Este trabalho teve como objetivo analisar os efeitos fisiológicos do herbicida Paraquat, indutor de estresse oxidativo, em plantas de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.). A escolha desta espécie como modelo fisiológico deste estudo deveu-se a sua importância econômica para o país, em especial para o Estado de São Paulo. O Paraquat (PQ) é um herbicida de contato que atua especificamente no Fotossistema II bloqueando o fluxo de elétrons e impedindo a redução do NADPH, aceptor final de elétrons. Como consequência, há a formação de radicais instáveis, reativos com a molécula de oxigênio (EROs), os quais causam danos em membranas, proteínas e ácidos nucleicos. A hipótese central foi a de que a atividade de peroxidase de ascorbato é mais sensível ao PQ do que a atividade de superóxido dismutase, nas mesmas condições. O experimento principal consistiu da aplicação, via pulverização foliar, de diferentes doses de PQ (0, 2, 4, 6 e 8 mM de Metil Violágeno, agente ativo), que permaneceu em contato por 24 e 48 horas. Após 18 horas de exposição, observou-se sintomas visuais de toxocidade e uma redução significativa da atividade fotossintética, medida através de parâmetros relacionados com a fluorescência da clorofila a. O nível de peroxidação de lipídeos, indicado pela concentração de TBARS, foi aumentado, indicando danos nas membranas causados pela geração de EROs. Um resultado importante foi o aumento da atividade específica de SOD (Superóxido Dismutase), primeira enzima de defesa contra EROs. Esse aumento foi gradativo com o aumento da dose e do tempo de exposição ao PQ. A isoforma mais evidente foi a SOD Cu/Zn, visualizada por atividade em gel nativo. Esta isoforma está presente preferencialmente em cloroplastos, organela alvo da ação do PQ. É importante ressaltar que mesmo em doses quase letais, a atividade desta enzima manteve-se em níveis semelhantes ao controle. Entretanto, a atividade de APX (Ascorbato Peroxidase), enzima que faz a remoção de radicais H2O2, gerados pela SOD, foi reduzida abruptamnete a partir de 4 mM PQ, apesar de ter sido observado um aumento na dose inicial (2 mM). Este fato sugere que os danos oxidativos em cana-de-açúcar tratadas com PQ podem ser causados pelo excesso de radicais H2O2. Diferente da SOD, a APX é considerada bastante susceptível a certos tipos de estresse ambiental, logo perdendo sua atividade. Analisou-se também a expressão de proteínas por SDS-PAGE e eletroforese 2-D. Em ambos resultados, foram observados diminuição na expressão de algumas proteínas ocasionada pelo tratamento com PQ. Contudo, não foi possível detectar claramente a indução de peptídeos nesse caso, provavelmente devido ao alto grau de degradação das estruturas celulares. O aumento da atividade de SOD em cloroplastos de folhas de cana-de-açúcar tratadas com PQ, deve ser mais estudado, pois esta pode ser uma enzima alvo para programas de melhoramento genético visando obtenção de plantas com resistência ao PQ e a outros herbicidas com modo de ação no sistema fotossintético. / This work had the objective to analyze physiological effects of Paraquat herbicide, an oxidative stress inductor, in sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants. The choice to use this species as a physiological model for this study was due its recognized economical importance for our country, in special to the State of Sao Paulo. Paraquat (PQ) is a contact herbicide that acts specifically on Photosystem II by blocking the normal electron flux and the reduction reaction of NADPH, the electron acceptor molecule. As consequence, there is formation of instable radicals and highly reactive oxygen species (ROS), which cause damage to membranes, proteins and nucleic acids. The central hypothesis was that ascorbate peroxidase activity is more sensitive to PQ than the activity of superoxide dismutase in the same conditions. The main experiment consisted on the sprayed of different concentrations of PQ (0, 2, 4, 6 e 8 mM of Metil Violagen) that stayed in leaf contact for 24 and 46 hours. After 18 hours, it was observed visible symptoms of toxicity and the photosynthetic activity decreased, measured by chlorophyll a fluorescence. Also, the level of lipids peroxidation measured by the increase concentration of TBARS formation, indicate damage to cell membrane caused by the generation of ROS. An important result was the increase of SOD specific activity (superoxide dismutase) first enzyme related to defense against ROS. This gradation increase was correspondent to the exhibition period to PQ. The most evident SOD isoform by native PAGE was the SOD Cu/Zn. This isoform is located preferentially in chloroplasts, organelle target to the action of PQ. It is important to remark that even in almost lethal concentrations of PQ the chloroplast SOD activity still remains expressed beilng responsible for the removal of H2O2 generated by SOD, which was reduced abruptly after 4 mM treatment. Although, it has been observed increase with the initial dose (2 mM). This fact suggests that the oxidative damages in sugarcane treated with PQ can be caused by excess of H2O2. Differently of SOD, this enzyme is considered to be fragile to certain kinds of environmental adversities, loosing its activity Also the protein expression was analyzed by SDSPAGE and 2-D electrophoresis. In both analyses, it was observed decrease of some protein expression caused by PQ. However, it was not possible to clearly detect peptides induction in this case, probably due to the elevated level of degradation of cell structures. The increase of chloroplast SOD activity in sugarcane leaves treated with PQ should be detailed investigated since it can be a molecular target for breeding programs with the goal to obtain plants with an acquired resistance to PQ or others herbicides with model action in the photochemical system.

