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Les travaux présentés dans cette thèse de doctorat portent sur létude de la distribution cellulaire dynamique des facteurs essentiels dépissage de la famille SR dArabidopsis thaliana. Le processus dexcision/épissage du pré-mRNA consiste en la reconnaissance précise des introns au niveau des sites dépissage, en leur excision et en la ligature des exons. Les facteurs d'épissage SR possèdent un domaine particulier riche en dipeptides sérines et arginines répétés et également un ou deux domaines hautement conservés de liaison au RNA. Ils sont impliqués dans la reconnaissance et le choix des sites dépissage ainsi que dans lassemblage du spliceosome. Au cours de cette thèse de doctorat, nous avons montré la distribution subcellulaire dynamique des protéines SR d'Arabidopsis (RSp31, RSZp22, RSp34 et RSZ33) fusionnée à la GFP, et ce dans divers systèmes expérimentaux (cellules foliaires de tabac et dArabidopsis, cellules BY-2). Celles-ci se localisent au sein du noyau et se concentrent en certains sites nucléaires précis dénommés speckles. Nous avons aussi observé que lune dentre-elles, RSZp22, peut se localiser au sein du nucléole suivant les conditions cellulaires, ce qui suggérait un rôle possible de cette protéine dans le transport du mRNA. Nous avons étudié le rôle des différents domaines structuraux des protéines SR dans leur distribution cellulaire en réalisant des délétions partielles des protéines RSp31 et RSZp22 et en analysant la localisation des protéines mutantes. Par co-expression de différents couples de protéines SR fusionnées à deux variantes de protéines fluorescentes (la GFP et la mRFP1 ou monomeric Red Fluorescent Protein 1), nous avons également montré une co-localisation générale des protéines SR végétales, à lexception de RSZp22 qui est la seule à présenter cette localisation nucléolaire. Nous avons aussi analysé la redistribution des protéines SR après traitement par divers inhibiteurs de la phosphorylation et déphosphorylation et également de la transcription. Aussi, l'utilisation de diverses méthodes de microscopie confocale (comme le FRAP ou Fluorescence Recovery After Photobleaching ou encore le FLIP ou Fluorescence Loss In Photobleaching) nous a permis de montrer que les protéines SR dArabidopsis sont hautement dynamiques au sein du noyau. Enfin, nous avons observé grâce à la technique du FLIP que RSZp22 est capable de faire la navette entre le noyau et le cytoplasme et que ce transport nucléo-cytoplasmique dépend de la voie dexportation via le récepteur CRM1/exportine1 [1-3]. 1. Docquier, S., et al., Nuclear bodies and compartmentalization of pre-mRNA splicing factors in higher plants. Chromosoma, 2004. 112(5): p. 255-66. 2. Tillemans, V., et al., Functional distribution and dynamics of Arabidopsis SR splicing factors in living plant cells. Plant J, 2005. 41(4): p. 567-82. 3. Tillemans, V., et al., Insights into Nuclear Organization in Plants as Revealed by the Dynamic Distribution of Arabidopsis SR Splicing Factors. Plant Cell, 2006. 18(11): p. 3218-34.

