Succinat und ihre Derivate werden in vielfältiger Weise in den Bereichen Tenside, Lebensmittel, Pharmazeutika und Polymere angewendet. Aufgrund der derzeit kostenintensiven petrochemischen Synthese ist die aerobe nicht-konventionelle Hefe Yarrowia (Y.) lipolytica für die biotechnologische Succinatsynthese von großem Interesse. In der vorliegenden Arbeit wurde das Potential dieser Hefe für eine industrielle Succinatproduktion unter Betrachtung des Einflusses der enzymatischen Aktivitäten von Succinyl-CoA Synthetase und Pyruvat-Carboxylase auf die Succinatsynthese untersucht. Es wurde eine Steigerung der Succinatausbeute um 40 % durch die Erhöhung der Pyruvat-Carboxylase Aktivität um den Faktor 7-8 gemeinsam mit der Deletion des Gens der β Untereinheit der Succinyl-CoA Synthetase im genetisch veränderten Y. lipolytica Stamm H222-AK10 (mcPYC Δscs2) erzielt. Unter Verwendung von Glycerol als C-Quelle wurde eine Erhöhung der Succinatbildung der Transformande H222 AK10 im Vergleich zum Wildtyp von 5,1 ± 0,7 g/l auf 8,7 ± 1,6 g/l nachgewiesen. Die Raum-Zeit-Ausbeute dieses Hefestammes verdoppelte sich von 11,9 ± 1,3 mg/l*h auf 21,9 ± 2,5 mg/l*h. Eine Erhöhung der Sekretion organischer Säuren gelang hingegen nicht durch den alleinigen Verlust der Succinyl-CoA Synthetase Aktivität in den Stämmen H222-AK4 (scs1::URA3), H222-AK8 (scs2:.URA3) und H222-AK9 (scs1::URA3 Δscs2) oder durch die alleinige Aktivitätserhöhung der Pyruvat-Carboxylase in H222-AK1 (mcPYC). Des Weiteren wurde ein Y. lipolytica Stamm erzeugt, der durch die Überexpression der für die Succinyl-CoA Synthetase kodierenden Gene SCS1 und SCS2 charakterisiert ist. Die Transformande H222 AK2 (mcSCS1 mcSCS2) bildete unter den gleichen Kultivierungsbedingungen durchschnittlich 2 g/l weniger Succinat als der Wildtyp (5,1 ± 0,7 g/l). Auch die zusätzliche Erhöhung der Pyruvat-Carboxylase Aktivität um den Faktor 4 in der Transformande H222 AK3 (mcPYC mcSCS1 mcSCS2) konnte den negativen Effekt der erhöhten Gen-Dosen von SCS1 und SCS2 auf die Succinatsynthese nicht aufheben. Dementsprechend wurden für H222-AK3 eine Succinatausbeute von 3,1 ± 0,3 g/l bestimmt.