Submitted by Cristiane Chim (cristiane.chim@ucpel.edu.br) on 2016-09-13T16:35:46Z No. of bitstreams: 1 carolina - Copia.pdf: 1129007 bytes, checksum: deaef0e96e4837a47c36de1f6dc1e109 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-13T16:35:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carolina - Copia.pdf: 1129007 bytes, checksum: deaef0e96e4837a47c36de1f6dc1e109 (MD5) Previous issue date: 2010-11-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES# / #2075167498588264571# / #600 / Objectives: The aim of this study was evaluate uric acid level in a population–based sample of young adults (18 to 24 years old). People with bipolar and depression disorder were compared with healthy psychiatric subjects without a history of mood episodes. Methods: Case-control study nested in a population-based sample. The diagnosis was confirmed with the Structured Clinical Interview for DSM-IV. The uric acid was assessed by commercial kits Results: The sample consisted of 216 subjects, 49 with diagnosis for bipolar disorder, 76 with depression and 91 population control. The uric acid levels were similar (control = 4.08 ± 1.27 mg/dL, depression = 3.78 ± 1.00 mg/dL e bipolar disorder =3.86 ± 1.33 mg/dL, p= 0,251). For maniac/hippomaniac and depressive episodes, were observed a tendency to increase in acid uric levels in maniac/hippomaniac episodes (4.43 ± 1.74 mg/dL) and a decrease in depressive episodes (3.70 ± 0.99 mg/dL) when compared to control subjects (4.08 ± 1.27 mg/dL)(p= 0.106). Conclusion: Uric acid levels is not correlated with diagnosis group, but the uric acid level have a tendency to presented increased in manic and/ or mixed episodes and decreased in depression episode, these result observed that levels of uric acid in mood disorders are altered according to the manifestation of symptoms. / Objetivo: O objetivo deste estudo é avaliar o nível de acido úrico em pacientes com transtornos de humor oriundo de uma amostra de base populacional com jovens adultos (18 a 24 anos), para este fim jovens com transtorno de humor bipolar e depressão foram comparados com jovens sem histórico de transtorno de humor. Métodos: Trata-se de um estudo de caso-controle aninhado a um estudo de base populacional, o diagnostico foi realizado através da Entrevista Clínica Estruturada para o DSM-IV (SCID) e os níveis de acido úrico séricos foram dosados utilizando-se kits comerciais. Resultados: A amostra foi constituída de 216 jovens, 49 com diagnostico de transtorno bipolar, 76 com depressão e 91 controles sem historia psiquiátrica prévia, os níveis de acido úrico entre os três grupos foram similares (controle = 4.08 ± 1.27 mg/dL, depressão = 3.78 ± 1.00 mg/dL e transtorno bipolar =3.86 ± 1.33 mg/dL, p= 0,251). Quando avaliados os níveis de ácido úrico entre os episódios mania/hipomania e depressivo, observa-se uma tendência no aumento do ácido úrico no episódio maníaco/misto (4,43 ± 1,74 mg/dL) e uma diminuição no episódio depressivo (3,70 ± 0,99 mg/dL) quando comparados aos jovens do grupo controle (4,08 ± 1,27 mg/dL)(p= 0,106). Conclusão: Os níveis de ácido úrico não foram significativos entre os grupos diagnósticos, porém os níveis de acido úrico apresentaram uma tendência para o aumento nos episódios maníacos e/ou mistos e uma diminuição no episódio depressivo, com estes resultados podemos observar que os níveis de acido úrico nos transtornos de humor podem estar alterados de acordo com a manifestação dos sintomas

