U/g Hb für die SOD bzw. 406,00 bis 1321,00 U/ml Hk für die GPX berechnet. Die Albumin- und BHB-Konzentrationen stiegen zur vierten bzw. zwölften Le-benswoche an, die Glucose-, Bilirubin- und FFS-Konzentrationen im Serum sanken zur 12. Lebenswoche ab. Die Gesamtproteinkonzentration und die Aktivität der GLDH verlie-fen konstant. Es bestanden signifikante Korrelationen zwischen BHB und Gesamtprotein, FFS, GLDH sowie zwischen Gesamtprotein und Glucose, Albumin sowie FFS. Des Weite-ren bestanden gesicherte Korrelationen zwischen Bilirubin und FFS sowie FFS und GLDH. Fazit: Die Aktivitäten der antioxidativen Enzyme SOD und GPX sowie die Konzentrationen der klinisch-chemischen Parameter zeigen mit dem Anstieg der SOD-Aktivität von 447 auf 619 U/g Hb bei M2 einerseits die peripartalen Belastungen und andererseits mit dem An-stieg der GPX-Aktivität von 782 auf 1038 U/g Hk bei M1 die Kompensations- und Regel-mechanismen bei dieser Belastungssituation auf. Die Untersuchungen entsprechen dem Zustand einer ausgeglichen Energiebilanz und gesundheitlich stabilen Bedingungen. Ein Einfluss der Lämmerzahl auf das antioxidative System bzw. den Stoffwechsel kann weder bei Mutterschafen noch bei Lämmern statistisch signifikant belegt werden. / Metabolism and antioxidative status of merino sheep for meat production in the peripartum time period Large Animal Clinic for Internal Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Submitted in June 2010 (100 pages, 28 figures, 38 tables, 357 references) Definition of the problem and objective: Until now, the research regarding the metabol-ism of sheep focussed very little on the importance of the antioxidative system, but the significance of its function as a protective and regulative system is increasing. Especially the pregnancy and the early lactation of the ewes as well as the postnatal development of the lambs places enormous demands upon the energy supply and the antioxidative sys-tem. The objective of this study is to show how these demands are met and to determine whether a twin-pregnancy represents an additional stress for the ewes, and whether lambs from a twin-pregnancy are possibly disadvantaged. Animals, materials and methods: 23 pregnant merino ewes and twelve merino lambs were analyzed. Sonographic tests showed that 13 ewes were pregnant with one lamb (M1), and ten showed a twin-pregnancy (M2). Six of the lambs were born as single lambs (L1), six as twins (L2). Blood samples were taken from the ewes every week from the fifth until the week before the birth, as well as two weeks after birth, the blood samples from the lambs were taken one, four and twelve weeks postpartum. The concentration in the serum of the following components was measured: betahydroxybutyrate (BHB), glucose, biliru-bine, free fatty acids (FFS), total protein and albumine, the activity of the glutamatedehy-drogenasis (GLDH), as well as the activity in whole- blood of superoxidedismutasis (SOD) and glutathionperoxidasis (GPX). Results: The SOD- and GPX-activities rose significantly at the same rate for mother sheep pregnant with one lamb or with twins. The SOD-activity rose for M1 from 488,2 +/- 28 four weeks prepartum to 524 +/- 96,1 U/g Hb one week prepartum, and for M2 from 447,4 +/- 65,1 five weeks prepartum to 619,4 +/- 141,1 U/g Hb two weeks prepartum. The GPX-activity for M1 rose from 782,1 +/- 220,5 one week prepartum to 1037,62 +/- 382,9 U/ml two weeks postpartum, while M2 showed a tendency towards lower activity, which rose from 641,8 +/- 118,4 to 911,8 +/- 168,5 U/ml Hk. There were significant correlations between the SOD and the FFS, the BHB and the total protein as well as the GPX with bili-rubine, FFS and GLDH. For the ewes, an SOD-activity reference range between 328,10 and 837,25 U/g Hb was determined, and a GPX-activity reference range between 473,38 and 1259,05 U/ml Hk. There were no significant differences between M1 and M2 except for the concentration of glucose. The BHB-concentration stayed