Le canal KATP résulte de l'assemblage d'un canal potassique inhibé par l'ATP intracellulaire (Kir6.2) et d'un transporteur<br />ABC, le récepteur des sulfonylurées (SUR) de la famille MRP/ABCC. SUR a un rôle régulateur essentiel : il confère au<br />canal une sensibilité accrue à l'inhibition par l'ATP, provoque son activation lorsque l'ADP augmente, et est la cible des<br />activateurs et bloqueurs pharmacologiques du canal.<br />Nous nous sommes intéressés à divers aspects structure/fonction de SUR en tant que modèle de transporteur ABC<br />eucaryote. Son couplage naturel à un canal ionique en facilite grandement l'étude grâce à la technique<br />électrophysiologique du patch-clamp.<br />La poursuite des travaux pour déterminer la nature moléculaire de la sélectivité des isoformes de SUR aux ouvreurs<br />pharmacologiques nous a permis de conclure que seul le faible encombrement de la Thr1253 de SUR2A, contre la Met<br />1290 de SUR1, serait le critère important pour l'activation pharmacologique des canaux KATP.<br />Nos travaux ont ensuite porté sur un domaine de la sous-unité SUR riche en acides aminés chargés négativement<br />(succession de 15 résidus glutamates ou aspartates) qui s'est avéré ne pas être impliquée dans la fonction du canal dans<br />notre système d'expression.<br />Nous avons étudié l'effet des ions Zn2+ et Cd2+ intracellulaires sur les canaux KATP et montré que ces ions peuvent activer<br />les canaux via leur liaison à SUR. Ce site de liaison reste encore à déterminer.<br />Nous avons enfin essayé de comprendre le rôle de chacun des domaines de liaison des nucléotides et nous avons pour cela<br />conçu des protéines SUR2A possédant des NBD identiques (NBD1-NBD1 et NBD2-NBD2) ou inversés (NBD2-NBD1).<br />Nos résultats suggèrent que (1) les NBD sont interchangeables (2) l'activation pas le Mg-ADP requiert les deux NBD (3)<br />l'action des ouvreurs est indépendante du NBD2.

Les canaux potassiques sensibles à l'ATP (K-ATP) jouent un rôle fondamental au sein de la cellule, puisqu'ils ajustent le potentiel de membrane en fonction de l'état métabolique. Ils combinent deux types de protéines: le récepteur des Sulfonylurée (SUR), protéine régulatrice faisant partie des transporteurs ABC, et le canal potassique rectifiant entrant Kir6. Elles s'associent en formant un hétérooctamère (4 SUR/4 Kir6) d'une taille de ~ 1MDa. A l'heure actuelle, l'unique structure disponible de ce complexe est une structure basse-résolution de 18 Å qui ne permet pas de visualiser correctement l'arrangement des différentes sous-unités. Le but principal de ce projet de thèse était d'obtenir des informations à la fois structurales et fonctionnelles sur le couplage entre Kir6.2 et SUR.Il existe 2 isoformes du Kir6 humain (Kir6.1 et 6.2) et 3 isoformes de SUR : SUR1, principalement exprimée avec Kir6.2 dans les cellules β pancréatiques et les neurones ; SUR2A, très abondante avec Kir6.1 dans les muscles cardiaques et squelettiques ; et SUR2B, présent avec Kir6.1 au niveau des muscles lisses. La façon dont SUR est capable de moduler l'ouverture du canal en réponse à la fixation d'un ligand est encore mal comprise.Au sein du canal K-ATP, SUR a un rôle de modulateur du gating de Kir6.2. Il a été montré que trois résidus (E1305, I1910, L1313) dans SUR2A, étaient impliqués dans la « voie d'activation » liant la fixation d'un ligand sur SUR2A et l'ouverture du canal Kir6. Afin d'examiner le rôle des résidus correspondants au sein de SUR1, nous avons réalisé des chimères entre SUR1 et le transporteur ABC MRP1 (qui n'interagit pas avec Kir6.2) et utilisé la technique du patch-clamp pour évaluer leur fonctionnalité. Nos résultats ont montré que les mêmes résidus au sein de SUR1 et SUR2A sont impliqués dans l'association fonctionnelle avec Kir6.2, mais que les spécificités au niveau de la chaine latérale pourraient expliquer les propriétés propres aux canaux pancréatiques et cardiaques. En effet, dans le pancréas, les canaux SUR1/Kir6.2 sont partiellement actifs au repos tandis que les canaux SUR2A/Kir6.2 du cœur sont principalement fermés. Cette spécificité peut être expliquée par les interactions spécifiques de SUR1 et