Succinat und ihre Derivate werden in vielfältiger Weise in den Bereichen Tenside, Lebensmittel, Pharmazeutika und Polymere angewendet. Aufgrund der derzeit kostenintensiven petrochemischen Synthese ist die aerobe nicht-konventionelle Hefe Yarrowia (Y.) lipolytica für die biotechnologische Succinatsynthese von großem Interesse. In der vorliegenden Arbeit wurde das Potential dieser Hefe für eine industrielle Succinatproduktion unter Betrachtung des Einflusses der enzymatischen Aktivitäten von Succinyl-CoA Synthetase und Pyruvat-Carboxylase auf die Succinatsynthese untersucht. Es wurde eine Steigerung der Succinatausbeute um 40 % durch die Erhöhung der Pyruvat-Carboxylase Aktivität um den Faktor 7-8 gemeinsam mit der Deletion des Gens der β Untereinheit der Succinyl-CoA Synthetase im genetisch veränderten Y. lipolytica Stamm H222-AK10 (mcPYC Δscs2) erzielt. Unter Verwendung von Glycerol als C-Quelle wurde eine Erhöhung der Succinatbildung der Transformande H222 AK10 im Vergleich zum Wildtyp von 5,1 ± 0,7 g/l auf 8,7 ± 1,6 g/l nachgewiesen. Die Raum-Zeit-Ausbeute dieses Hefestammes verdoppelte sich von 11,9 ± 1,3 mg/l*h auf 21,9 ± 2,5 mg/l*h. Eine Erhöhung der Sekretion organischer Säuren gelang hingegen nicht durch den alleinigen Verlust der Succinyl-CoA Synthetase Aktivität in den Stämmen H222-AK4 (scs1::URA3), H222-AK8 (scs2:.URA3) und H222-AK9 (scs1::URA3 Δscs2) oder durch die alleinige Aktivitätserhöhung der Pyruvat-Carboxylase in H222-AK1 (mcPYC). Des Weiteren wurde ein Y. lipolytica Stamm erzeugt, der durch die Überexpression der für die Succinyl-CoA Synthetase kodierenden Gene SCS1 und SCS2 charakterisiert ist. Die Transformande H222 AK2 (mcSCS1 mcSCS2) bildete unter den gleichen Kultivierungsbedingungen durchschnittlich 2 g/l weniger Succinat als der Wildtyp (5,1 ± 0,7 g/l). Auch die zusätzliche Erhöhung der Pyruvat-Carboxylase Aktivität um den Faktor 4 in der Transformande H222 AK3 (mcPYC mcSCS1 mcSCS2) konnte den negativen Effekt der erhöhten Gen-Dosen von SCS1 und SCS2 auf die Succinatsynthese nicht aufheben. Dementsprechend wurden für H222-AK3 eine Succinatausbeute von 3,1 ± 0,3 g/l bestimmt.:Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis VI Tabellenverzeichnis IX Abkürzungsverzeichnis XI 1. Einleitung 1 1.1. Bernsteinsäure, Succinat 1 1.2. Succinat als Zwischenprodukt des Tricarbonsäurezyklus 3 1.2.1. Die Enzyme des TCC in Saccharomyces cerevisiae 5 1.2.2. Succinatbildung im TCC durch die Succinyl-CoA Synthetase 6 1.2.3. Pyruvat-Carboxylase 7 1.3. Succinat als Endprodukt des Glyoxylatzyklus 9 1.4. Biotechnologische Herstellung von Succinat 10 1.4.1. Succinatproduktion mit Actinobacillus succinogenes und Anaerobiospirillum succiniproducens 11 1.4.2. Succinatproduktion mit Corynebacterium glutamicum 12 1.4.3. Succinatproduktion mit Escherichia coli 12 1.4.4. Yarrowia lipolytica als potentieller Succinatproduzent 15 1.5. Yarrowia lipolytica 15 1.6. Zielstellung 18 2. Material und Methoden 20 2.1. Geräte 20 2.2. Chemikalien, Biochemikalien und Nukleinsäuren 21 2.2.1. Feinchemikalien 21 2.2.2. Enzyme 22 2.2.3. Verbrauchsmaterialien und Kitsysteme 23 2.3. Verwendete Plasmide 23 2.4. Konstruierte Plasmide 24 2.5. Oligonukleotide 25 2.6. Mikroorganismen 26 2.6.1. Escherichia coli 26 2.6.2. Yarrowia lipolytica 27 2.7. Kultivierung 27 2.7.1. Kultivierung von Escherichia coli 27 2.7.2. Kultivierung von Yarrowia lipolytica 28 2.8. Gentechnische Methoden 29 2.8.1. Genomische DNA-Isolierung 29 2.8.2. Agarose-Gelelektrophorese 29 2.8.3. Polymerase