Ziel dieser Studie war die Etablierung einer Kokultur aus equinen endometrialen Epithel- und Stromazellen. Nach der erfolgreichen Umsetzung des Kokulturmodells sollte im weiteren Versuchsablauf durch die Zugabe von 17β-Östradiol (E2) und/oder Progesteron (P4) zum Nährmedium der Einfluss der Hormone auf die Zellen untersucht werden. Neben einer lichtmikroskopischen Auswertung der zytomorphologischen Charakteristika beider Zellarten sollte die Expression der Steroidhormonrezeptoren Östrogenrezeptor α und Progesteronre-zeptor sowie der uterinen Proteine Uteroglobin und CalbindinD9k immunzytologisch überprüft werden. Für die Etablierung der Kokultur wurden Endometriumproben von lebenden (n = 5) sowie frischtoten (n = 4) Stuten gewonnen. Eine jeweils parallel entnommene Gewebeprobe von jedem Tier wurde in Formalin fixiert und diente als Referenzmaterial (in situ). Auf die Zelliso-lierung (mechanisch und enzymatisch) folgte die Separation von Epithel- und Stromazellen (EZ/SZ) mittels Filtration, Dichtegradientenzentrifugation und Differenzialadhärenz. An-schließend wurden die EZ auf die Außenseite von Millicell®-Membraneinsätzen aufgebracht. Nach zwei Tagen erfolgte das Einsäen der bis zu diesem Zeitpunkt separat kultivierten SZ auf die Innenseite der Membranen. Als Nährmedium diente ein Gemisch aus DMEM und Ham’s F-12, wobei diesem 2,5 % fötales Kälberserum sowie verschiedene Additive zugesetzt wurden. Ab Kulturtag 4 wurden dem Medium definierte Konzentrationen und Kombinationen von E2 und P4 zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei einem CO2-Partialdruck von 5 % in 37 °C warmer wasserdampfgesättigter Raumluft. Mit der polarisationsmikroskopisch er-fassbaren Ausbildung durchgehender Zellrasen („scheinbare Konfluenz“) wurden die Kokul-turen in Formalin fixiert und für die Lichtmikroskopie aufgearbeitet. Das Ausgangsgewebe zeigte mehrheitlich eine sekretorische Funktionsmorphologie (n = 6). Einzelne Endometrien befanden sich in einem Übergangsstadium von der Sekretions- zur Proliferationsphase (n = 1), bzw. vice versa (n = 1) oder wiesen eine irregulär proliferative Differenzierung (n = 1) auf. Im Rahmen der Kokultivierung bildeten die EZ innerhalb der Schnittebene vier und die SZ drei verschiedene morphologische Zelltypen aus. Dabei traten rundovale bis polygonale EZ (Typ 1) selten bis gelegentlich, spindelförmige EZ (Typ 2) gelegentlich bis häufig und iso-prismatische (Typ 3) sowie mehrschichtig wachsende EZ (Typ M) jeweils selten auf. Die SZ zeigten innerhalb der Schnittebene selten eine rundovale bis polygonale Zellform (Typ 1), sehr häufig eine spindelförmige Morphologie (Typ 2) und selten ein mehrschichtiges Wachstum (Typ M). Ein Zusammenhang zwischen der endometrialen Funktionsmorphologie zum Zeitpunkt der Zellisolierung oder dem Hormonzusatz und der Häufigkeitsverteilung der Zell-typen sowie der Wachstumsgeschwindigkeit der kultivierten Zellen war nicht offensichtlich. Zytokeratin 19 wurde stets von EZ exprimiert, während es auf Seiten der SZ nur sporadisch in maximal 5 % der Zellen im Bereich mehrschichtig wachsender Zellrasen auftrat. Die Stero-idhormonrezeptoren konnten lediglich in einzelnen Kokulturen aus sekretorisch differenzier-tem Ausgangsgewebe detektiert werden. Uteroglobin wurde in vitro mit einer variablen Häufigkeit in den EZ-Typen exprimiert. Während ein übergreifender Zusammenhang zur hormonellen Supplementierung nicht abgeleitet werden konnte, wurde jedoch ersichtlich, dass im Bereich einschichtig wachsender EZ in Ansätzen aus sekretorisch differenzierten Endometrien unter niedrigen Hormondosen (Zusatz von entweder nur E2 oder nur P4) im Median häufiger Uteroglobin exprimiert wurde. Mit zunehmender Hormonkonzentration im Medium nahm der Anteil immunopositiver Zellen (Typen 1, 2 und 3) deutlich ab. Innerhalb der Stromazellpopulation wurde Uteroglobin selten und ausschließlich in Zellen aus sekretorisch differenziertem Ausgangsmaterial nachgewiesen. CalbindinD9k wurde in vitro vornehmlich intrazytoplasmatisch und sehr vereinzelt intranukleär exprimiert. Insgesamt konnte das Protein in vitro stets in wenigen Typ-1-EZ, sehr selten in Typ-2-EZ und in einer geringen bis mäßigen Anzahl von Typ-3- und Typ-M-EZ beobachtet werden. Innerhalb der Stromazellpo-pulation trat CalbindinD9k ausschließlich in einer geringen (Endometrien aus dem Östrus) bis mäßigen (Endometrien aus dem Interöstrus) Anzahl der Typ-2- und wenigen Typ-M-SZ auf. Insgesamt wurden keine deutlichen Einflüsse der endometrialen Funktionsmorphologie zum Zeitpunkt der Zellisolierung und/oder der hormonellen Supplementierung in vitro auf die im-munzytologischen Charakteristika der kokultivierten Zellen ersichtlich. Abschließend betrachtet, konnte ein Kokultursystem equiner endometrialer Epithel- und Stromazellen erfolgreich etabliert und charakterisiert werden. Es bietet dabei, trotz der z. T. fehlenden Kongruenz zu den Gegebenheiten in situ, Ansätze für potenzielle Folgearbeiten, insbesondere hinsichtlich der Erfassung interzellulärer Wechselwirkungen sowie bezüglich der Vermittlung und Wirkung hormoneller Einflüsse auf zellulärer