Neste estudo avaliamos a ocorrência de fagocitose por parte de alguns tipos celulares presentes na hemolinfa do carrapato bovino B. microplus e a produção de espécies reativas de oxigênio durante a resposta imune. As técnicas empregadas para avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio foram luminescência amplificada por luminol, oxidação de fenol vermelho, microscopia de fluorescência e fluorimetria com o corante dihidrorrodamina 123 (DHR). Observamos um aumento da luminescência amplificada por luminol quando hemócitos foram incubados na presença de bactérias Micrococcus luteus ou zimosam ou PMA. Esta luminescência foi inibida por superóxido dismutase (SOD) e por catalase (CAT), enzimas antioxidantes que removem superóxido e peróxido de hidrogênio, respectivamente. LPS não elicitou aumento da luminescência dos hemócitos em relação ao controle. Através da oxidação de fenol vermelho em reação inibida por CAT, verificamos aumento nos níveis de H2O2 produzido pelos hemócitos quando estimulados com PMA e Micrococcus luteus, enquanto não houve aumento quando o estímulo foi LPS, corroborando os resultados da luminescência. Usando microscopia de fluorescência para avaliar a produção de ERO pelos hemócitos, encontramos que cerca de 25% dos hemócitos fluorescem com maior intensidade quando estimulados com zimosam, sendo esta fluorescência inibida por CAT. Através de fluorimetria usando DHR observamos um aumento na intensidade de fluorescência dos hemócitos estimulados com PMA em reação inibida por cisteína, substância redutora que remove peróxido de hidrogênio e peroxinitrito. Nosso conjunto de resultados permitem concluir que os hemócitos do carrapato bovino produzem espécies reativas de oxigênio durante a resposta imune, semelhantemente ao que ocorre em vertebrados e em invertebrados como moluscos, crustáceos e insetos. Este é o primeiro trabalho mostrando produção de ERO pelos hemócitos de aracnídeos. / The phagocytic activity and the reactive oxygen species (ROS) production during immune response of some hemocytes of the cattle tick Boophilus microplus were evaluated in this study. The ROS production was evaluated by luminol amplified luminescence, phenol red oxidation, dyhydrorhodamine (DHR) fluorescence microscopy and fluorimetry. The luminol-amplified luminescence increased when hemocytes were incubated with bacteria (Micrococcus luteus) or zymosam or phorbol 12-miristate 13 acetate (PMA). The superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), antioxidant enzymes that removes superoxide and hydrogen peroxide, respectively, inhibited this luminescence. Lipopolysaccharide (LPS) did not elicit luminescence of hemocytes in relation to controls. The catalase-inhibittable phenol red oxidation assay also showed an increase in the level of hydrogen peroxide produced by hemocytes stimulated with PMA or Micrococcus luteus. LPS did not stimulate the hemocytes, similarly to the observed by luminescence assay's. We also evaluated ROS production by fluorescence microscopy and we found approximately 25% more fluorescent hemocytes when zymosam was used. This fluorescence was inhibited by catalase. In DHR fluorimetry assay we observed an increase in the intensity of fluorescence in PMA stimulated hemocytes. This fluorescence was inhibited by cystein, a reducing agent that removes hydrogen peroxide and peroxinitrite. We conclude that hemocytes of the tick, like other invertebrate such as mollusks, crustaceans and insects and vertebrate, produce reactive oxygen species during the immune response. This is the first report of reactive oxygen species production by arachnid hemocytes.