Kettenreaktion 30 2.8.4. Verdau der DNA mit Restriktionsendonukleasen 31 2.8.5. DNA-Aufreinigung 31 2.8.6. Plasmidisolierung aus Escherichia coli 31 2.8.7. Dephosphorylierung 31 2.8.8. Ligation 32 2.8.9. Transformation elektrokompetenter Escherichia coli Zellen 32 2.9. Plasmidkonstruktion 33 2.9.1. Konstruktion der Expressionskassette für die Überexpression des Pyruvat-Carboxylase kodierenden Gens 33 2.9.2. Konstruktion der Expressionskassetten für die Überexpression der Gene der α- und β-Untereinheit der Succinyl-CoA Synthetase 34 2.9.3. Konstruktion der Deletionskassette des für die α-Untereinheit der Succinyl-CoA Synthetase kodierenden Gens 35 2.9.4. Konstruktion der Deletionskassette des für die β-Untereinheit der Succinyl CoA Synthetase kodierenden Gens 36 2.9.5. Sequenzierung konstruierter Plasmide 36 2.10. Transformation von Yarrowia lipolytica Zellen 37 2.10.1. Transformation von Yarrowia lipolytica mittels der LiAc-Methode 37 2.10.1.1. Herstellung chemisch kompetenter Yarrowia lipolytica Zellen 37 2.10.1.2. Transformation chemisch kompetenter Hefezellen 37 2.10.2. Herstellung elektrokompetenter Yarrowia lipolytica Zellen 38 2.10.3. Elektrotransformation von Yarrowia lipolytica 38 2.11. Southern Blot 39 2.11.1. Transfer der DNA auf eine Nylonmembran 39 2.11.2. Sondenherstellung 39 2.11.3. Immunologische Detektion 40 2.11.4. Strippen der Southern Blot Membran 40 2.12. Biochemische Methoden 41 2.12.1. Ernte und Aufschluss der Hefezellen 41 2.12.2. Aktivitätsbestimmung der Citrat-Synthase 41 2.12.3. Aktivitätsbestimmung der Aconitase 41 2.12.4. Aktivitätsbestimmung der NADP-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase 42 2.12.5. Aktivitätsbestimmung der NAD-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase 42 2.12.6. Aktivitätsbestimmung der α-Ketoglutarat-Dehydrogenase 43 2.12.7. Aktivitätsbestimmung der Succinyl-CoA Synthetase 43 2.12.8. Enzymatische Mitochondrienpräparation 46 2.12.9. Aktivitätsbestimmung der Succinat-Dehydrogenase 47 2.12.10. Aktivitätsbestimmung der Fumarase 47 2.12.11. Aktivitätsbestimmung der Malat-Dehydrogenase 48 2.12.12. Aktivitätsbestimmung der Isocitrat-Lyase 48 2.12.13. Aktivitätsbestimmung der Pyruvat-Carboxylase 48 2.12.14. Proteinbestimmung 49 2.13. Mikroskopische Bestimmung der Zellmorphologie 49 2.14. Kultivierung 49 2.14.1. Bestimmung der optischen Dichte 50 2.14.2. Animpfen der Hauptkultur 50 2.14.3. Succinatproduktionsmedium 50 2.14.4. Kultivierung unter Thiaminlimitation 51 2.14.5. Kultivierung unter Stickstofflimitation 52 2.14.6. Bestimmung organischer Säuren mittels Ionenchromatographie 52 2.15. Bioinformatik 53 3. Ergebnisse 54 3.1. Überexpression des Pyruvat-Carboxylase kodierenden Gens 54 3.2. Überexpression der Succinyl-CoA Synthetase kodierenden Gene 58 3.2.1. Bestimmung der Succinyl-CoA Synthetase Enzymaktivität 61 3.2.2. Bestimmung der spezifischen Aktivität weiterer Enzyme 61 3.3. Überexpression der für die Pyruvat-Carboxylase und Succinyl-CoA Synthetase kodierenden Gene 63 3.3.1. Bestimmung der spezifischen Aktivitäten der Enzyme des TCC und der PYC sowie der ICL 66 3.4. Deletion der Succinyl-CoA Synthetase Gene 68 3.4.1. Bestimmung der Succinyl-CoA Synthetase Enzymaktivität 72 3.4.2. Bestimmung weiterer spezifischer Enzymaktivitäten 73 3.5. Überexpression des Gens der Pyruvat-Carboxylase gemeinsam mit der Deletion des Gens für die β Untereinheit der Succinyl-CoA Synthetase 74 3.5.1. Bestimmung der spezifischen Aktivitäten von Enzymen des TCC, sowie der PYC und ICL 76 