Ebene. / The aim of the present study was the establishment of a coculture system of equine endome-trial epithelial and stromal cells. Subsequent to the successful development of the coculture model the culture medium should be supplemented with 17β-estradiol (E2) and/or progester-one (P4) in order to study the influence of the hormones on the cellular level. In addition to the examination of cytomorphological characteristics of both cell types via light microscopy, the expression of the steroid hormone receptors (estrogen receptor α and progesterone receptor) as well as of the uterine proteins Uteroglobin and CalbindinD9k was investigated. For the establishment of the coculture system endometrial samples were obtained from living (n = 5) as well as freshly deceased mares (n = 4). A simultaneously taken tissue specimen of each animal was fixed in formalin and served as in situ reference material. After an initial mechanical and enzymatical isolation the epithelial and stromal cells (EC/SC) were separat-ed via filtration, density gradient centrifugation and differential adhesion. Subsequently, the EC were applied to the outer surface of Millicell® inserts. The SC were cultivated separately for 2 days before they were seeded onto the inner surface of the same insert. The culture medium used was comprised of a DMEM and Ham‘s F-12 basis as well as 2.5 % foetal calf serum and different additives. Starting on day 4 of cultivation the standardised medium was supplemented with different concentrations and combinations of E2 and P4. Throughout the study the cultures were kept in a humidified atmosphere of 37°C and a 5 % partial pressure of carbon dioxide. Once the cocultures formed continuous cell layers, as determined via a polarisation microscope (“apparent confluency”), the membranes were fixed in formalin and routinely processed for light microscopical evaluation. The initial tissue samples predominantly showed a secretory functional morphology (n = 6), while single specimens were obtained during the transition from the secretory to the prolifera-tive phase (n = 1) or vice versa (n = 1). One endometrial sample exhibited an irregular proli-ferative differentiation. In the course of cocultivation the EC formed 4 and the SC 3 different cellular morphologies within the section plane. EC with a round-oval to polygonal cell form (type 1) were rarely to occasionally encountered, while spindle-shaped EC (type 2) were occasionally to frequently seen and EC with a cuboidal morphology (type 3) as well as such cells growing in stratified layers (type M) were only infrequently detected. The SC only rarely showed a round-oval to polygonal cell form (type 1) or areas of a stratified cell growth (type M), whereas spindle-shaped SC (type 2) were observed very often. A correlation of the endometrial functional morphology at the time of cell isolation or the hormonal supplementation and the frequency distribution of the cell types as well as the growth rate of the cultivated cells was not evident. The EC always expressed Cytokeratin 19, while on the side of the SC only up to 5 % of the cells in areas of stratified cell growth exhibited this filament. Solely in individual cocultures from secretory differentiated endometrial tissue the steroid hormone receptors could be de-tected. Uteroglobin was expressed in vitro in EC with a variable frequency. An overall corre-lation of the hormonal supplementation and the Uteroglobin expression could not be derived. However, under low hormone doses (only E2 or only P4 supplement) Uteroglobin was detect-ed in EC in areas of single-layered cell growth more often (median value). With an increase in hormone concentration the amount of immunopositive cells (types 1, 2 and 3) diminished noticeably. In SC the protein could only rarely be seen and exclusively in cells from endome-tria with a secretory functional morphology. In vitro CalbindinD9k was predominantly detected intracytoplasmatically, while single cells showed an additional intranuclear expression. Alto-gether, CalbindinD9k could always be observed in a few type-1-EC, rarely in type-2-EC and with a variable frequency in small to moderate numbers of type-3- and type-M-EC. In SC the protein was exclusively expressed in a small (endometrial samples form the oestrous phase) to moderate (endometrial tissue from the interoestrous phase) number of type-2-SC and a few type-M-SC. Generally, no distinct influence of the endometrial functional morphology at the time of tissue sampling and/or of the hormonal supplementation in vitro on the immuno-cytochemical characteristics of the cocultured cells could be observed. In summary, a coculture system of primary equine endometrial epithelial and stromal cells was successfully established and characterised. Despite of the partly absent congruence to the in situ conditions/prerequisites, the present study offers a basic approach and scaffold for further investigations, particularly regarding the ascertainment of intercellular dependencies or the mediation and effectiveness of hormonal influences on the cellular level.

