L'infarctus du myocarde est une maladie très répandue dans les pays industrialisés. La condition d'ischémie-reperfusion qui en est à l'origine endommage les tissus par la production accrue d'espèces oxygénées réactives (EOR) qui conduisent les cellules à un état de stress oxydatif. L'oxyde nitrique (NO·) est non seulement une EOR mais aussi une molécule de signalisation importante dans le système cardiovasculaire. Plusieurs effets cytoprotecteurs du NO· et de ses dérivés ont été démontrés dans le coeur ischémie-reperfusé, mais des effets cytotoxiques ont aussi été rapportés. La céruloplasmine (CP) est une glycoprotéine à cuivre circulante multifonctionnelle. Quoiqu'elle soit étudiée depuis longtemps, certaines de ses propriétés demeurent incomprises. Elle est entre autres reconnue comme un antioxydant circulant très important. L'équipe du Dr Mateescu a d'ailleurs rapporté qu'elle protège le coeur isolé des EOR durant l'ischémie-reperfusion. D'autres équipes ont toutefois montré une activité pro-oxydante de la CP qui ferait d'elle un facteur de risque associé aux maladies cardiovasculaires. Deux activités de la CP ont récemment été mises en évidence in vitro: la synthèse de nitrosothiols (RSNO) et de nitrites (NO₂¯) deux dérivés du NO· considérés comme des formes d'entreposage qui prolongeraient la durée de vie de ce facteur. Nous avons donc posé l'hypothèse d'une implication de la CP dans la potentialisation des effets du NO· par ses nouvelles activités. Le but de cette étude était ainsi d'évaluer l'effet cytoprotecteur de la combinaison CP + NO· et de vérifier l'implication d'une activité S-nitrosante et/ou nitrite-synthase de la CP. Pour ce faire, des cultures de cardiomyocytes de rats nouveau-nés ont été soumises à un stress oxydatif généré par l'ajout de H₂O₂ au milieu de culture. L'effet toxique ou protecteur de la CP et d'un donneur de NO·, le PAPA NONOate, a été déterminé par la mesure de la viabilité cellulaire à l'aide d'une coloration au Hoechst 33342 et à l'iodure de propidium. Les dérivés RSNO et NO₂¯du NO· ont été mesurés dans les milieux de culture par les réactifs colorimétriques de Griess ou par la sonde fluorescente DAN, après une optimisation de ces méthodes de dosage. Les résultats, qui vont à l'encontre de l'hypothèse de départ, ont montré que ni la CP, ni la combinaison CP + NO· ne protègent les cardiomyocytes du H₂O₂. La CP a même exercé un effet cytotoxique sur les cellules en présence de H₂O₂. Le NO· à faible concentration procure une certaine protection contre le H₂O₂, mais en intensifie la toxicité à forte concentration. En conditions acellulaires, l'activité S-nitrosante de la CP sur le glutathion a été confirmée et est comparable à celle de la littérature. La synthèse de NO₂¯ n'a toutefois pas été observée à des niveaux détectables. Des faits nouveaux ont aussi été révélés: la CP est capable d'« auto-nitrosation » et l'albumine inhibe l'activité S-nitrosante de la CP. Cette étude indiquerait que l'action cardioprotectrice de la CP contre les dommages causés par l'ischémie-reperfusion n'inclurait pas une protection contre le H₂O₂, ni une potentialisation de l'action du NO· contre ce H₂O₂. L'albumine présente dans le milieu de culture pourrait avoir masqué les possibles interactions entre la CP et le NO·. Ce dernier résultat suggère que la CP circulante aurait peu d'impact sur le métabolisme du NO· en situation physiologique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Céruloplasmine, Oxyde nitrique, Cardiomyocytes, Stress oxydatif, S-nitrosation.