The barley scald pathogen (Rhynchosporium secalis) causes extensive economic losses, not only through lost product and quality, but also due to costs associated with chemical control. Economic and environmental impacts and the emerging resistance to fungicides and dominant resistance genes are reasons to understand molecular defence responses in order to develop new strategies to increase resistance of barley to this pathogen. In most pathosystems, defence gene expression in susceptible or resistant genotypes commonly differs quantitatively. Thus, differentially expressed genes between genotypes contrasting for response to infection by pathogens are considered candidate genes that have a role in resistance. This thesis presents functional analysis of a subset of genes isolated from a Suppression Subtractive Hybridisation library. The library was previously established and enriched for differentially expressed genes in epidermis of resistant and susceptible near-isogenic barley cultivars inoculated with R. secalis. Functional characterisation involved both investigating their putitative biochemical function as well as the genes‟ role(s) in biotic and abiotic stress responses. Three cDNA clones from the library were selected based on the putative function of the encoded proteins and the full length of the clones and their homologues were isolated from cDNA and genomic DNA. One of the clones represented a member of the pathogenesis-related protein family 17 (PR-17). Southern hybridisation showed that a small multigene family encodes the barley PR-17 proteins. Three members were cloned with two of them being novel. The second clone was homologous to galactinol synthases (GolS) and Southern blot analysis indicated existence of two GolS genes in the barley genome and subsequently two HvGolS members were isolated. The last clone (a single gene) showed similarity to very long chain fatty acid elongases, which indicates its involvement in synthesis of cuticular waxes. A characterised Arabidopsis mutant named fiddlehead (Atfdh) was highly similar to this gene and it was named HvFdh. Detailed expression analysis using Q-PCR, Northern blot analysis and publically available microarray data revealed that the isolated genes are regulated in response to a variety of abiotic and biotic stresses as well as different tissues during barley development. Under some treatments expression patterns were consistent with their putative roles and in agreement with results of other studies. Nevertheless, in other treatments expression profiles were not in agreement with previous findings in other plants indicating potentially different stress adaptation mechanisms between species. Further insight into the function of the encoded proteins was gained by their subcellular localisation using transient expression as GFP fusion proteins followed by confocal laser scanning microscopy. The results were in agreement with in silico predictions and their putative cellular function. In addition, a comprehensive list of homologous genes from other species was compiled for each gene by using public EST databases. Analyses of phylogenetic relationship and multiple sequence alignment of the homologues provided further clues to their function and conserved regions of the proteins. HvPR-17 anti-fungal properties were investigated by heterologous protein expression in E. coli and subsequent in vitro bioassays using purified protein under different conditions against a number of phytopathogenic fungi. However, no anti-fungal activity was observed. A construct with the AtFdh promoter driving the coding region of barley Fiddlehead was used for complementation of the Arabidopsis fiddlehead mutant to investigate functional orthology between these genes from dicots and monocots. The Arabidopsis fiddlehead mutant phenotype that shows contact-mediated organ fusion, germination of spore on epidermis and reduced number of trichomes was completely reverted by HvFdh. Finally, more than fifty transgenic barley lines were regenerated over-expressing or suppressing one of the three genes. The analyses of the transgenic progeny exhibited some interesting developmental phenotypes and resistance to scald and drought tolerance. These lines are awaiting further experiments to investigate the effect of altered expression in conferring resistance to other pathogens and abiotic stress tolerance as well as biochemical analysis. Collectively, in this work six barley genes were cloned and characterised by a variety of in silico techniques, temporal and transient expression analyses, subcellular localisation, in vitro bioassays and mutant complementation in Arabidopsis and loss- and gain-of-function transgenic barley plants. This work has provided insight into the function of these gene families in barley. Furthermore, the data suggest that they are regulated by the defence response to pathogenic fungi as well as drought, salinity and frost in barley. / http://proxy.library.adelaide.edu.au/login?url= http://library.adelaide.edu.au/cgi-bin/Pwebrecon.cgi?BBID=1375755 / Thesis (Ph.D.) - University of Adelaide, School of Agriculture, Food and Wine, 2009

This thesis explores localisations and roles of three auxiliary protein factors involved in the biogenesis of Photosystem II (PSII) in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 and contributes to subcellular localisation of the initial steps of PSII biogenesis and repair-related D1 synthesis. The main results consist in i) identification of a functional interaction of the protein factor Psb27 with a lumenal domain of the Photosystem II subunit CP43, ii) discovery of a novel pigment binding complex formed by the Ycf39 protein and high-light-inducible proteins implicated in photoprotection and delivery of recycled chlorophyll to newly synthesized D1 protein during the PSII reaction centre formation, iii) providing evidence that the early steps of PSII assembly and the repair-related D1 synthesis occur in the thylakoid membrane of Synechocystis, and iv) revealing that the cyanobacterial PsbP orthologue, CyanoP, assists in the early phase of PSII biogenesis as an assembly factor facilitating the association of D2 and D1 assembly modules.