Diese Arbeit verdeutlicht die Wirkung von Chondroitinsulfat auf die Synthese von Prostaglandin E2 in humanen mesenchymalen Stromazellen in Abhängigkeit ihres Sulfatierungsgrades. MSC zeichnen sich durch ihre antiinflammatorischen Eigenschaften aus und haben damit einen modulierenden Effekt auf Wundheilungsprozesse. Als Vorläuferzellen von Osteoblasten sind sie direkt an der Knochenneubildung beteiligt. Eine persistierende Entzündung hat eine kontinuierliche Freisetzung von Zytokinen, wie IL-1 zur Folge. Es konnte gezeigt werden, dass IL-1 in hMSC zu einer Freisetzung von PGE2 führt. Unter kurzzeitiger Wirkung stimuliert PGE2 die Knochenneubildung. Eine langanhaltende Präsenz leitet dagegen die Bildung des Faktors RANKL, einen die Osteoklastogenese stimulierenden Faktor, ein. Seit langem ist der positive Effekt von Chondroitinsulfat in chronischen Entzündungsprozessen, wie Rheumatoider Arthritis, bekannt. Zudem werden sie in aktuellen Studien als Beschichtungsbestandteile von Knochenimplantaten verwendet. Sie führten hier zu einer besseren Bioinduktivität und Biokonduktivität. Bisher ist dennoch der molekulare Wirkmechanismus nicht genau beschrieben. Die Schwierigkeit besteht darin, dass die molekularen Signalkaskaden für die einzelnen Kulturmoldelle Unterschiede aufweisen und kein ubiquitärer Mechanismus dargestellt wird. In hMSC führte die Stimulation mit IL-1 unter vorheriger Zugabe von Chondroitinsulfat zu einer Reduktion der PGE2 Freisetzung. Der Effekt des hochsulfatierten sCS3 war gegenüber dem nativen C4S verstärkt. Die reduzierende Wirkung von C4S setzte verzögert ein. Es ist bereits bekannt, dass die negative Ladung der CS zu einer Bindung von Zytokinen führt. Dadurch wird eventuell die Konzentration der Zytokine, wie IL-1 im Bereich der Zellrezeptoren erniedrigt und führt zu einer verringerten Stimulation der Zelle. Denkbar ist auch die Beeinflussung der intrazellulären Signaltransduktionskaskade durch die Bindung der CS an einen speziellen, bisher unbekannten, Membranrezeptor. Die entscheidenden Enzyme der PGE2 Synthese sind die Cyclooxygenase-2 (Cox-2) und die mikrosomale Prostaglandin E Synthase 1 (mPGES1). Die mRNA beider Enzyme war unabhängig vom Sulfatierungsgrad der CS reduziert. Dieser Effekt konnte auf Protein-ebene nicht belegt werden. Die produzierte Proteinmenge an mPGES1 wird durch IL-1 induziert, bleibt aber auch durch Zugabe von CS unverändert. Somit kann von einer erhöhten Translationseffizient und mRNA Stabilität der mPGES1 RNA ausgegangen werden. MAPK Kinasen sind entscheidende Schnittstellen bei der Regulation der mRNA Stabilität als auch der Aktivität von Transkriptionsfaktoren. In dieser Studie konnte die MAPK p38 als entscheidendes Enzym bei der Wirkung von CS auf die PGE2 Synthese ermittelt werden. Dabei führten sowohl das natürliche C4S als auch das hochsulfatierte sCS3 zu einer verringerten Aktivierung. Der Transkriptionsfaktor NfkB ist einer von mehreren, die an den Promotorbereichen der beiden induzierbaren PGE2 Enzyme, Cox-2 und mPGES1, binden. Es ist anzunehmen, dass die hier aufgezeigte verringerte Aktivität von NfkB als auch die verhinderte Translokation in den Zellkern eine reduzierte Transkription der jeweiligen mRNA bedingten. Abhängig vom untersuchten Modell und den verwendeten Kulturbedingungen können diese Prozesse moduliert sein. Die Erkenntnisse dieser experimentellen Arbeit liefern einen weiteren wichtigen Baustein zum Verständnis der molekularbiologischen Abläufe während entzündlicher Prozesse. Die Verwendung von Chondroitinsulfat, insbesondere hochsulfatiertes CS, in Kombination mit hMSC kann gezielt zu einer Verringerung der Entzündungsreaktion während der Implantateinheilung führen. Die durch PGE2 hervorgerufenen Symptome, wie erhöhte Gefäßpermeabilität, Schwellung und verstärktes Schmerzempfinden begründen diese positiven Effekte.