Les lipocalines sont des petites protéines de structure tertiaire simple qui ont l'habileté de lier de petites molécules généralement hydrophobes. De récentes études ont montré que les lipocalines animales jouent un rôle important dans la régulation du développement et sont impliquées dans la tolérance au stress oxydatif. Les plantes possèdent aussi des types variés de lipocalines. Les analyses bioinformatiques ont prédit que certains membres pourraient être localisés dans le chloroplaste, suggérant une fonction dans la protection de l'appareil photosynthétique lors de conditions de stress oxydatif. Ce travail présente la caractérisation fonctionnelle de la lipocaline chloroplastique AtCHL chez Arabidopsis thaliana. Un fractionnement cellulaire a montré qu'AtCHL est une protéine du lumen des thylacoïdes. La sécheresse, les hautes intensités lumineuses, et le traitement au paraquat et à l'acide abscissique induisent l'accumulation du messager et de la protéine AtCHL. Sous des conditions normales de croissance, les lignées de type sauvage, de sous-(KO) et sur-(OEX) expression ne montrent pas de différence au niveau phénotypique même si elles montrent des niveaux d'accumulation d'AtCHL dramatiquement différents. Lors d'un stress de sécheresse ou un stress oxydatif, l'absence d'AtCHL dans les plantes KO mène à plus de dommages alors qu'un haut niveau d'AtCHL permet aux plantes OEX de mieux surmonter les stress. Le niveau d'accumulation d'AtCHL est inversement proportionnel au niveau de lipides peroxydés. Ces résultats montrent qu'AtCHL est vraisemblablement impliquée dans la protection des lipides, localisés du côté luménal des thylacoïdes, contre les espèces réactives d'oxygène générées sous les stress de sécheresse et oxydatif. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Chloroplaste, Peroxydation des lipides, Lipocalines, Tolérance aux stress, Stress oxydatif.

Thèse doctorat : Biologie forestière : Nancy 1 : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre.

Thèse de doctorat : Génie des procédés et des produits : INPL : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique.

La plupart des cellules cancéreuses présentent une reprogrammation métabolique qui favorise la glycolyse et diminue la phosphorylation oxydative. Cette reprogrammation a reçu le nom d’effet Warburg et permet aux cellules tumorales de proliférer même en conditions adverses. Bien que l’effet Warburg ait été, pendant longtemps, associé à un dysfonctionnement mitochondrial, plusieurs études ont montré que dans les cellules cancéreuses les mitochondries ne sont pas dysfonctionnelles et jouent même un rôle important dans la tumorigénèse. Cependant, les mécanismes qui régulent cette reprogrammation métabolique dans le mélanome restent encore à être bien évalués. Dans ce contexte, nous avons montré que les mélanomes présentent une faible activité mitochondriale caractérisée par une diminution de la consommation d’oxygène. Ce profil métabolique est contrôlé au moins en partie par le facteur de transcription HIF-1, via l’expression de la pyruvate déshydrogénase kinase 3 (PDK3). L’inhibition pharmacologique de la PDK3, utilisant le Dichloroacetate (DCA) est suffisante pour réactiver la phosphorylation oxydative et induire la production des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Ainsi, la combinaison du DCA avec la molécule pro-oxydant elesclomol permet de potentialiser l’effet antitumural de cette dernière, de manière synergique. Fait intéressant, cette combinaison est également efficace dans les cellules ayant développé une résistance au vemurafenib, un inhibiteur de la protéine BRAFV600E. Dans ce contexte, dans la deuxième partie de cette étude, nous avons évalué si les cellules résistantes au vemurafenib présentent une modification métabolique qui pourrait expliquer leur sensibilité à la combiniasion DCA+eleslclomol. Nous avons montré que le vemurafenib induit une diminution de la glycolyse rendant les cellules dépendantes à la phosphorylation oxydative et augmente la biogénèse mitochondriale de manière dépendante ou indépendante de la réactivation de la voie MITF/PGC1α. En accord avec ces résultats, les cellules résistantes au vemurafenib présentent une augmentation de la consommation d’oxygène et de la production de ROS par rapport aux cellules sensibles. Le nouveau profil métabolique des cellules résistantes les rende plus sensibles aux agents pro-oxydants tels que l’elesclomol Nos résultats ont permis de montré la