SUR2A avec Kir6.2.La participation du canal Kir6.2 dans le couplage avec SUR ne peut être facilement étudiée puisque la région allant du N-terminal de Kir6.2 jusqu'à sa première hélice est physiquement associée à SUR. Des mutations à ce niveau pourraient affecter à la fois l'interaction physique et fonctionnelle avec SUR. Pour passer outre cet obstacle, nous avons utilisé la technologie ICCR développée dans notre laboratoire. Les ICCRs sont des protéines artificielles créées par couplage physique du C-terminal d'un RCPG au N-terminal de Kir6.2. Cette technologie permet l'étude de la fonction du N-ter de Kir6.2 puisque la fusion entre le RCPG et le canal assure une association fonctionnelle : le signal électrique généré par le canal ionique est directement lié à la fixation du ligand sur le RCPG. Le domaine reliant les deux protéines est essentiel pour la fonction de l'ICCR et sa longueur affecte la régulation du canal. De façon intéressante, deux ICCRs de même longueur mais ayant 9 résidus de différence présentent deux phénotypes différents : un fonctionnel, un inactif. L'ICCR inatif est caractérisé par la perte des résidus 26 à 34 du N-ter contenant 5 arginines. Nous avons réalisé la cartographie fonctionnelle de ces résidus essentiels pour la régulation de Kir6.2. Successivement, nous avons effectué les mêmes mutations d'arginines au sein du canal naturel K-ATP, mais n'avons pas observé de différence entre le canal muté et sauvage. Ces résultats suggèrent qu'il existe au moins deux voie de régulation pour le gating de Kir6.2 : une via les arginines du N-ter (utilisé par les RCPGs) et l'autre, toujours inconnue, utilisée par SUR. / ATP-sensitive potassium (K-ATP) channels play a key role in adjusting the membrane potential to the metabolic state of cells. They result from the unique combination of two proteins: the SulfonylUrea Receptor (SUR), a protein of the ABC transporters family, and the inward rectifier K+ channel Kir6. Both subunits associate to form a heterooctamer (4 SUR/4 Kir6) of ~ 1MDa. A high-resolution structure of the complex is still missing. To date, only a 18 Å structure of the full complex is available. Unfortunately, the low resolution prevent visualization of subunits arrangement. This PhD project aimed at obtaining structural and functional information on the functional coupling between Kir6.2 and SUR. Structural studies are still in progress.While 2 isoforms of the human Kir6 protein exists (Kir6.1 and 6.2), 3 isoforms of the SUR protein are known: SUR1, mostly expressed in pancreatic β-cells and neurons mainly with Kir6.2, SUR2A, abundant in cardiac and skeletal muscle mainly with Kir6.2, and SUR2B, found in smooth muscle mostly with Kir6.1. How SUR modulates channel gating in response to the binding of ligands is still poorly understood.The SUR protein belongs to a family of transporters but in K-ATP works as a gating modulator. How a 'transporter' modulate Kir6 gating? In SUR2A three residues (E1305, I1310, L1313) were found to be implicated in the ‘activation pathway' linking binding of openers to SUR2A and channel opening. To examine the role of the matching residues in the SUR1 isoform, we designed chimeras between SUR1 and the ABC transporter MRP1 (which does not interact with Kir6.2), and used patch clamp to assess the functionality of SUR1/MRP1 K-ATP chimeric channels. Our results reveal that the same residues in SUR1 and SUR2A are involved in the functional association with Kir6.2, but they display side-chain specificities that could account for the contrasted properties of pancreatic and cardiac K-ATP channels. In fact, in pancreas, SUR1/Kir6.2 channels are partly active at rest while in cardiomyocytes SUR2A/Kir6.2 channels are mostly closed. This divergence of function could be related to differences in the interaction of SUR1 and SUR2A with Kir6.2.The participation of the Kir6.2 channel in the coupling with SUR cannot be easily studied, as the region spanning from Kir6.2 N-terminal to its first helix is in thigh physical association with SUR. Mutations at this level could affect both physical and functional interaction with the regulatory subunit. To overcome this