Background: Since its emergence in December 2019, SARS-CoV-2, the coronavirus responsible for COVID-19, has spread across the globe, infected millions of people and caused several million deaths. One promising intervention to combat the ongoing COVID-19 pandemic is mesenchymal stem/stromal cells (MSCs). Many trials were registered at the onset of the pandemic to determine the safety and efficacy of MSCs in COVID-19 patients. However, currently published studies are underpowered to provide an estimate of safety and efficacy on their own. Thus, a living systematic review (SR) is needed to establish the benefits and drawbacks of MSCs for COVID-19 on a relevant timescale. Methods: Systematic literature searches were conducted on Feb 3rd, 2021 and November 15th, 2021 to identify all English-language, full-text, clinical studies examining MSCs to treat COVID-19. (PROSPERO:CRD42021225431). Findings/Conclusions: Our first search identified nine studies (4 controlled) examining the use of MSC derived products to treat COVID-19 patients. This first iteration of our SR revealed that MSCs were safe and reduced mortality in patients suffering from COVID-19. However, risk of bias (RoB) and poor adherence to ISCT cell product characterization guidelines limited the strength of our conclusions. In the second iteration of our living SR, we only included controlled studies to strengthen our conclusions. We identified eleven controlled studies (5 RCTs). MSCs continued to demonstrate safety and efficacy at reducing mortality at study endpoint (RR: 0.50 [0.34 to 0.75, 95% CI, p=0.0006, I2=0%]). However, we continued to encounter barriers which prevented us from drawing more definitive conclusions. A master protocol appears necessary to facilitate the accelerated accumulation of high-quality evidence where standardized outcome reporting and consistent product characterization allow for a more definitive and timely estimate regarding the safety and efficacy of this cell-based therapy for COVID-19.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die morphologische und funktionelle Charakterisierung endometrialer Epithel- (EEZ) und Stromazellen (ESZ) des Pferdes bei separater Primärkultur auf permeablen Kunststoffoberflächen mit Hilfe (immun-)zytologischer, zytochemischer und transmissionselektronenmikroskopischer Untersuchungen, ein-schließlich einer vergleichenden Betrachtung der immunhistologischen und histochemischen Eigenschaften der Epithel- und Stromazellen in situ. Mögliche Zusammenhänge zwischen der endometrialen Funktionsmorphologie zum Zeitpunkt der Zellisolierung und den Zelleigenschaften in vitro sollten überprüft werden. Zur Zellgewinnung dienten transzervikal entnommene Endometriumbioptate (n = 14) sowie vollständige Uteri euthanasierter Stuten (n = 6). Parallel entnommene Gewebeproben wurden fixiert und als In-situ-Vergleichsmaterial verwendet. Nach einer mechanischen und enzymatischen Gewebedissoziation erfolgte die Trennung von Epithel- und Stromazellen mittels Filtration, Dichtegradientenzentrifugation sowie Differenzialadhärenz. Ein Teil der aufgereinigten Zellen wurde Formalin-fixiert und für (immun-)zytologische und zytochemische Untersuchungen, insbesondere hinsichtlich des Separationserfolges, aufbereitet. Die Kultivierung der übrigen Zellen beider Zellarten fand separat voneinander auf unbeschichteten Membraneinsätzen (Millicell® PET) in einem Gemisch aus DMEM und Ham’s F-12 unter Zusatz von 10 % fötalem Kälberserum (ESZ bis ca. 60 % Konfluenz) bzw. unter Zusatz von 2,5 % fötalem Kälberserum sowie verschiedener Additive (ESZ ab ca. 60 % Konfluenz sowie EEZ) bei 37 °C in wasserdampfgesättigter, mit 5 % CO2 angereicherter Raumluft statt. Konfluente Kulturen wurden in Formalin bzw. Glutaraldehyd fixiert und für die Lichtmikroskopie respektive Transmissionselektronenmikroskopie aufgearbeitet. Zum Zeitpunkt der Zellisolierung befanden sich die Endometrien überwiegend in der Phase der physiologischen Inaktivität (n = 5) oder der regulären zyklischen sekretorischen (n = 8) bzw. proliferativen (n = 3) Aktivität. In jeweils einer der Gewebeproben war eine irreguläre sekretorische, eine irreguläre proliferative bzw. eine im Übergang zwischen Sekretion und Proliferation anzusiedelnde Funktionsmorphologie festzustellen. In einem weiteren Fall wurden die Zellen aus einem graviden Uterus isoliert. Die Separation von ESZ während des Winteranöstrus verlief mit unzureichendem Erfolg, die Kulturen zeigten eine starke Kontamination mit epithelialen Zellen. Die morphologischen, immunzytologischen und zytochemischen Eigenschaften der beiden separierten Zellpopulationen unmittelbar vor Beginn der Kultivierung ermöglichten keine eindeutige Unterscheidung zwischen Epithel- und Stromazellen. Bei den aus sekretorisch differenzierten Endometrien isolierten ESZ war die Zeitdauer bis zum Erreichen der Konfluenz tendenziell länger als bei Verwendung proliferativ differenzierter Endometrien, während bei den EEZ diesbezüglich keine deutlichen Unterschiede erkennbar waren. Zum Zeitpunkt der Konfluenz konnten anhand der lichtmikroskopischen Morphologie 4 verschiedene EEZ- und 3 verschiedene ESZ-Typen nachgewiesen werden. Ultrastrukturell war eine Unterscheidung der EEZ von den ESZ möglich, innerhalb dieser beiden Zellpopulationen besaßen die lichtmikroskopisch verschiedenen Zelltypen jedoch jeweils vergleichbare Eigenschaften. Ein Zusammenhang zwischen der In-vitro-Morphologie und dem Zyklusstand zum Zeitpunkt der Zellisolierung war nicht zu erkennen. Unabhängig von der lichtmikroskopischen Morphologie wiesen die EEZ in der Regel laterale Zellverbindungen in Form von tight junctions auf, was auf einen polarisierten Phänotyp schließen lässt. Der Nachweis von Proteoglykanen mittels Alzianblau-Färbung verlief in allen kultivierten Zellen mit negativem Ergebnis. Mit Hilfe der PAS-Reaktion waren in der Mehrzahl der EEZ sowie in zahlreichen ESZ in vitro Polysaccharide/Glykoproteine nachweisbar. Die kultivierten EEZ exprimierten stets Zytokeratin 19 und in keinem Falle Desmin; in einem Teil der Zellen konnten die Zytokeratine 8 und 18, Vimentin sowie α-Glattmuskel-Aktin nachgewiesen werden. Demgegenüber enthielten die ESZ keines der untersuchten Zytokeratine, zum Teil trat in diesen Zellen jedoch eine Expression von Vimentin, Desmin und α-Glattmuskel-Aktin auf. Insgesamt war ein eindeutiger Nachweis des zellulären Ursprungs equiner endometrialer Epithel- und Stromazellen in vitro ausschließlich anhand der Zytokeratin-19-Expression möglich. Die Eigenschaften der kultivierten EEZ wichen bei der Zellisolierung aus physiologisch inaktiven Endometrien hinsichtlich der PAS-Reaktion sowie des Nachweises von Zytokeratin 8 und Vimentin von denen der aus den aktiven Endometrien gewonnenen Zellen ab. Darüber hinaus wurden keine deutlichen Einflüsse der endometrialen Funktionsmorphologie zum Zeitpunkt der Zellisolierung auf die zytochemischen und immunzytologischen Charakteristika der kultivierten Zellen offensichtlich. Auf der Grundlage dieser Arbeit können weiterführende Untersuchungen im Zellkulturmodell des equinen Endometriums erfolgen, insbesondere hinsichtlich von Veränderungen der Zelleigenschaften bei Einwirken definierter Milieufaktoren.