possibilité de cibler les modifications métaboliques par une approche pro-oxydant dans le but d’éradiquer de manière efficace les cellules de mélanome. / Most cancer cells undergo a metabolic rewiring from oxidative phosphorylation to glycolysis that allows them to proliferate even under stressful conditions. This phenomenon is known as the Warburg Effect and has been often associated to mitochondrial dysfunction. Although, many studies have shown that mitochondria is still active in cancer cells and seems to play a key role in tumorigenesis little is know about the mechanisms that regulate this metabolic swift. In this context, we first focused in the study of melanoma metabolism in different cell lines as in samples coming from patients. We first found that melanoma cells present low mitochondrial activity characterized by low oxidative phosphorylation. This metabolic behavior is at least partially controlled by the hypoxia-inducible factor-1α HIF-1α witch is constitutively express in melanoma cells even under nomoxic conditions. Inhibition of this factor induces a strong decrease in the expression and activity of PDK3. Pharmacological inhibition of PDK3 activity by dichloroacetate (DCA) is enough to reactivate mitochondrial oxidative phosphorylation and reactive oxygen species (ROS) production. Furthermore DCA increases in a synergistic manner elesclomol’s induced ROS production and cell death. Interestingly, BRAF V600E melanoma cells that were resistant to the BRAF inhibitor vemurafenib show were also sensible to this combination. Consequently, as a second part of this work we looked for to understand, why resistant cells were so sensible to these agents and if there were some metabolic modifications that could explain this behavior. We found that vemurafenib BRAFV600E induced inhibition causes an important decrease in glycolysis and renders melanoma cells addicted to oxidative phosphorylation by increasing mitochondria biogenesis dependently or not of MTIF/PCG1 axis. Conversely, vemurafenib resistant melanoma cell lines show higher mitochondrial activity associated with higher ROS production. Thus these cells are more sensible to elesclomol induced cell death than vemurafenib sensible cell lines. Our findings provide new insights into the metabolic pathways that allow cells to adapt to difficult microenvironment, showing that these metabolic modifications, especially in terms of ROS production, can be used to target and eradicate melanoma cells.

[Préconditionnement hypoxique des myoblastes humains ; préconditionnement pharmacologique des myoblastes humains]. / Problématique: La transplantation des myoblastes est une approche thérapeutique potentielle pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Un des facteurs limitant de cette approche est la mort précoce de près de 80 % des myoblastes transplantés durant les premiers jours suivant la greffe. Nous avons vérifié si le préconditionnement hypoxique et pharmacologique des myoblastes humains permettait de réduire leur taux de mortalité in vitro. Par ailleurs, un 'cocktail' pro-survie constitué de facteurs anti-apoptotiques a été utilisé dans le but d'en tester l'effet sur la survie des myoblastes in vivo. Méthode: In vitro, la mortalité a été évaluée par marquage à l'Annexine V et par analyse au FACS. In vivo, la quantité de cellules vivantes a été estimée par scintigraphie en mesurant la quantité de carbone 14 radioactif incorporé dans l'ADN des myoblastes. Résultats: In vitro, le préconditionnement hypoxique des myoblastes permet d'augmenter le taux de prolifération des myoblastes. Le préconditionnement pharmacologique des myoblastes au DETA-NO (10 muM), un donneur d'oxyde nitrique permet d'améliorer leur survie in vitro (p<O.05). Par ailleurs, le traitement des myoblastes au diazoxide (1 00 muM), un activateur de canaux potassiques sensibles à l'ATP, combiné à un traitement au DETA-NO (50 muM ) permet d'améliorer de façon significative la survie des myoblastes in vitro (p<O.Ol). Le cocktail pro-survie permet de protéger les myotubes humains d'un stress anoxique prolongé (96 heures) in vitro. De plus, la transplantation des myoblastes humains suspendus dans le cocktail permet d'augmenter de 7 fois leur survie au bout de 5 jours après la greffe (p<O.Ol). Conclusion: Les préconditionnements hypoxique et pharmacologique sont des stratégies qui permettent de protéger les myoblastes humains du stress oxydatif in vitro. Le cocktail pro-survie peut être