constant up to birth and then rose significantly to 0,59 +/- 0,27 mmol/l for M1 one week postpartum and for both M1 and M2 to 0,76 +/- 0,29 mmol/l (M1) and 0,77 +/- 0,25 mmol/l (M2) two weeks postpartum. A reliable correlation could be determined with FFS, total protein and glucose. The total protein and the albu-mine concentration stayed almost constant during the whole analyzed time period. After a continuous increase between one week prepartum (37,2 +/- 2,9 g/l) and two weeks post-partum (35,3 +/- 3,6 g/l), the albumine concentration dropped considerably. Here, reliable correlations could be determined with glucose, SOD, BHB, bilirubine and FFS. For the group M1, the glucose concentrations rose significantly until one week prepartum to 4,84 +/- 1,17 mmol/l, correlated with both the proteins and bilirubine, then fell back to their initial level two weeks postpartum, while they did not change for M2. The concentrations of bili-rubine stayed constant, the FFS-concentrations fell significantly after an increase one week prepartum (M1). The GLDH-activities showed a constant trend prepartum, then rose significantly postpartum to 20,61 +/14,11 U/l for M2. There were no significant differences between L1 and L2 at any time. The SOD showed decreasing activity with increasing age, from 757,7 +/- 94,4 one week prepartum to 597,8 +/- 255,0 U/g Hb four weeks postpartum for L1 and from 487,17 +/- 353,3 to 464,0 +/- 330,9 U/g Hb for L2. A reliable correlation was determined with albumine and glucose in the first week after birth. The GPX-activities rose with increasing age with a statistically reliable correlation with glucose from 724,3 +/- 199,8 to 1011,5 +/- 132,9 U/ml Hk for L1 and from 693,3 +/- 120,0 to 1052,0 +/- 146,9 U/ml Hk for L2. The calculated reference val-ues for lambs were 43,00 to 932 U/g Hb for SOD and 406,00 to 1321,00 U/ml Hk for GPX. The concentrations of albumine and BHB rose towards the fourth and respectively the twelvth week of life, the levels of glucose, bilirubine and FFS dropped towards the 12th week. The total protein concentration and the GLDH-activities stayed constant. There were significant correlations between BHB and total protein, FFS, GLDH as well as between total protein and glucose, albumine and FFS. In addition, there were reliable correlations between bilirubine and FFS and FFS and GLDH. Conclusion: The activities of the antioxidative enzymes SOD and GPX as well as the concentrations of the clinical-chemical parameters show the prepartum stress on one side with the rise of the SOD-activity from 447 to 619 U/g for the group M2, and the compensa-tion and regulation mechanisms during this stress period on the other side with the in-crease of the GPX-activity from 782 to 1038 U/g Hk for the group M1. The results of the tests correspond to the status of a well-regulated energy balance and stable health condi-tions. An influence of the number of lambs on the antioxidative system or the metabolism for both lambs and ewes can not be shown with statistical significance.

Thesis (doctoral)--Universität Stuttgart, 1995.

Zusammenfassung Katharina Regina Winkler Hämatologisch-immunologische Verlaufsuntersuchungen bei Kühen mit Gebärparese Medizinische Tierklinik der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Eingereicht im September 2014 100 Seiten, 41 Abbildungen, 13 Tabellen, 282 Literaturangaben, 17 Seiten Anhang Schlüsselwörter: Gebärparese, Stoffwechsel, Glucocorticoide, Endotoxin, Blutbild Problemstellung: Der Mineralstoffwechsel unterliegt immunologischen Einflüssen. Vitamin-D3 ist essentiell für die Antigen- und Zytokinsynthesen in den Blutzellen. Die Osteoblastenreifung wird durch Zytokine beeinflusst. Das tangiert die Gebärparese (GP) und erschließt potentiell prophylaktische sowie therapeutische Ansätze. Zielstellung: Es wurde geprüft, ob a) es Mineralstoffunterschiede bei der GP-Diagnose und im Verlauf zu früheren Studien gibt, b) die Parameter Endotoxin (ET), anti-Lipid A-IgG-Titer (ALA-IgG-Titer) und Haptoglobin (Hp) sowie Leuko- und Erythrogramme gesicherte Beziehungen zur GP sowie zu Mineralstoffen und immunologischen Parametern haben, c) die Therapie bei GP durch Glucocorticoide verbessert werden kann und d) Jungkühe mehr Geburtsstress und Belastungen des Ca-Pi-K-Stoffwechsels haben. Versuchsanordnung: Untersucht wurden 111 HF-Kühe bzw. Jungkühe: 21 GP-Kühe mit Grundbehandlung, 22 GP-Kühe mit zusätzlicher Dexamethason-21-iso-ni-cotinat-Therapie (Dexa-IN), 40 gesunde Kontrollkühe (KG) und 28 gesunde Jungkühe. Laborkontrollen erfolgten bei den GP-Kühen vor der Therapie, bei den KG 1 - 3 Tage post partum (d p. p.) sowie 1 d und 14 d nach dem Therapiedatum. Analysiert wurden neben Stoffwechselparametern Endotoxin (LAL-Test), ALA-IgG-Titer, Haptoglobin sowie das Leuko- und Erythrogramm. Ergebnisse: Die Erstbehandlung war bei 47 % ohne und 67 % mit Dexa-IN-Therapie erfolgreich; die Heilungsrate betrug 74 bzw. 82 %, d. h., die Dexa-IN-Therapie verbesserte das Behandlungsergebnis bei GP ohne Nebenwirkungen. 69,8 % der GP-Kühe hatten eine kombinierte Hypokalz- und Hypophosphatämie. 24 Stunden nach Beginn der Therapie waren beide Mineralstoffe in den GP-Gruppen wieder physiologisch. 11,6 % der GP-Kühe und 10,7 % der Jungkühe hatten eine Hypophosphatämie. Das ist offensichtlich eine Folge des Kalbestresses in diesen Gruppen. Die Mg-, Na- und Cl-Konzentrationen waren in allen Gruppen physiologisch. Mg korrelierte negativ mit Ca und Pi (p<0,01). Die K-Konzentrationen waren in den GP-Gruppen einen d p. p. signifikant niedriger als in den KG. Sie korrelierten mit Ca- und Pi in den GP-Gruppen mit 0,42 bis 0,48 (p<0,01). Auf stärkere Stresseinflüsse auf K wiesen Korrelationen zu Glucose, Bilirubin, eosinophile und basophile Granulozyten sowie Lymphozyten hin. Die Fe-Konzentrationen der GP- und KG-Kühe waren physiologisch. Fe korrelierte mit ALA-IgG-Titer gesichert negativ. Die ET-Konzentrationen ließen nur schwache Beziehungen zur GP erkennen, wie rET:Ca=-0,17 (p<0,05). ET korrelierte mit den ALA-IgG-Titern gesichert positiv (Dexa-IN-Gruppe). Die ALA-IgG-Titer differierten bei den Kühen nicht gesichert, sie korrelierten nicht mit Ca, aber mit Pi und mit der Mehrzahl der klinisch-chemischen und hämatologischen Parameter. Das zeigt die Entzündungseinflüsse auf den Pi-Stoffwechsel mit der Förderung von Hypophosphatämien. Die Hp-Konzentrationen streuten stark und waren in allen Gruppen am Diagnose- und noch mehr am Folgetag erhöht (p>0,05). Bei Jungkühen wies der höhere Anstieg auf stärkeren Kalbestress hin. Die Leukozytenzahl war am GP-Diagnosetag erhöht (Leukozytose; p>0,05) und sank zum Folgetag in den Normbereich ab. In der Dexa-IN-Gruppe war der Abfall am stärksten (p<0,05). Die Leukozytenzahl korrelierte gesichert negativ mit den ALA-IgG-Titer sowie in den GP-Gruppen mit den Pi- sowie Ca-Konzentrationen, ebenso die neutrophilen Granulozyten. Eosinophile, basophile Granulozyten sowie Lymphozyten sanken p. p. ab (p<0,05) und korrelierten gesichert mit Ca und Pi. Die GP-Kühe hatten am Diagnosetag eine Monozytose (p<0,05). Die Monozyten korrelierten mit den ALA-IgG-Titern, mit dem Pi und dem Ca gesichert negativ. Sie hatten die engsten Beziehungen zum Entzündungsgeschehen sowie den Pi- und Ca-Konzentrationen. Die CK-Aktivitäten waren am Diagnose- und am Folgetag gegenüber der KG signifikant erhöht. Mit Ca korrelierte die CK in allen Kuh-Gruppen gesichert negativ, mit Pi nur in der GP-Gruppe ohne Dexa-IN. Die CK stand in enger gesicherter Beziehung zu Entzündungsindikatoren. Hämoglobin war in den GP-Gruppen am Diagnosetag signifikant, der Hämatokrit und die Erythrozytenzahlen tendenziell gesteigert. Schlussfolgerungen: Die Studie zeigt bei GP-Kühen vielfältige Beziehungen des Ca-Pi-K-Stoffwechsels zu Entzündungsindikatoren und legt ursächliche Einflüsse nahe, besonders zu ALA-IgG-Titern und Monozyten. Sie können Ursachen für Hypophosphat- und Hypokalämie sein. Zusätzliche Dexa-IN-Therapie verbessert das Behandlungsergebnis.