Mesenchymale Stromazellen (MSCs) werden beim Pferd bereits mit vielversprechenden Ergebnissen zur Behandlung von muskuloskelettalen Erkrankungen, insbesondere von Sehnenerkrankungen, eingesetzt. In bisherigen klinischen Studien lag das Hauptaugenmerk auf der Behandlung von Erkrankungen der Oberflächlichen Beugesehne bei Rennpferden, die jedoch in Deutschland nur einen verhältnismäßig kleinen Anteil des Patientenaufkommens darstellen. Die zu erwartenden Ergebnisse nach MSC-Behandlung von Fesselträgererkrankungen sind dagegen noch nicht bekannt. Darüber hinaus sind die grundlegenden Kenntnisse zur Biologie equiner MSCs noch unzureichend, was Verständnis und Optimierung des bestehenden Therapiekonzeptes erschwert. Häufig wird die Verwendung alternativer Gewebequellen für MSCs diskutiert, wobei jedoch nur wenige vergleichende Daten zu den jeweiligen zellulären Eigenschaften vorliegen. Ziel dieser Arbeit war es daher, zum einen mehr Kenntnisse über die zu erwartenden klinischen Ergebnisse nach MSC-Behandlung von Sehnenerkrankungen zu erlangen, einschließlich Erkrankungen des Fesselträgers, zum anderen den Wissensstand hinsichtlich der in-vitro-Charakterisierung equiner MSCs zu erweitern, wobei ein Vergleich klinisch relevanter Charakteristika zwischen MSCs aus verschiedenen Gewebequellen angestrebt wurde. In die klinische Studie wurden 98 Pferde, die aufgrund von Sehnen- und Banderkrankungen mit MSCs behandelt worden waren, einbezogen. Von 58 dieser Tiere konnten Langzeitergebnisse nach einem Beobachtungszeitraum von mindestens einem Jahr erhoben werden. Diese wurden hinsichtlich des Behandlungserfolges sowie möglicher Einflussfaktoren ausgewertet, wobei die Behandlung als erfolgreich bewertet wurde, wenn die Patienten nach dem Beobachtungszeitraum voll trainiert oder im Sport eingesetzt werden konnten und dabei kein Rezidiv aufgetreten war. Die Behandlung mit MSCs wurde bei 84,5 % der Pferde als erfolgreich eingestuft, wobei Erkrankungen der Oberflächlichen Beugesehne mit 84,2 % und Erkrankungen des Fesselträgers mit 83,3 % gleichermaßen gute Ergebnisse zeigten. Tendenziell beeinflussten Nutzungsdisziplin, Erkrankungsstadium und Patientenalter das klinische Ergebnis ebenso wie bei konventioneller Behandlung. Insgesamt war nach MSC-Behandlung das Auftreten von Rezidiven deutlich seltener zu beobachten als in der Literatur für die konventionelle Behandlung beschrieben wird. Für die in-vitro-Studie zur vergleichenden Charakterisierung equiner MSCs aus verschiedenen Quellen wurden Knochenmark, Fett- und Sehnengewebe sowie Nabelschnurblut und -gewebe gewonnen. Aus diesen Proben wurden jeweils die plastikadhärenten MSCs isoliert und hinsichtlich Zellausbeute, Proliferations- und Migrationseigenschaften, tripotentem Differenzierungspotential sowie der Expression der Sehnenmarker Kollagen 1A2 und Skleraxis vergleichend untersucht. Die Ausbeute an MSCs war bei allen soliden Geweben (Fett-, Sehnen-, und Nabelschnurgewebe) hochsignifikant höher (p < 0,001). Ebenso proliferierten MSCs aus Fett- und Sehnengewebe signifi-kant schneller als MSCs aus Knochenmark oder Nabelschnurblut (p < 0,01). Von letzteren wurden darüber hinaus etwa drei viertel aller Zellkulturen vor der achten Passage seneszent. Das höchste Migrationspotential zeigten wiederum MSCs aus Sehnen- und Fettgewebe, wobei hier MSCs aus Nabelschnurgewebe das ungünstigste Ergebnis erzielten (p < 0,01). Die adipogene Differenzierung gelang bei MSCs aus allen Quellen vergleichbar gut. Bei der osteogenen Differenzierung erreichten MSCs aus Knochenmark das beste Ergebnis, während MSCs aus Nabelschnurblut und –gewebe nur schwach osteogen differenzierten (Tag 21: p < 0,01; Tag 35: p < 0,05). Im Gegensatz dazu erreichten MSCs aus Nabelschnurblut bei der chondrogenen Differenzierung die meisten Scorepunkte, MSCs aus Knochenmark dagegen die wenigsten (p < 0,05). Kollagen 1A2 wurde von MSCs aus Fettgewebe am höchsten exprimiert, Skleraxis von MSCs aus Nabelschnurblut. MSCs aus Sehnengewebe exprimierten beide Sehnenmarker auf fast ebenso hohem Level. MSCs aus Knochenmark dagegen zeigten hier jeweils die niedrigste Expression (p < 0,05 für Kollagen 1A2). Basierend auf den Ergebnissen der klinischen Studie ist die MSC-Therapie nach wie vor als vielversprechende Behandlungsoption für Sehnenerkrankungen anzusehen und ist auch für die Behandlung von Fesselträgererkrankungen geeignet. Zukünftige, kontrollierte klinische Studien müssen jedoch die Wirksamkeit der MSC-Therapie noch weitergehend bestätigen. Die in-vitro-Studie zeigte signifikante Unterschiede zwischen equinen MSCs aus verschiedenen Quellen auf, die bei der Auswahl einer Gewebequelle für die MSC-Isolierung für klinische Anwendungen berücksichtigt werden sollten. MSCs aus Fettgewebe erscheinen aufgrund ihrer sehr guten Proliferations- und zuverlässigen Differenzierungseigenschaften als eine gute Alternative zu MSCs aus Knochenmark für autologe Therapien. MSCs aus Sehnengewebe sind den hier vorliegenden Ergebnissen zufolge besonders gut für die Behandlung von Sehnenerkrankungen geeignet; vor einer