obstacle we used the ICCR technology developed in our laboratory. ICCRs are artificial proteins created by physical and functional linkage of a GPCR C-terminus to the Kir6.2 N-terminus. ICCRs provide a unique method to study the function of the Kir6.2 channel N-terminal, as the fusion between GPCR and channel ensure physical association. In ICCRs the electrical signal generated by the ion channel is directly linked to ligand binding on the GPCR. The domain linking GPCR and channel is crucial for ICCR function and its length affects channel regulation. Interestingly, two ICCRs, having identical linker length but nine residues differences at the fusion point, showed different phenotypes: one functional, one inactive (no channel regulation). The inactive ICCR is characterized by the lack of residues 26 to 34 in the channel N-terminus containing 5 arginines. We functionally mapped these arginines and identify specific residues essential for Kir6.2 regulation. Successively, we transferred this knowledge to the K-ATP mutating the previously found essential arginines. Here, we did not observe any change compared to wild-type channels. This result suggest that there are at least two ways to modulate Kir6.2 gating: one through the arginines in the N-terminal (used by the GPCR) and another, still unknown, used by SUR.

Les différents rejets aqueux de types industriel, artisanal et/ou hospitalier, contiennent différents contaminants organiques ou inorganiques qu’il convient d’éliminer. Selon le type de l’industrie et de l’utilisation, ces rejets auront besoin de subir un ou plusieurs traitements. Il existe de nombreuses méthodes de traitement des eaux adaptées à chaque pollution et à chaque usage. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes intéressés à l’utilisation d’une méthode peu onéreuse qui met en jeu les ions ferriques, ions ferreux, oxygène moléculaire et la lumière solaire (Fe(III)/Fe(II)/O2/hν) pour induire la transformation de composés organiques appartenant à deux familles de pesticides : les sulfonylurées et les organophosphorés. L’objectif majeur de l’étude consiste à la compréhension du rôle des ions de fer(II) dans le processus photocatalytique largement reporté dans la littérature ainsi que d’identifier les principaux produits formés au cours du processus. L’étude de la dégradation des sulfonylurées par excitation UV du peroxyde a démontré, sans aucune surprise, une réelle efficacité du processus. La réaction met en jeu les radicaux hydroxyles qui ont été clairement mis en évidence et quantifiés sous irradiation continue et par photolyse laser. Le processus dépend de la concentration initiale du substrat, du pH et de la concentration du photoinducteur (H2O2). La présence dans le milieu de la plupart des ions inorganiques conduit à une inhibition partielle de la dégradation. Dans le cas des ions étudiés, l’ordre de la réactivité est SO42- > Cl- > NO3- > CO32- . Cet aspect est très important à considérer lorsqu’il s’agit de traiter des eaux par le procédé UV/H2O2 . Lors de l’étude du comportement photochimique du complexe [Fe(H2O)5(OH)]2+ sous excitation à 365 nm et en simulateur solaire, la principale espèce réactive mise en jeu est le radical hydroxyle. En présence de composés organiques, une dégradation totale a pu être obtenue et ceci même pour de faibles concentrations en complexe de fer(III) (1,0x10-6 mol L-1). Il y a donc une régénération in situ et sous irradiation du fer(III). L’ensemble des expériences entreprises a permis de montrer que la régénération met en jeu non seulement le fer(II) mais également l’oxygène. La présence simultanée du fer(III) à l’état de trace et du fer(II) joue un rôle clé. En effet, l’excitation du fer(III) permet la production d’état excités qui transfèrent l’énergie aux ions de fer(II). Ces derniers états excités de fer(II) réagissent avec l’oxygène moléculaire par un processus de transfert d’électrons pour générer du fer(III) et l’anion superoxyde. La solution se trouve ainsi de plus en plus enrichie en fer(III) au fur et à mesure de l’excitation lumineuse. Sur le plan analytique, nous avons utilisé la technique LC/MS et LC/ESI/MS2 pour appréhender la