utilisé afin d'améliorer la transplantation des myoblastes. / Problématique: La transplantation des myoblastes est une approche thérapeutique potentielle pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Un des facteurs limitant de cette approche est la mort précoce de près de 80 % des myoblastes transplantés durant les premiers jours suivant la greffe. Nous avons vérifié si le préconditionnement hypoxique et pharmacologique des myoblastes humains permettait de réduire leur taux de mortalité in vitro. Par ailleurs, un 'cocktail' pro-survie constitué de facteurs anti-apoptotiques a été utilisé dans le but d’en tester l'effet sur la survie des myoblastes in vivo. Méthode: In vitro, la mortalité a été évaluée par marquage à l'Annexine V et par analyse au FACS. In vivo, la quantité de cellules vivantes a été estimée par scintigraphie en mesurant la quantité de carbone 14 radioactif incorporé dans l'ADN des myoblastes. Résultats: In vitro, le préconditionnement hypoxique des myoblastes permet d'augmenter le taux de prolifération des myoblastes. Le préconditionnement pharmacologique des myoblastes au DETA-NO (10 ~M), un donneur d'oxyde nitrique permet d'améliorer leur survie in vitro (p<O.05). Par ailleurs, le traitement des myoblastes au diazoxide (1 00 ~M), un activateur de canaux potassiques sensibles à l'ATP, combiné à un traitement au DETA-NO (50 ~M ) permet d'améliorer de façon significative la survie des myoblastes in vitro (p<O.Ol). Le cocktail pro-survie permet de protéger les myotubes humains d'un stress anoxique prolongé (96 heures) in vitro. De plus, la transplantation des myoblastes humains suspendus dans le cocktail permet d'augmenter de 7 fois leur survie au bout de 5 jours après la greffe (p<O.Ol). Conclusion: Les préconditionnements hypoxique et pharmacologique sont des stratégies qui permettent de protéger les myoblastes humains du stress oxydatif in vitro. Le cocktail pro-survie peut être utilisé afin d'améliorer la transplantation des myoblastes. / Background: Myoblast transplantation is a potential therapeutical approach for Duchenne muscular dystrophy. One limiting problem is that up to 80 % of the transplanted myoblasts die few days following the graft. We have demonstrated that the hypoxic and pharmacological preconditioning reduces cell death in vitro. Moreover, a pro-survival cocktail composed of anti-apoptotic factors has been tested on the survival of human myoblasts transplanted into immunodeficient mice. Method: In vitro, cell death was evaluated by labeling cells with Annexin V followed by FACS analysis. In vivo, the percentage of cell viability was measured by the thymidine quantity in the transplanted cell DNA. Results: In vitro, the hypoxic preconditioning of myoblasts improved the proliferation of myoblasts. Pharmacologie preconditioning with DETA-NO (10 ~M), a nitric oxide donor, improved myoblasts survival in vitro (p<0.05). Furthermore, diazoxide (100 ~M), an ATP-dependent channel opener, combined with DETA-NO (50 ~M) improved significantly myoblasts survival in vitro (p<O.O 1). In addition to that, the prosurvival cocktail protected human myotubes from anoxie injury (96 hours). This cocktail improves myoblast survival 7-fold, five days after their transplantation (p<O.Ol). Conclusion: Hypoxic and pharmacologie al preconditioning can be used to protect myoblast from oxidative stress injury in vitro. AIso, the pro-survival cocktail. can be used to improve myoblast transplantation.

Le phénomène du vieillissement des populations des pays industrialisés accompagné par l'augmentation de la prévalence de la démence constitue un défi majeur pour les systèmes de santé. Les causes définitives et les voies de développement de ces maladies ne sont pas encore comprises et elles restent jusqu'à présent sans moyens de prévention ou de traitement. L'hypothèse du stress oxydatif dans la pathogenèse des maladies neurodegeneratives est l'une des deux principales rapportées dans la littérature. Le présent projet de recherche visait à évaluer l'association entre les concentrations plasmatiques des lipoprotéines de faible densité oxydées, un marqueur d'oxydation, et le risque de démence et de maladie d'Alzheimer à partir des données de l'Étude sur la santé et le vieillissement au Canada, une étude longitudinale sur la démence chez les individus de 65 ans et plus. Les résultats étaient principalement non concluants mais d'autres études seraient néanmoins souhaitables pour approfondir la question.