routinemäßigen Anwendung dieser MSCs sollten jedoch ihre Eigenschaften weiterführend untersucht werden. / In horses, mesenchymal stromal cells (MSCs) are used for the treatment of musculoskeletal diseases, especially tendon injuries, with promising results. Previous clinical studies mainly focused on the treatment of superficial digital flexor tendon injuries in racehorses, which, however, represent only a relatively small percentage of the overall equine case load in Germany. Average outcome to be expected following MSC treatment of suspensory ligament injuries was not yet determined. Moreover, basic knowledge on equine MSC biology is still deficient, hampering the understanding and thus the optimisation of the existing treatment regime. The use of alternative MSC sources is frequently discussed, yet to date, only few data comparing the cellular properties of equine MSCs from different sources have been published. The aim of this study was, on the one hand, to gain more knowledge concerning the expected outcome after MSC treatment of tendon injuries, including injuries to the suspensory ligament. On the other hand, it was aimed at expanding the knowledge on equine MSC characterisation in vitro, thereby focusing on the comparison of clinically relevant properties of MSCs derived from different sources. In the clinical study, 98 horses were included, all of which had received MSC treatment for tendon or ligament injuries. In 58 of these horses, long term results after a follow-up period of at least one year could be collected. These data were analysed with respect to treatment outcome and potential influencing factors. Treatment was considered successful when horses were back to full training or competition after the follow-up period, without having suffered a re-injury. The overall success rate was 84.5 %. Success rates in horses suffering from superficial digital flexor tendon injuries and in horses suffering from suspensory ligament injuries were comparably good (84.2 % and 83.3 %, respectively). Similar to conventional therapies, the sports discipline in which the horses performed, age and disease stage tended to influence the outcome. Overall, re-injury rates after MSC treatment were considerably lower than those described in the literature following conventional treatment. For the comparative characterisation of MSCs from different sources in vitro, samples of bone marrow, adipose and tendon tissue, as well as umbilical cord blood and –tissue were collected. Plastic-adherent MSCs were isolated out of these samples and comparatively characterised focusing on cell yields, proliferation and migration properties, trilineage differentiation potential and the expression of the tendon markers collagen 1A2 and scleraxis. MSC yields were significantly higher in all solid tissues (adipose, tendon and umbilical cord tissue) (p < 0.001). Further, MSCs from adipose and tendon tissue proliferated significantly faster than MSCs from bone marrow or umbilical cord blood (p < 0.01). Moreover, approximately three quarters of the samples derived from the latter sources underwent senescence before reaching passage eight. The highest migration potential was found in MSCs derived from tendon and adipose tissue again, while MSCs from umbilical cord tissue showed the least (p < 0.01). The adipogenic differentiation potential was comparably good in MSCs from all different sources. The osteogenic differentiation was most distinct in MSCs from bone marrow, while MSCs from umbilical cord blood and tissue showed only weak evidence of differentiation (day 21: p < 0.01; day 35: p < 0.05). In contrast, following chondrogenic differentiation, MSCs from umbilical cord blood scored highest and MSCs from bone marrow scored lowest (p < 0.05). Collagen 1A2 was most highly expressed in MSCs from adipose tissue, highest scleraxis expression levels were found in MSCs from umbilical cord blood. MSCs from tendon tissue, however, expressed both markers at almost evenly high levels. Contrastingly, lowest expression levels of both markers were found in MSCs derived from bone marrow (p < 0.05 for collagen 1A2). Based on the results of the clinical study, MSC therapy can still be considered a very promising treatment option for tendon diseases and is also a suitable treatment for suspensory ligament injuries. In the future, controlled clinical studies will have to further confirm the efficacy of this treatment regime. The in-vitro-study showed significant differences between equine MSCs derived from different sources, which should be considered when choosing a MSC source for clinical applications. For autologous therapies, MSCs derived from adipose tissue appear to be a good alternative to MSCs derived from bone marrow, due to their remarkable proliferation and reliable differentiation capacities. Furthermore, according to this study, MSCs derived from tendon tissue are especially suitable for treating tendon injuries. Prior to routine clinical applicability of these MSCs, however, their properties should be further investigated.