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Type I PIP kinases (phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinases, PIP5Ks) catalyse the majority of cellular synthesis of PI(4,5)P2. To date, three mammalian isoforms (r1, r2, r3) have been found. PIP5KIr is subject to complex C-terminal splice variation, enhancing its transcriptional diversity through evolution and producing at least 5 known spliceoforms in the mammals. This study addresses several important questions. (1) Several remarkable differences have been discovered between the neuronal splice variant PIP5KIr_i3 and its close variant, Ir_i2, whose peptide lacks a 26-AA insert near its C-terminus. This study attempts to map these behavioural differences onto motifs within the peptide insert. Furthermore, a site of point mutation is identified near the activation loop, which amplifies the above differences. (2) This study documents properties of the more recently discovered PIP5KIr_i3, about which relatively little is known, for example, the regulation of its subcellular localisation, kinase activity and post-translational modifications. By site-directed mutagenesis and examining more closely several crucial motifs, insight is gained into the putative relationship between the enzyme’s phosphorylation state, cellular localisation, lipid kinase activity and autophosphorylation. (3) The discovery of a new PIP5KIr splice variant, Ir_v6, is described. First discovered in rodents, PIP5KIr_i6 encompasses the 26-AA insert of Ir_i3, but lacks the common C-terminus of Ir_i2 and Ir_i3 which contains peptide motifs that have several roles in vivo. A polyclonal antibody against the C-terminus of Ir_i6 was also developed. Preliminary characterisation of Ir_i6 demonstrates a similar subcellular localisation, but a wider expression profile than its close relative, Ir_i3, suggesting potentially differential functions across tissues and at various developmental stages. (4) The existence of Ir_v3 and Ir_v6 is also confirmed in humans. In light of recent findings of other novel human spliceoforms, this is shown to be a case of intra-exonic splicing producing “alternative 5’ splice site” exons in the human. Overall, this thesis should help to better understand the regulation and physiological roles of PIP5KIr and, specifically, its different splice variants.

Die Salicylsäure (SA) ist ein wichtiges Signalmolekül bei der Regulation der pflanzlichen Pathogenabwehr. as-1-ähnliche cis-Elemente in den Promotoren von vielen Abwehrgenen vermitteln SA- und auch Auxin-induzierbare Genexpression. Diese Elemente werden vom ASF-1/SARP-Proteinkomplex erkannt, dessen Hauptkomponenten DNA-Bindeproteine aus der TGA-Familie der pflanzlichen bZIP-Transkriptionsfaktoren sind. In dieser Arbeit wurden Fusionsproteine von TGA2.1, TGA2.2 und TGA1a mit GFP unter der Kontrolle des HBT-Promotors transient in Pflanzenprotoplasten oder stabil in transgenen Pflanzen exprimiert und direkt in lebenden Zellen über Fluoreszenz- und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie visualisiert. Bei den mikroskopischen Analysen konnte die Fluoreszenz der drei TGA-GFP-Fusionsproteine überwiegend im Kern (mit Ausnahme des Nukleolus) beobachtet werden. Allerdings ließen sich biochemisch mit Hilfe eines Antiserums gegen die beiden C Termini der TGA-Faktoren auch geringe Mengen von TGA2.1-GFP und TGA2.2-GFP in cytosolischen Extrakten der entsprechenden transgenen Pflanzen nachweisen. Fusionen der C terminalen Anteile von TGA2.2 und TGA1a an den C Terminus von CHS-GFP wurden bei transienter Expression ebenfalls im Cytosol beobachtet. Es konnte nicht abschließend geklärt werden, ob dass auf das Fehlen der NLS oder auf die Anwesenheit einer NES zurück