La prééclampsie est une pathologie obstétricale complexe caractérisée par de l'hypertension et de la protéinurie. Un facteur de risque majeur serait une placentation inadéquate. Plusieurs évidences lient la progression et le maintien de cette maladie à un déséquilibre entre les agents prooxydants et antioxydants. Les enzymes antioxydantes, les glutathion peroxydases (GPx), pourraient jouer un rôle crucial dans cette pathologie. Cinq formes de GPx sont connues, mais aucune n'a été étudiée spécifiquement dans la circulation sanguine des femmes prééclamptiques. Dans cette étude, l'analyse de l'expression des GPx-l et -4 a été faite dans le sang des femmes prééclamptiques et de leur foetus en comparaison avec un groupe contrôle de grossesses. Les niveaux d'ARNm et de protéines des GPx-l et -4 sont plus élevés en prééclampsie et cela, spécifiquement dans les lymphocytes/monocytes sanguins maternels. Ce travail suggère que le groupe atteint de prééclampsie a des défenses antioxydantes accrues dans le but, probablement, de contrer le stress oxydatif caractérisant cette pathologie.

Des travaux antérieurs effectués dans notre laboratoire ont démontré une corrélation entre les niveaux circulants de peroxyde d'hydrogène (H[indice inférieur 2]O[indice inférieur 2]) et d'hormone gonadotrophine chorionique humaine (hCG) chez des femmes souffrant de prééclampsie (Kharfi et al, . 2005). Le peroxyde d'hydrogène étant surtout connu pour ses effets cytotoxiques, nous avons déterminé quels étaient ses effets sur des cellules placentaires in vitro, en rapport aux conditions retrouvées in vivo chez des femmes prééclamptiques. Pour ce faire, nous avons développé un modèle d'étude de cellules trophoblastiques in vitro, avec lequel nous avons pu évaluer les effets du peroxyde d'hydrogène sur la fonction placentaire via la production d'hCG, sur la production de TNF-[alpha] comme marqueur inflammatoire et sur l'oxyde nitrique (NO) comme facteur vasodilatateur. Nos résultats nous ont permis de constater divers effets du peroxyde d'hydrogène sur les cytotrophoblastes in vitro, effets qui peuvent être corrélés avec les niveaux constatés chez la femme prééclamptique. Premièrement, nous avons pu observer une augmentation de la production d'hCG sous l'effet de faibles concentrations de peroxyde d'hydrogène (<50 [micro]M), alors que des concentrations plus élevées diminuent l'activité placentaire en diminuant la sécrétion d'hCG, démontrant son action cytotoxique à plus forte dose. Ceci a également été constaté par une augmentation de l'apoptose. Le peroxyde d'hydrogène a aussi démontré ses effets sur la production par les cytotrophoblastes de facteurs pro-inflammatoires, tel le TNF-[alpha], ainsi que de son récepteur, le TNFR2, qui sont tous deux augmentés après traitement. Le peroxyde d'hydrogène semble aussi avoir une influence sur la production de médiateurs vasodilatateurs tel l'oxyde nitrique, dont la diminution est observée in vitro avec des concentrations croissantes d'H[indice inférieur 2]O[indice inférieur 2]. Le stress oxydatif dans la prééclampsie, représenté dans notre modèle in vitro par le peroxyde d'hydrogène, semble donc être central dans la physiopathologie de cette maladie, puisqu'on peut lui attribuer en partie la variation d'importants facteurs. Toutefois, les moyens de la prise en charge de cette condition pathologique doivent être soigneusement déterminés, puisque le peroxyde d'hydrogène paraît avoir tout de même un rôle physiologique important à jouer, d'où l'intérêt de parler d'équilibre oxydatif.