In cancer, aberrant activation of developmental signaling pathways such as the Hippo Pathway has been shown to drive proliferation and invasion of cancer cells. Therefore, understanding the normal function of the Hippo Pathway during embryonic development can provide critical insight into how aberrant activity contributes to tumorigenesis. This dissertation explores the role of the Hippo Pathway members YAP and TAZ in gastrointestinal (GI) development and tumorigenesis. I use mouse genetics to systematically dissect the roles of YAP/TAZ in the endoderm-derived gastrointestinal epithelia and mesoderm-derived gastrointestinal mesenchyme during mammalian development. In the GI epithelium, I demonstrate that YAP/TAZ are dispensable for development and homeostasis. However, YAP/TAZ are required for Wnt pathway-driven tumorigenesis. I find that YAP/TAZ are direct transcriptional targets of Wnt/TCF4 signaling. In the GI mesenchyme, I describe a previously unknown requirement for YAP/TAZ activity during mammalian GI development. YAP/TAZ are involved in normal GI mesenchymal differentiation and function as transcriptional co-repressors in a progenitor cell population. In this way, YAP/TAZ act as molecular gatekeepers prior to Hedgehog-mediated differentiation into smooth muscle cells. This work unveils a previously unknown requirement for Hippo pathway signaling in the mammalian GI tract and a novel mechanism wherein YAP/TAZ function as transcriptional co-repressors to maintain a mesenchymal progenitor cell population.

Dans cette thèse, nous avons combiné les approches des cultures single-cell, de cytométrie en flux,des analyses de métabolisme énergétique et de génétique moléculaire afin d’explorer les effets del’Acétate d’α-Tocopherol (α-TOA) sur les cellules stromales mésenchymateuses (MStroC) et leurs souspopulations fonctionnelles (cellules souches et progénitrices mésenchymateuses). L’autre but était de tester une molécule de miR-210 par rapport à son utilisation potentielle comme « hypoxia mimicking molecule ». Après avoir démontré l’hétérogénéité de la population MStroC et conclu que la population de premier passage est appropriée pour des expérimentations ultérieures, nous avons trouvé que l’α-TOA présentait un effet positif sur le maintien de la capacité proliférative élevée des cellules souches mésenchymateuses. Cet effet est accompagné d’une atténuation de l’activité de la chaîne de transport d’électrons (ETC) qui pourrait d’autre part expliquer l’accroissement modéré du niveau des Reactive Oxygen Species mitochondriales (mtROS) que nous avons détectées. L’augmentation du niveau de mtROS pourrait être associée à une dégradation de protéine HIF-1 dans la population MStroC exposée à l’α-TOA. Bien que nous n’ayons pas détecté d’augmentation compensatoire de la glycolyse, les phénomènes observés représentent en partie la réponse cellulaire complexe au faible niveau d’O2. Il a été établi que ce phénomène était relié au maintien de primitivité des cellules souches. Le mécanisme exact reste à clarifier ainsi que son potentiel translationnel. En outre, nous avons apporté la preuve que miR-210 fait partie intégrante de la réponse des MStroC à la faible concentration en O2. Dans cette étude, nous avons montré que l’augmentation de l’expression de miR-210 sur une période courte (jusqu’à 24 heures) et après une période étendue (jusqu’à 72 heures) d’exposition des MStroC à une faible concentration en O2. De plus, nous avons prouvé que ce micro ARN pouvait être régulé par les deux facteurs transcriptionnels HIF-1 et HIF-2, nous laissant penser que ceci faisait partie intégrante de la réponse des MStroC à une faible concentration en O2. Jusqu’à présent, nos données suggèrent que miR-210 est digne d’intérêt en tant que bonne molécule « hypoxia mimicking ». / In this thesis, we combined approaches of single-cell cultures, flow-cytometry, energetic metabolismanalysis and molecular genetics in order to get insight in the effects of α-Tocopherol-Acetate (α-TOA)on Mesenchymal Stromal Cells (MStroC) and their functional subpopulations (mesenchymal stem and progenitor cells). The other aim was to test a miR-210 molecule with respect to its potential use as hypoxia mimicking molecule. After defining MStroC population heterogeneity and concluding that the first passage population is convenient for further experiments, we demonstrated that α-TOA exhibits a positive effect on the maintenance of high proliferative capacity of mesenchymal stem cells. This effect could be associated with an attenuation of electron transport chain (ETC) activity, which, on the other hand could explain moderate increase in the level of mitochondrial Reactive Oxygen Species (mtROS) we detected. The increase in mtROS level could be associated with a decreased HIF-1 alpha protein degradation in MStroC exposed to α-TOA. Although we did not detect a compensatory increase in glycolysis, the observed phenomena depict part of a complex cellular response to the low O2 that is demonstrated to be related with maintenance of stem cell primitiveness. The exact mechanism remains to be elucidated as well as its translational potential. In addition, we provided new evidences that miR-210 is integral part in MStroC response to low O2. In the study, we showed increased in miR-210 expression in a short-term (up to 24 hours) and after extended (up to 72 hours) MStroC exposed to low O2. Moreover, we demonstrated that this micro- RNA could be regulated by both HIF-1 and HIF-2 transcriptional factors, suggesting it as integral part of MStroC response to low O2. So far, our data suggest that miR-210 is worthy to be considered as good hypoxia mimicking molecule.