A esquistossomose é uma doença tropical negligenciada, com alta morbidade e mortalidade, que afeta atualmente mais de 200 milhões de pessoas em todo o mundo, tendo o praziquantel (PZQ) como única opção de tratamento. Estudos descrevem várias cepas do parasito que são resistentes ao PZQ, fazendo-se necessário, estudos de novos medicamentos que possam ser utilizados no tratamento da esquistossomose. Um dos princípios do planejamento racional de fármacos consiste na escolha de alvos onde a droga produza efeito tóxico seletivo ao patógeno, e para isso é necessário definir o mecanismo de ação do fármaco proposto. A 7-epiclusianona (7-epi) é uma benzofenona que já teve atividade esquistossomicida descrita, tendo como critérios de eficácia a motilidade, danos no tegumento, acasalamento, postura de ovos, movimentação do sistema digestório e excretor. Neste sentido, o presente estudo analisou o impacto da 7-epi nos mecanismos de proteção dos vermes adultos de S. mansoni com o auxílio de ferramentas bioquímicas e biomoleculares. Uma investigação do grau de estresse oxidativo pela titulação de malondialdeído mostrou que a 7-epi na concentração de 12,5 μg/mL possui uma taxa de peroxidação lipídica no parasito reduzida quando comparada ao controle Kolliphor®, mas aumentada na concentração de 50 μg/mL (p < 0,001). De modo similar, quando se investigou a atividade no contexto ex vivo da superóxido dismutase (SOD), uma importante enzima detoxificadora do parasito, foi possível visualizar que a 7-epi interfere na sua atividade de forma significativa em relação aos controles RPMI 1640 e Kolliphor® à partir da concentração de 12,5 μg/mL (p < 0,001). Essa dosagem corresponde a 30% de inibição da atividade enzimática total em relação ao Kolliphor® e está muito próxima da dosagem de 7-epi que matou 90% dos parasitos (ED90=13,08 μg/mL) e na qual os danos no tegumento se apresentaram intensos. Complementarmente, na análise pelo docking molecular pode-se observar que a inibição da enzima não foi realizada diretamente no sítio, e que as melhores energias de interação com a 7-epi foram em uma cavidade próxima ao sítio e na junção dos monômeros. Finalmente, foram feitas análises quantitativas por qPCR do RNAm da SOD do parasito, cujos resultados não demonstraram mudança expressiva na transcrição da enzima após ação da 7-epi. Embora haja um impacto sobre a atividade da SOD do S. mansoni, este não parece ser o mecanismo principal de ação da 7-epi. Desta forma, é imprescindível a avaliação inibitória deste composto em outras enzimas do parasito, bem como a análise de outros mecanismos não enzimáticos que elucidem a ação da 7-epi em vermes adultos de S. mansoni. / Schistosomiasis is a neglected tropical disease with high morbidity and mortality, which currently affects more than 200 million people worldwide, counting only with praziquantel (PZQ) as a treatment option. Studies describe various parasite strains that are resistant to PZQ, making it necessary, studies of new drugs that can be used to treat schistosomiasis. One of the principles of drugs rational planning is to choose targets where the drug produces selective toxic effects on the pathogen, and for this is necessary to define the action mechanism of the proposed pharmaco. 7-epiclusianone (7-epi) already has schistosomicidal activity described, using as criteria of effectiveness: the motility, integument damage, mating, egg-laying and motility of the digestive and excretory system. In this direction, the present study analyzed the impact of the 7-epi against the protective mechanisms of adult worms of S. mansoni with the support of biochemical and biomolecular tools. An investigation of the degree of oxidative stress by malondialdehyde titre showed that the 7-epi at a concentration of 12,5 μg/mL has lower levels of lipid peroxidation rate comparing to the Kolliphor® control, but increased in concentration of 50 μg/ml (p <0,001). Similarly, when it investigated the activity of superoxide dismutase (SOD), an important parasite detox enzyme, in ex vivo context it was possible to see the 7-epi interfere in its activity significantly, compared to controls RPMI-1640 and Kolliphor® at a concentration of 12,5 μg /mL (p <0,001). This value corresponds to 30% of the entire enzyme activity regarding Kolliphor® and is close to the effective dose that killed 90% of the parasites (ED90=13,08 μg/mL) in which integument damages were intense. In addition, the analysis by molecular docking can observe that the inhibition of the enzyme was not performed directly on site, and that the best interaction energies with 7-epi were in a cavity near the site and in the dimer’s junction. Finally, quantitative analyzes were made by qPCR of mRNA from SOD of the parasite, that results showed no significant change in enzyme transcription after the 7-epi action. Although there is an impact on the activity of SOD of S. mansoni, this does not seem to be 7-epi main mechanism of action. Thus, it is essential the inhibitory evaluation of this compound in other parasite enzymes as well as the analysis of other non-enzymatic mechanisms that elucidate the action of 7-epi in adult worms of S. mansoni. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