zu führen ist. Die TGA-GFP-Fusionsproteine konnten das as 1-Element in vitro in Gelretardationsanalysen erkennen und in Form von Homo-oder Heterodimeren daran binden. Die TGA-GFP-Fusionsproteine waren auch in der Lage, die Expression des frühen (immediate-early) GST-Gens Nt103 in Blättern nach Induktion mit Salicylsäure oder Auxin zu beeinflussen. TGA2.1-GFP und TGA2.2-GFP zeigten im allgemeinen einen positiven Effekt auf die Nt103-mRNA-Menge (2-4-facher Anstieg verglichen mit dem Wildtyp), wobei sich der Effekt stärker auf die SA-induzierte Expression auswirkte als auf die 2,4-D-Proben. TGA1a-GFP schien die Expression von Nt103 in Blättern in beiden Fällen leicht negativ oder gar nicht zu beeinflussen. Die Mobilitätsparameter der verschiedenen TGA-GFP-Fusionsproteine im Kern wurden mit Hilfe von FCS, kombiniert mit CLMS, untersucht. Während die Mobilität des Kontrollproteins TetR-GFP, dass keine endogenen Interaktionpartner hat, einheitlich war, schienen Subfraktionen der TGA-GFP Fusionproteine in ihrer Mobilität beeinflusst. Generell konnte zwischen einer mobileren und einer weniger mobilen Fraktion unterschieden werden. Bei manchen Messungen waren die TGA-Faktoren im Kern sogar gänzlich immobil. Die relative Anteil von weniger mobilen, bzw. immobilen und mobilen TGA-faktoren unterschied sich in den unterschiedlichen analysierten Zelltypen (längliche und echte Epidermiszellen, Schießzellen, Trichomzellen). Um einen eindeutigen Effekt von Salizylsäure auf die Mobilität der TGA-Faktoren festzumachen, sind wegen der großen Variabilität weitere Messungen nötig.

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Les dysfonctions placentaires sont fortement associées aux complications de la grossesse et de plus en plus reliées à une augmentation de médiateurs inflammatoires endogènes, appelés alarmines ou motifs moléculaires associés aux dommages (« damage associated molecular patterns » (DAMPs). High-mobility group box 1 (HMGB1), est un DAMP qui a été associé aux grossesses avec PE et accouchement prématuré. HMGB1 est une protéine nucléaire qui peut être sécrétée dans l’espace extracellulaire de façon passive ou active. Une fois dans l’espace extracellulaire, HMGB1 existe sous différents isoformes ayant des actions inflammatoires distinctes. Le rôle de HMGB1 et de ses isoformes à l’interface materno-fœtale est encore peu connu. L’objectif de mes travaux de maitrise était d’investiguer le rôle de HMGB1 à l’interface materno-fœtale, en déterminant sa localisation subcellulaire pendant la syncytialisation, ainsi que les actions pro-inflammatoires sur le placenta. Méthodes : Un modèle d’explants placentaires en conditions physiologiques fut utilisé afin de déterminer et de moduler la localisation subcellulaire de HMGB1. Le même modèle a été traité avec les différentes isoformes de HMGB1 (HMGB1-disulfide: D ou HMGB1-réduit: R) afin de déterminer leurs effets inflammatoires et leurs impacts sur la fonction placentaire. Des placentas de femmes ayant des grossesses sans complications, une prééclampsie (PE) ou une prééclampsie du postpartum (PPPE) ont été étudiés afin de déterminer la distribution de HMGB1 et ses récepteurs (Receptor for advanced glycation end product (RAGE) et Toll like receptor (TLR4)). Résultats : La localisation intracellulaire de HMGB1 est modulée pendant le processus de syncytialisation avec une localisation majoritairement cytoplasmique et extracellulaire par rapport à une localisation généralement nucléaire dans les trophoblastes différenciés. Favoriser l’export nucléaire de HMGB1 avec un inhibiteur d’histone déacétylase (HDAC), le sodium butyrate (NaB) augmente la concentration cytoplasmique de HMGB1 ainsi que la sécrétion de l’hormone chorionique