Sertoli cells (SCs) are somatic cells of testicular tissue that are involved in spermatogenesis and maturation of germ cells. They are currently being extensively studied for their immunomodulatory abilities, and recent studies have shown that they share some properties with mesenchymal stromal cells (MSCs). Detailed characterization of SCs and clarification of their role in testicular tissue is crucial for potential use of SCs as a therapeutic tool in regenerative medicine. Cell culture of Xenopus tropicalis immature Sertoli cells (XtiSCs) and Mus musculus (mSCs) Sertoli cells were established in the Laboratories of Developmental Biology and Immunoregulations, Faculty of Science, Charles University. Previous research has characterized XtiSCs and demonstrated their multipotent potential by in vitro differentiation into a mesodermal line. Following this research, one of the goals of the diploma project was the induction of in vitro differentiation of XtiSC into other cell types, which would verify the differentiation potential of XtiSCs. The mSC expression profile confirmed the somatic origin of this culture as well as the transcription of Sertoli cell gene markers. Differentiation of mSCs along the mesodermal line into osteoblasts, chondrocytes and adipocytes has been successfully induced in vitro....

Pancreatic transplantation is the only possible treatment to induce independence from exogenous insulin administration in type 1 diabetes mellitus. However, the shortage of donor organs remains the main limitation of pancreas transplantations. The goal of the research is the preparation of a bioartificial organ based on cell therapy. Parts of the extracellular matrix obtained by decellularization of the pancreas are used for its preparation. The protein scaffolds prepared in this way are then repopulated by different cell types again. The extracellular matrix provides structural support to cells, mediates signaling for differentiation, proliferation or migration. Mesenchymal stromal cells are used in clinical therapy, have a positive effect on tissue regeneration processes, modulating the function of the extracellular matrix, suppress inflammation and promote angiogenesis. After pancreas decellularization, we repopulated the extracellular matrix with islets, mesenchymal cells and endothelial cells. Then, the pancreas was transplanted subcutaneously into syngeneic diabetic rats to observe islet revascularization. Based on sections of explanted scaffolds, we found out that revascularization of the islets was higher without the endothelial cells in the transplanted extracellular matrix. Key words:...

En raison de leur multipotence considérable, les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ont été énormément utilisées en clinique dans le contexte de la médecine régénérative. Pourtant, la stimulation des CSM avec de faibles concentrations d'interféron-gamma (IFN-gamma) déclenche une augmentation du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I et II, et surtout une capacité de novo de présentation croisée des antigènes. Ainsi, malgré leurs propriétés immunosuppressives naturelles, les CSM peuvent être modulées pour devenir pro-inflammatoires. Comme le dérivé pyrimidoindole UM171 induit l’augmentation de l’expression de plusieurs gènes impliqués dans la présentation antigénique dans les cellules souches hématopoïétiques humaines, nous avons étudié son potentiel pour le déclenchement de la présentation antigénique par les CSM. L'analyse par cytométrie en flux a montré une élévation des niveaux de H2-kB après le traitement avec le médicament, en corrélation avec une augmentation de la présentation de l'antigène, démontrée par une activation plus importante de la lignée de cellules T B3Z spécifique au peptide SIINFEKL. Cette présentation croisée de novo d'un peptide immunogène ne résulte pas d'une augmentation de l'absorption ou de la digestion enzymatiques des protéines, mais plutôt de l'expression du gène Psmb8 induit par le médicament. Comme le traitement avec plusieurs antioxydants et inhibiteurs des complexes de la chaîne de transport des électrons a réduit de manière significative les effets observés, nous concluons que la présentation croisée médiée par UM171 est dépendante des ROS. Dans le contexte de la vaccination thérapeutique, l'immunisation avec des CSM traitées par UM171 chez des souris présentant des tumeurs EG.7 préétablies a permis d'obtenir un taux de survie de 40%. Dans l'ensemble, notre étude révèle une nouvelle approche pharmacologique pour modifier les CSM afin qu'elles deviennent des cellules présentatrices d'antigènes, ce qui permet de développer de nouveaux vaccins anticancéreux innovants et puissants. / Due to their considerable multipotency, mesenchymal stromal cells (MSCs) have been tremendously employed in the clinic for regenerative medicine. Yet, stimulation of MSCs with low concentrations of interferon-gamma (IFN-gamma) triggers an increase in the major histocompatibility complex I and II, and most importantly, a de novo antigen cross-presentation capacity. Thus, despite their natural immunosuppressive properties, MSCs can be modulated to become pro-inflammatory. As the pyrimidoindole derivative UM171 induces the upregulation of several antigen presentation-involved genes in human hematopoietic stem cells, we investigated its potential for inducing antigen presentation by MSCs. Flow cytometry analysis showed an upregulation in H2-kB levels after treatment with the drug, correlating with an increase in antigen presentation indicated by higher activation of the SIINFEKL-specific B3Z T cell line. This de novo cross-presentation of an immunogenic peptide did not result from an increase in protein uptake or processing, but rather stemmed from the drug-induced expression of the Psmb8 gene. As treatment with multiple antioxidants and inhibitors of the electron transport chain complexes significantly reduced the observed effects, we conclude that UM171-mediated cross-presentation is ROS-dependent. In the context of therapeutic vaccination, immunization with UM171-treated MSCs in mice with pre-established EG.7 tumors resulted in 40% survival. Overall, our study reveals a new pharmacological approach in modifying MSCs to become antigen presenting cells, hence allowing the development of future innovative and potent anti-tumoral vaccines.