A doença do sono é causada pelo parasita Tripanosoma brucei. Considerada uma doença negligenciada, mata milhares de pessoas todos os anos na África subsaariana. O T.brucei não apresenta resposta imune pronunciada, o que dificulta o desenvolvimento de vacinas, e os medicamentos disponíveis são escassos. Os tripanossomatídeos são comprovadamente sensíveis ao stress oxidativo causado pelo radical superóxido. Assim, as enzimas superóxido dismutases (SODs) são a primeira linha de defesa contra esse radical. As SODs são metalo enzimas (EC 1.5.1.1) capazes de catalisar a dismutação do superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio. São classificadas de acordo com o metal incorporado na estrutura: cobre e zinco (CuZnSOD), ferro ou manganês (Fe/MnSOD) e níquel (NiSODs). Neste trabalho de mestrado, a enzima TbFeSODB2 de T.brucei foi, expressa, purificada, cristalizada e teve sua estrutura resolvida. A estrutura cristalográfica da enzima do parasita foi comparada com a enzima humana análoga contendo manganês (HuMnSOD), onde foram evidenciadas as principais diferenças entre as duas estruturas que podem ser exploradas para o desenho do novos inibidores seletivos. Foi realizada uma análise de acoplamento estatístico, onde com base em um alinhamento múltiplo dessas enzimas determinou-se resíduos que são capazes de interferir na seletividade do metal incorporado e estado oligomérico das SODs. / Sleeping sickness, caused by the parasite Tripanosoma brucei, is considered a neglected disease, killing thousands of people every year in subsaharian Africa. T. brucei does not generate a pronounced immune response, difficulting the development of vaccines. Furthermore, available medicines are scarce. Tripanosomatides are known to be sensitive to oxidative stress caused by the superoxide radical. Therefore, the superoxide dismutase enzymes (SODs) are a primary line of defence for the parasites against this radical. SODs are metalloenzymes (EC 1.5.1.1) capable of catalyzing superoxide dismutation into molecular oxygen and hydrogen peroxide. SODs are classified according to the incorporated metal: copper/zinc (CuZnSOD), iron/manganese (Fe or MnSOD) and nickel (NiSODs). In the work presented here, TbFeSODB2 from T. brucei was expressed, purified, crystallized and its 3D structure solved. The crystal structure of the parasite enzyme was compared to the homologous human enzyme containing manganese (HuMnSOD), revealing evidence for differences between both structures which could be exploited in the design of new selective inhibitors. In addition, a statistical coupling analysis was performed on the entire Fe/MnSOD superfamily, based on a multiple sequence alignment. It was shown that this technique was able to identify novel residue determinants of metal selectivity and oligomeric state.

Iron/Manganese superoxide dismutases (Fe/Mn-SODs) are metalloenzymes with highly conserved protein folds, active sites, and dimer interfaces. They protect cells against oxidative stress by catalyzing the conversion of the cytotoxic free radical superoxide to molecular oxygen and hydrogen peroxide. The majority are highly specific for the type of metal (iron or manganese) present within the active site. However, there are many key aspects of metal specificity and catalytic activity that lack a structural explanation. Computational analyses suggested that several residues are important for fine-tuning the redox potential of the metal in the active site and thereby the catalytic activity. The main objective of this thesis is to evaluate the influence of several point mutations (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G and Q172D) and one double mutation (Q149G+G74Q)) in terms of metal specificity, catalytic activity and three-dimensional structure using the superoxide dismutase from Trichoderma reesei (TrSOD) as a model system. The corresponding genes were cloned, expressed and the resulting proteins characterized by X-ray crystallography, electron paramagnetic resonance (EPR), atomic absorption spectroscopy (AAS), dynamic light scattering (DLS) and their enzymatic activity determined. The native protein was shown to be able to use either Mn or Fe (5000 units/mg and 500 units/mg, respectively) for catalysis suggesting it to be properly classified as cambialistic. Structures for native TrSOD and the Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G and Fe-M27V, Mn-M27V mutants were solved at 2.3 &Aring;, 2.0 &Aring;, 2.03 &Aring;, 2.0 &Aring;, 1.85 &Aring;, 1.4 &Aring; and 1.6 &Aring; resolution, respectively. The H75I, L80F and M27V mutations are easily accommodated by small