gonadotrope (-hCG), signe de la différentiation des trophoblastes. L’isoforme disulfide de HMGB1 induit la sécrétion de cytokines pro-inflammatoire (IL-1, IL-6 et MCP-1) et a aussi un impact sur la différenciation des trophoblastes, tel qu’observé par une diminution de la sécrétion de -hCG. En conditions pathologiques, l’expression de HMGB1 et ses récepteurs RAGE et TLR4 est augmentée dans des conditions de prééclampsie du post-partum. Pour conclure, la localisation subcellulaire de HMGB1 est modulée pendant la syncytialisation, dans un contexte non-pathologique. L’accumulation cytoplasmique de HMGB1 est la première étape avant la sécrétion dans l’espace extracellulaire. Lorsque dans l’espace extracellulaire, une isoforme spécifique de HMGB1 (HMGB1-D) entraine l’augmentation de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. L’expression de HMGB1 et ses récepteurs est augmentée et conditions pathologiques démontrant que ce DAMP peut jouer différents rôles tant dans un contexte inflammatoire et de dysfonctions placentaires ainsi que dans un contexte de différenciation des trophoblastes. / Sterile inflammation, caused by endogenous damaged-associated-molecular-patterns (DAMP), at the maternal fetal interface is frequently observed in pregnancy complications and leads to placental inflammation and dysfunction by unknown mechanisms. HMGB1 has been associated to preeclampsia, preterm birth and it can be released in the extracellular space and associated to increased inflammatory actions. Extracellular HMGB1 has two isoforms, (HMGB1-disulfide-D) inducing proinflammatory cytokines whilst the other (HMGB1-reduced-R) acts as a chemoattractant. The role of HMGB1 and its isoform at the maternal-fetal interface is mostly unknown. The objective of my master was to investigate the roles of HMGB1 at the maternal-fetal interface including its subcellular localisation during trophoblast differentiation and pro-inflammatory effects on the placenta. Methods: Term placental explants were used to determine the subcellular localisation of HMGB1 during trophoblast differentiation or treated with specific HMGB1 isoforms (HMGB1-D or HMGB1-R) to determine the impact on inflammation and placental function. Alongside, placentas from women with either normal term pregnancies, PE or PPPE were used to determine the distribution of HMGB1 and its receptor. Results: HMGB1 subcellular localisation is modulated during the syncytialisation process with major cytoplasmic and extracellular localisation to a more nuclear localisation in differentiated trophoblasts. Promoting HMGB1 nuclear export, using the histone deacetylase inhibitor (HDAC) NaB, increased HMGB1 cytoplasmic concentration leading to increase secretion of human chorionic gonadotropin (-hCG) in placental explants. HMGB1-D treatment of explants led to the secretion of pro-inflammatory cytokines (IL-1, IL-6 et MCP-1) and impacted trophoblasts differentiation observed by decreased -hCG secretion. In pathological conditions, HMGB1 and his receptors, RAGE and TLR4, expression is increased in PPPE compared to non-pathological pregnancy. To conclude, we demonstrated changes in the localisation of HMGB1 in association with trophoblast differentiation in uncomplicated pregnancies. Cytoplasmic accumulation of HMGB1 is the first step before its release in the extracellular space. We showed that a specific isoform of HMGB1 (disulfide isoform) induced inflammatory cytokines secretion which suggests a role of this DAMP in placental inflammation and function. Finally, HMGB1 and its receptors are increased in a pathological condition (PPPE) demonstrating that this DAMP may play different role in both inflammatory context and trophoblast differentiation.