structure chimique des photoproduits formés par l’étude précise des processus de fragmentation. Parmi toutes les réactions habituelles du radical hydroxyl (hydroxylation du noyau aromatique, scission du pont sulfonylurée et déméthylation), nous avons montré que certaines sulfonylurées conduisent, en milieu légèrement acide, à un processus de scission du squelette triazinique. Une telle réaction a également pu être confirmée par des études théoriques au niveau B3LYP/6-31G (d,p). La présence simultanée d’un groupement methoxy et d’une amine secondaire adjacente au cycle triazine est une condition essentielle pour une telle ouverture. L’ouverture du cycle est une étape importante pour atteindre l’objectif de l’étude qui est d’obtenir la minéralisation des solutions et ainsi le traitement des rejets aqueux de types industriel, artisanal et/ou hospitalier. / Waste waters resulting from industrial and artisanal activities as well as from hospital discharges contain numerous toxic organic and inorganic contaminants that require efficient treatment. In the present work, we employed various combinations of ferric and ferrous ions, oxygen, hydrogen peroxide and sunlight (Fe(III)/Fe(II)/O2/hν) to induce the transformation of two pesticide families: sulfonylureas and organophosphorus. The main objective of the study was devoted to the role of iron(II) species in the whole transformation process and also to the elucidation of the generated byproducts. In a first step, we used the system H2O2/ hν as a preliminary process for the degradation of the pollutant. This allowed a complete and fast removal of sulfonylureas. The reaction mainly involves hydroxyl radicals that were identified and quantified by nanosecond laser photolysis technique. The process highly depends on the initial substrate concentration, pH and the concentration of the photoinductor (H2O2). The presence of inorganic ions that could be present in waste waters was shown to inhibit the degradation, in the following decreasing order: SO42- > Cl- > NO3- > CO32- . In a second step, the study of the photochemical behavior of the iron(III) aquacomplex, [Fe(H2O)5(OH)]2+, upon light excitation at 365 nm as well as by using a solar simulator also showed the generation of hydroxyl radical together with iron(II) species. A complete elimination of studied pesticides was obtained even at low concentrations of iron(III) complex (1,0x10-6 mol L-1), indicating the high efficiency of the process. To gain insight into the degradation mechanism, the evolution of iron species upon irradiation was investigated in the absence and in the presence of molecular oxygen. The results suggested that a regeneration mechanism of iron(III) occurs through two consecutives steps. First, the excitation of iron(III) in trace concentrations, leads to the formation of iron(II) excited states through energy transfer process followed an electron transfer process that involves molecular oxygen and iron(II) excited state. As a conclusion, the solution becomes more and more enriched by iron(III) via the light excitation and in the presence of oxygen revealing the photocatalytic behavior of [Fe(H2O)5(OH)]2+. Within this work, a special attention was also devoted to the identification of products formed during the above photocatalytic process. This was performed by using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry LC/ESI/MS2. The close investigation of the fragmentation processes of the generated products, permitted the establishment of precise chemical structures. In addition to the classical degradation of sulfonylureas by hydroxyl radicals (hydroxylation of the aromatic ring, the scission of sulfonylurea bridge and demethylation) a ring opening of the triazine skeleton was also obtained. This was observed under acidic conditions and was clearly confirmed by theoretical studies at the B3LYP / 6-31G (d, p) level. This triazine scission was only obtained with sulfonylures that contain a methoxy group and a secondary amine adjacent to the triazine moiety. Such ring opening constitutes an important and fundamental step when decontamination or/and mineralization of waste waters are concerned.