local structural changes to the three-dimensional structure. On the other hand, the G73A mutation destabilize one of the dimer-dimer interfaces of the tetramer making it possible for two distorted tetramers to interact forming an octamer. This enzyme also lost all catalytic activity probably due to resulting exposure of the active site consistent with the observation of a sixth ligand (solvent molecule) bound to the metal in one subunit. The D150G mutant remained tetrameric but with reduced symmetry related to the rearrangement of the last helix (H9). Our results show that a large impact on activity and oligomerization of TrSOD can be generated by a single amino acids substitution in some cases and provide some insights into our understanding of the structural details associated with the metal ion specificity and oligomerization in superoxide dismutases. / Superóxido dismutases de ferro e manganês (Fe/Mn-SODs) são metaloenzimas com enovelamentos, sítios ativos e interfaces diméricas altamente conservados. Estas enzimas protegem as células contra o estresse oxidativo pela conversão do ânion superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio. A maioria são altamente específicas pelo tipo de metal (ferro ou manganês) presente no sítio ativo. Entretanto, existem vários aspectos críticos sobre a especificidade pelo metal e da atividade catalítica que ainda não foram explicados em termos estruturais. Análises computacionais sugerem que vários resíduos são importantes para o ajuste do potencial redox do metal no sitio ativo e, portanto, a atividade catalítica. O objetivo principal deste trabalho é avaliar a influência de mutações simples (TrSOD) (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G e Q172D) e dupla (Q149G + G74Q) em superóxido dismutases de Trichoderma reesei em termos de especificidade pelo metal, atividade catalítica e estrutura. Os genes correspondentes foram clonados, expressos e as proteínas resultantes caracterizadas por cristalografia de raios-X, ressonância paramagnética electrónica (EPR), espectroscopia de absorção atómica (AAS), dispersão de luz dinâmica (DLS), e a atividade enzimática foi determinada. Foi mostrado que a proteína nativa é capaz de usar tanto Mn quanto Fe (5000units/mg e 500units/mg, respectivamente) para catálise sugerindo que deveria ser a classificada como enzima cambialistica. Estruturas da enzima nativa e mutantes (Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G, Fe-M27V e Mn-M27V) foram resolvidas a resoluções de 2.3 &Aring;, 2.0 &Aring;, 2.03 &Aring;, 2.0 &Aring;, 1.85 &Aring;, 1.4 &Aring; e 1.6 &Aring; respetivamente. As mutações H75I, L80F e M27V são acomodadas facilmente por reajustes locais na estrutura tridimensional. Por outro lado, a mutação G73A desestabiliza uma das interfaces dímero-dímero do tetrâmero levando à formação de um octâmero feito por dois tetrâmeros distorcidos. Esta enzima também perde atividade provavelmente devido a um aumento na acessibilidade do sítio ativo, coerente com a observação de um sexto ligante (molécula de solvente) coordenando o metal em uma das subunidades. O mutante D150G continuou tetramérica mas com simetria reduzida relacionado com o rearranjo da última hélice (H9). Estes resultados mostram que, em alguns casos, uma mutação simples pode ter um impacto significativo no estado oligomérico e atividade catalítica da proteína TrSOD e fornece conhecimentos para a nossa compreensão dos detalhes estruturais associados com a especificidade de íons metálicos e oligomerização em superóxido dismutases.

Introdução: O Diabetes Mellitus é doença que apresenta elevada incidência e prevalência na população em diversas partes do mundo. Estudos experimentais sugerem que o estresse oxidativo esteja envolvido na patogênese e na progressão dela. Objetivo: Investigar os efeitos da utilização exógena do antioxidante orgoteína (SOD Cu/Zn) sobre o estresse oxidativo, ativação do fator de transcrição nuclear kappa B (NFκB) e expressão da óxido nítrico sintase induzível (iNOS) hepática no modelo experimental de diabetes mellitus (DM). Métodos e Resultados: Foram utilizados 28 ratos machos Wistar, divididos em quatro grupos: controle (CO), controle tratados com orgoteína (CO+ORG), diabéticos (DM) e diabéticos tratados com orgoteína (DM+ORG). A dose utilizada da ORG (orgoteína ®) foi de 13 mg/Kg de peso corporal durante os sete últimos dias de experimento através de injeção subcutânea. O DM foi induzido por injeção de estreptozotocina (i.p.,70 mg/kg) e, após sessenta dias, foi avaliada a lipoperoxidação hepática através das substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS- nmoles/mg de proteína), a atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT-pmoles/mg de proteína), superóxido dismutase (SOD-U/mg de proteína) e glutationa peroxidase (GPx- nmoles/mg de proteína). Também foi realizada a medida de nitritos e nitratos (mM de NO2 e NO3). As expressões da p65 