S'ha estudiat la cinètica de fotosensibilització de l'oxigen singlet (1O2) en cèl·lules eucariotes en suspensió mitjançant un espectròmetre d'última generació amb resolució temporal per sota del microsegon. Els estudis revelen que la cinètica del 1O2 depèn del seu lloc de formació. Per una banda, la producció del 1O2 es més lenta en els lisosomes que en el nucli. Per altra banda, el 1O2 es capaç d'escapar de les cèl·lules quan es fotosensibilitza en el nucli, però es queda confinat al interior si es fotosensibilitza en els lisosomes. Malgrat que el temps de vida del 1O2 es troba en els microsegons, la desactivació principal ve donada per interaccions amb les biomolècules característiques de cadascú dels orgànuls. La incertesa respecte a la producció de 1O2 en un orgànul determinat es pot eliminar mitjançant l'ús de fotosensibilitzadors modificats genèticament, ja que aquets poden ésser expressats selectivament. Amb aquesta finalitat, s'avaluen les propietats fotosensibilitzants de mutants de proteïna fluorescent verd (GFP). Algunes de les GFPs estudiades sensibilitzen la formació del 1O2 malgrat amb baixa eficiència. Els resultats obtinguts es comparen amb els del cromòfor de la GFP i mostren que l'estructura proteínica, a sobre de modular les propietats fotofísiques del cromòfor, també el protegeix de la desactivació col·lisional. Finalment, s'estudien les propietats d'absorció bifotónica del 2,7,12,17-tetrafenilporficé i del seu complex de pal·ladi (II). L'eficiència de formació del 1O2 per part dels dos compostos, desprès de l'absorció simultània de dos fotons, es aproximadament 100 vegades superior a la dels seus anàlegs porfirínics, amb seccions d'absorció bifotòniques δ ~ 25 GM. Les excel·lents propietats d'aquestos compostos s'expliquen mitjançant arguments qualitatius i s'analitzen les seves perspectives de cara al seu ús en teràpia fotodinámica. / Se ha estudiado la cinética de fotosensibilización de 1O2 en células eucariotas en suspensión, usando un espectrómetro de última generación con resolución temporal por debajo del microsegundo. Los estudios revelan que la cinética del 1O2 depende de su lugar de formación. Por una parte, la producción de 1O2 es más lenta en los lisosomas que en el núcleo. Por otra parte, el 1O2 es capaz de escapar de las células cuando es fotosensibilizado en el núcleo, mientras que queda confinado en el interior si se fotosensibiliza en los lisosomas. A pesar de que el tiempo de vida del 1O2 se encuentra en los microsegundos, la desactivación principal viene dada por interacciones con las biomoléculas características de cada orgánulo. La incertidumbre respecto a la producción de 1O2 en un orgánulo determinado puede ser eliminada mediante el uso de fotosensibilizadores modificados genéticamente ya que pueden ser expresados selectivamente. Con este fin, se evalúan las propiedades fotosensibilizantes de mutantes de proteína fluorescente verde (GFP). Algunas de las GFPs estudiadas sensibilizan la formación de 1O2 aunque con baja eficiencia. Los resultados obtenidos se comparan con los del cromóforo de la GFP y muestran que la estructura proteínica, además de modular las propiedades fotofísicas del cromofóro, también lo protege de la desactivación colisional. Finalmente, se estudian las propiedades de absorción bifotónica del 2,7,12,17-tetrafenilporficeno y de su complejo de paladio (II). La eficacia de formación de 1O2 de ambos compuestos, tras la absorción simultánea de dos fotones, es aproximadamente 100 veces superior a la de sus análogos porfirínicos, con secciones de absorción bifotónica δ ~ 25 GM. Las excelentes propiedades de estos compuestos se explican mediante argumentos cualitativos y se analizan sus perspectivas de cara a su uso en terapia fotodinámica. / The kinetics of singlet oxygen (1O2) photosensitisation in human skin fibroblasts have been investigated by means of an ultrasensitive near-infrared spectrometer with submicrosecond time resolution. The results indicate that the 1O2 kinetics are site-dependent. On one hand, the production of 1O2 is slower in the lysosomes than in the nucleus. On the other hand, 1O2 is able to escape out of the cells when photosensitised in the nucleus, while 1O2 photosensitized in the lysosomes is confined. Despite showing a lifetime in the microsecond time domain, the decay of 1O2 is governed by interactions with the biomolecules within the organelle there it is produced. The uncertainty as to the intracellular site of 1O2 production may be removed by the use of genetically-encoded photosensitisers, which can be expressed in any desired organelle. Towards this end, the ability of some fluorescent proteins (GFPs) to photosensitise 1O2 has been studied. Some of the studied proteins are able to produce 1O2 albeit with a very low quantum yield. The results obtained are compared to those of the synthetic GFP chromophore and indicates that the protein scaffold not only plays a role in modulating the photophysical properties of the chromophore but also has a protective function from collisional quenching. Finally, the two-photon absorption properties of tetraphenylporphycene and its palladium (II) complex have been determined. These compounds are ca. 100-fold more efficient two-photon 1O2 photosensitisers than their isomeric porphyrin counterparts, with two-photon absorption cross sections δ ~ 25 GM. Qualitative symmetry-based arguments are provided to explain the excellent two-photon properties and the prospects for photodynamic therapy are discussed.