Dans les eaux naturelles ou bien dans les eaux en cours de traitement, de nombreux processus peuvent générer des espèces réactives telles que de l´oxygène singulet, des ions superoxydes,des radicaux hydroxyles, ou bien d’autres oxydants. Dans les eaux naturelles, ces processus impliquent les substances humiques ou les ions nitrates en présence de lumière et d´oxygène. Dans les eaux en cours de traitement, les procédés d’oxydation avancée sont une source de production de radicaux hydroxyle. D’autres radicaux peuvent ensuite être formés par des réactions secondaires avec la matrice inorganique des eaux. Ces réactions aboutissent à la formation de radicaux inorganiques tels que les radicaux carbonates CO3·- et les radicaux chlores Cl· (atome de chlore). La réactivité de ces derniers est mal connue. Ce travail a pour but d’étudier la réactivité des radicaux carbonates et chlores avec des pesticides de type phénylurées, utilisés comme molécules modèles, et d’identifier les produits de dégradation. Le radical carbonate a été généré par la photolyse de [Co(NH3)5CO3]+, par photosensibilisation à partir de la 4- carboxybenzophenone, de la 1-nitronaphtalène et de la duroquinone et par l’excitation UV du peroxyde d’hydrogène. Le radical chlore a été généré par l’excitation UV du peroxyde d’hydrogène. Les constantes de vitesse de réaction des radicaux carbonates et chlores avec les pesticides étudiés, ont été déterminées, après validation d’une méthode de cinétique compétitive ou par modélisation cinétique. Ces constantes sont comprises pour le radical carbonate dans l’intervalle 0,35-3,5.107 L mol-1 s-1, et dans l’intervalle 1,2-3,9.108 L mol-1 s-1 pour le radical chlore. La comparaison de la réactivité des radicaux carbonates et chlores avec celle des radicaux hydroxyles, indique un facteur de l’ordre de 1000 pour le radical carbonate et de 100 pour le radical chlore, et ceci en faveur de la réactivité des radicaux hydroxyles. Plusieurs produits de dégradation du radical carbonate ont été identifiés. Il s’agit de produits d’hydroxylation du cycle aromatique, des produits issus d’une déméthylation, un dérivé quinone imine pour le fénuron, la cassure du pont dissulfure pour le metsulfuron méthyl. La comparaison des produits de dégradation formés avec les radicaux carbonates et hydroxyles met en évidence certains produits communs aux deux processus tandis que d’autres sont plus spécifiques. Les produits issus du radical carbonate sont moins nombreux en nombre que ceux issus du radical hydroxyle. / In natural water, humic substances are a source of reactive species production, in the presence of light and oxygen, such as singlet oxygen, superoxide, hydroxyl radicals, hydrogen peroxide but also a plurality of inorganic radicals such as the carbonate and chlorine radicals. The reactivity of these is unknown. This work aims to study the reactivity of carbonate and chorine radicals with pesticide ofphenylurea type and identify the products of degradation. The carbonate radical was generated by the photolysis of [Co(NH3)5CO3]+, by photosensitization from 4-carboxybenzophenone, from 1-nitronaphtalene and from duroquinone and by UV excitation of hydrogen peroxide. The chlorine radical was generated by UV excitation of hydrogen peroxide. The rate constants for reaction with the carbonate and chlorine radicals with the pesticides were determined after validation of competitive kinetic or kinetic modeling. These constants are included of the carbonate radical in the range 0.35-3.5x107 mol-1 L s-1, and in the range fron 1,2-3,9x108 mol-1 L s-1 for the chlorine radical. The comparison between the reactivity of the carbonate and chlorine radicals with the hydroxyl radicals, shows a factor 1000 for the carbonate radical and 100 for the chorine radical for the reactivity of hydroxyl radicals. Several degradation products were identified from the carbonate radical. These products were the hydroxylation of the aromatic ring, the products of demethylation, a derivative quionone imine for fenuron, the breaking of the bridge dissulfure for metsulfuron methyl. The comparison of the degradation products formed with carbonate and hydroxyl radicals show some common products to both processes, and others products are more specific. The products from the carbonate radical are fewer in number than those resulting from the hydroxyl radical.