do NFκB e da iNOS foram avaliadas pela técnica de Western blot e quantificadas por densitometria em relação à percentagem do controle. Resultados: Houve aumento na lipoperoxidação hepática no grupo DM e redução significativa no grupo DM+ORG (0,36±0,15 vs 0,18±0,04; p<0,01). A atividade da enzima CAT apresentou aumento no grupo DM e redução significativa no grupo DM+ORG (p<0,001), enquanto a atividade da SOD e da GPx apresentaram redução no DM e aumento no grupo DM+ORG, respectivamente (p<0,001 e p<0,05). A medida de nitritos e nitratos apresentou redução no DM e aumento no grupo DM+ORG (1,47±0,61 vs 2,29±0,20; p<0,05) enquanto a expressão da iNOS foi 32% maior no grupo DM em relação ao grupo CO e 53% maior no grupo DM+ORG, quando comparado com o grupo DM (p<0,01). A p65 foi 37% mais expressa no DM (p<0,05) e sem diferença estatística, quando comparado o grupo DM com o grupo DM+ORG. Conclusão: O tratamento com orgoteína reduziu o estresse oxidativo hepático em animais diabéticos, mesmo não alterando o fator de transcrição nuclear NFкB. A orgoteína também aumentou a bioatividade do NO, provavelmente, devido ao aumento da atividade, dismutando o radical superóxido, e devido ao aumento da expressão da iNOS. / Aim: To investigate the effects of exogenous antioxidant orgoteína on oxidative stress, activation of nuclear transcription factor kappa B (NFκB), and hepatic expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the experimental model of diabetes mellitus (DM). Methods: 28 male Wistar rats divided in four groups were used: control (CO), controls treated with orgoteína (CO+ORG), diabetics (DM), and diabetics treated with orgoteína (DM+ORG). Orgoteína (orgotein®, 13 mg/Kg body weight was administered subcutaneously for the last 7 days of the trial. DM was induced by a single streptozotocin injection (i.p.,70 mg/kg), and 60 days later, we evaluated liver lipoperoxidation through thiobarbituric acid reactive substances (TBARS- nmoles/mg of protein) and activity of antioxidant enzymes catalase (CAT-pmoles/mg of preotein), superoxide dismutase (SODU/ mg of protein) and glutathione peroxidase (GPx- nmoles/mg of protein). Nitrites e nitrates (mM NO2 and NO3) were also measured, and p65 of NFκB and iNOS expressions were evaluated by Western blot and quantified by densitometry as compared to control percentage. Results: Liver peroxidation was increased in the DM group and significantly decreased in the DM+ORG group (0.36±0.15 vs 0.18±0.04; p<0.01). CAT activity was increased in the DM group and significantly decreased in the DM+ORG group (p<0.001), whereas SOD and GPx activity were decreased in the DM group and increased in the DM+ORG group, respectively (p<0.001 and p<0.05). Nitrite and nitrate measures were reduced in the DM and increased in the DM+ORG group (1.47±0.61 vs 2.29±0.20; p<0.05), while iNOS expression in the DM group was 32% greater than in the CO and 53% greater in the DM+ORG group than in the DM group (p<0.01). P65 expression was 37% higher in the DM (p<0.05), and there was no significant difference between the DM and DM+ORG groups. Conclusion: Orgoteína treatment reduced liver oxidative stress in diabetic animals, even though it did not change NFкB. Orgoteína also increased NO bioactivity, probably by the increased dismutation of the superoxide radical and by increase in iNOS expression.

Orientador: Giselle Cerchiaro / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2013

Os complexos trans-[Ru(NO)(NH3)4(L)](X)3 (1), [Ru(NO)(Hedta)] (2) e seus precursores sintéticos trans-[Ru(H2O)(NH3)4(L)](X)2 (3), trans-[Ru(SO4)(NH3)4(L)](X) (4) , onde L = isn, nic, imN, 4-pic, py, P(OEt) e X = PF6 - e BF4 -, foram testados como captadores dos radicais livres DPPHo, OHo e O2 -o em meio aquoso. O potencial de oxidação do centro metálico nos complexos (1) foram estimados utilizando eletrodo de diamante dopado com boro como eletrodo de trabalho, estando situados em meio aquoso acima de 2,0 V vs. ECS (CH+ = 1,0 x 10-3, &micro; = 0,1 mol L-1). Os complexos (1) e (2) mostraram-se incapazes de reagir com o radical DPPHo, exceto o complexo trans-[Ru(NO)(NH3)4(P(OEt)3)]3+, que reagiu apenas em grande excesso (50 vezes) em relação ao radical DPPHo. Os complexos (3) reagiram quando em excesso ou em proporção estequiométrica. O mecanismo pelo qual esta reação ocorre é predominantemente o de transferência de elétrons. O radical OHo foi captado pelos complexos (1), sendo provavelmente o mecanismo predominante o de transferência de elétrons pela oxidação do centro metálico [Ru(NO)]3+ a [Ru(NO)]4+, compatível com o potencial de oxidação do radical OHo (acima de 2,8 V vs. ECS) reportado na literatura para este radical. As constantes de velocidade específica para estas reações foram estimadas como estando no intervalo de 108 a 1010 M-1 s-1. Não foi observada reação entre o radical OHo e os complexos (4). Os complexos (1) e (2) captam o radical O2 -o pela redução do