3.6. Morphologische Veränderungen der Transformanden 78 3.7. Produktion organischer Säuren im Succinatproduktionsmedium 80 3.9.1 Bestimmung der PYC-, ICL- und SDH-Aktivitäten während der Kultivierung im Succinatproduktionsmedium 87 3.8. α-Ketoglutarat-, Pyruvat- und Fumaratproduktion unter Thiaminlimitation 90 3.9. Citrat- und Isocitratproduktion unter Stickstofflimitation 96 4. Diskussion 100 4.1. Auswahl einer geeigneten C-Quelle für die Succinatproduktion 101 4.2. Reduktion der Succinatproduktion von Yarrowia lipolytica 102 4.3. Genetische Veränderungen, für die kein Einfluss auf die Succinatproduktion von Yarrowia lipolytica nachgewiesen wurde 106 4.3.1. Überexpression des Pyruvat-Carboxylase kodierenden Gens 107 4.3.2. Deletion der Succinyl-CoA Synthetase Gene 108 4.4. Erhöhung der Succinatproduktion von Yarrowia lipolytica 112 4.5. Auswirkungen auf die Produktion anderer organischer Säuren 119 4.5.1. α-Ketoglutarat-, Pyruvat- und Fumaratproduktion unter Thiaminlimitation 119 4.5.2. Citrat- und Isocitratproduktion unter Stickstofflimitation 121 4.6. Morphologische Veränderungen 122 4.6.1. Koloniemorphologie 122 4.6.2. Zellmorphologie 124 Literaturverzeichnis 126

Protein phosphorylation constitutes an important mechanism for cellular regulation in both Eucarya and Bacteria. All living organisms evolved from a common progenitor; this implies that protein phosphorylation as a means of regulation also exists in Archaea. Previously, in the sulfur-dependent archaeon Sulfolobus solfataricus a gene was cloned encoding a protein-serine/threonine phosphatase that was similar to eucaryal protein-serine/threonine phosphatases type 1, 2A, and 2B. To identify protein phosphatases in other archaeons, oligonucleotides encoding conserved regions of eucaryal protein-serine/threonine phosphatases were used in the polymerase chain reaction to amplify genomic DNA from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. From the PCR reaction a fragment of DNA was isolated that encoded a portion of a protein phosphatase. Using this DNA fragment as a probe, the entire phosphatase gene was isolated. The amino acid sequence of the phosphatase encoded by this gene displayed greater than 30% identity with eucaryal protein-serine/threonine phosphatase type 1. The gene encoding the Methanosarcina phosphatase was expressed in Escherichia coli. The expressed protein exhibited protein serine phosphatase activity that was sensitive to inhibitors of eucaryal phosphatases such as okadaic acid, microcystin, calyculin, and tautomycin. In order to identify potential endogenous substrates of archaeal protein-serine/threonine phosphatases and kinases, a study was initiated to characterize the most prominent phosphoproteins in S. solfataricus. Cell extracts were incubated with [γ-³²P] ATP, MgCl₂, and MnCl₂, and the proteins in the extracts were separated by SDS-PAGE. Autoradiography of the gels revealed four prominent phosphoproteins with apparent molecular masses of 35, 46, and 50 kDa. N-terminal sequence analysis and enzymatic assays of the 35 kDa phosphoprotein identified this phosphoprotein as the a-subunit of succinyl-CoA synthetase. N-terminal sequence analysis and enzymatic assays revealed that the 50 kDa phosphoprotein was a hexosephosphate mutase. Neither the 50 kDa nor the 35 kDa phosphoprotein appeared to be the target of protein kinases or phosphatases. Therefore, while protein-serine phosphatases exist in Archaea, the targets of these phosphatases have yet to be determined. / Ph. D.