ligante NO+ com constantes de velocidade específicas no intervalo de 2,0 ± 1,0 x 104 a 4,2 ± 1,0 x 105 M-1 s-1, em medidas efetuadas via cinética de competição com citocromo c. Após a redução, a liberação de NO foi acompanhada via eletrodo seletivo a NO e espectrofotometricamente pela reação do NO com o citocromo c. Nas condições experimentais utilizadas, não se observou a formação do íon peroxinitrito (ONOO-). Os complexos (3) e (4) não reagiram com o radical O2 -o. / The complexes trans-[Ru(NO)(NH3)4(L)](X)3 (1), [Ru(NO)(Hedta)] (2) and their synthetic precursors trans-[Ru(H2O)(NH3)4(L)](X)2 (3), trans-[Ru(SO4)(NH3)4(L)](X) (4) , where L = isn, nic, imN, 4-pic, py, P(OEt) e X = PF6 - and BF4 -, were tested as scavengers for the radicals DPPHo, OHo e O2 -o in aqueous media. The redox potential for the metal center in the complexes (1) were obtained a using boron doped diamond electrode as working electrode. The redox potentials values for ruthenium nitrosyl complexes were higher than 2,0 V vs. SCE. The complexes (1) and (2) were unable to reduce the radical DPPHo, excepted the complex ion trans-[Ru(NO)(NH3)4(P(OEt)3)]3+. The complexes (3) react with DPPHo in stoichometric proportion. Electron transfer from the oxidation of the ruthenium(II) center seems to be the reaction pathway. The OHo radical reacts with ruthenium nitrosyls, predominantly oxidizing the metal center, yielding the fragment [Ru(NO)]4+. This reaction is exothermic since the redox potential of the OHo is around 2.8 V vs. SCE. From competition kinetics the rate constant for this reaction were estimated in the range of 108 a 1010 M-1 s-1. Since the reaction between OHo radical and the complexes (4) was not observed, the hydrogen atom transfer mechanism for the scavenger of OHo by the nitrosyl complexes ca be ruled out. The complexes (1) and (2) scavenge the radical O2 -o by the reduction of the coordinated nitrosyl with specific rate constants ranging from 2,0 ± 1,0 x 104 to 4,2 ± 1,0 x 105 M-1 s-1 as probed by competitive kinetics using cytochrome c. After reduction, nitric oxide dissociation were probed ampherometricaly using a selective NO electrode or spectrophotometrically using cytochrome c as probe. Reduction of the complexes (3) by superoxide ion was not observed and may suggest the coordinated nitrosonium as the reaction site for reduction.

A atividade de catalase em Candida albicans tem sido sugerida como um mecanismo de resistência ao antifúngico anfotericina B. Neste contexto, poucos são os estudos de enzimas como catalase e superóxido dismutase em leveduras do gênero Candida expostas a diferentes situações. Assim, este estudo teve por objetivo investigar o efeito da exposição de Candida a antineoplásicos, íons metálicos e antifúngicos como fluconazol e anfotericina B sobre a atividade dessas enzimas. Os resultados apontaram que o antineoplásico metotrexato aumentou a atividade da catalase em C. albicans, que íons metálicos como cobre, zinco, manganês e ferro produzem um efeito variável na atividade de superóxido dismutase, bem como, um efeito variável de um íon no acúmulo de outro. Também verificamos através de nossos resultados que a indução de resistência ao fluconazol e anfotericina B aumentam a atividade de catalase e superóxido dismutase em C. albicans e C. dubliniensis. Esses resultados sugerem que o antineoplásico metotrexato e a indução de resistência a anfotericina B e fluconazol podem gerar um estresse oxidativo em leveduras do gênero Candida que possivelmente se adaptam a esse estresse aumentando seus mecanismos de defesa antioxidante. Esse efeito pode induzir a uma maior resistência desses organismos ao ataque de células fagocíticas do hospedeiro. / Catalase is an enzyme that has been suggested to be involved in resistance mechanisms to antifungal drug such as amphotericin B. There are few studies focusing on catalase and superoxide dismutase in yeasts, such as Candida, exposed to different situations. Thereby, the aim of the present study was to investigate the effect of exposing Candida to antineoplastic drugs, metallic ions and antifungial drugs, namely fluconazole and amphotericin B, on catalase and superoxide dismutase activities. Results show that methotrexate induced catalase activity in C. albicans and that metallic ions, such as copper, zinc, manganese and iron produced a variable effect on superoxide dismutase activity of C. albicans, as well as a variable effect in the uptake of one ion on another. We also showed that fluconazole and amphotericin B resistance increased catalase and superoxide dismutase activity in C. albicans and C. dubliniensis. These results suggest that methotrexate as well as the induction of fluconazole- and amphotericin B-resistance may induce oxidative stress in yeasts such as Candida, which may adapt by increasing antioxidant defense mechanisms. This effect may induce a major resistance of this yeast to phagocytic cell attack.