Dissertation thesis is a 5-publications' collection concerning characterization and application potential of cyclodextrins, polysaccharides and macrocyclic antibiotics based chiral stationary phases. The effects of stationary phase and mobile phase are studied. This approach ensures the complex insight into separation systems studied. Systems with different nature of chiral selector were studied by HPLC. Namely, macrocyclic antibiotics and derivatized polysaccharides were used for experiments. Former ones provided better results for enantioseparation of non-coded amino acids than latter ones. Dynamic coating procedure was used for preparation of a new chiral stationary phase. Characterization of new cationic cyclodextrin based chiral stationary phase was performed. Linear free energy relationship method was used for characterization of two different separation systems, i.e. newly prepared stationary phase and commercially available stationary phase. Based on results obtained, newly prepared stationary phase showed better results for separation of different achiral groups of analysts. New stationary phase prepared by dynamic coating was compared with chromatographic system, in which the chiral selector was used as a mobile phase additive. The chiral selector used for the two different approaches was...

L’objectif de ce projet doctoral a été de coupler la chromatographie en phase supercritique (SFC) avec un spectromètre de masse haute résolution pour l’analyse de substances naturelles apolaires. La SFC est une technique dite « verte » contrairement à la chromatographie liquide en phase normale (NPLC), très consommatrice de solvants organiques toxiques pour l’environnement, puisque la phase mobile est principalement constituée de CO2. Le CO2 ayant une faible viscosité, cela implique une diffusivité, des débits élevés et des temps d’analyse courts. Notre attention a été focalisée sur des molécules apolaires : les lipides. Le but était de mettre au point des dosages dans des matrices alimentaires et biologiques et de débuter une approche lipidomique d’étude de la maladie de Parkinson. La première partie a été dédiée au développement du système SFC avec une détection UV, prêté par le constructeur Agilent Technologies. La première étude s’est portée sur 6 composés de la famille des vitamines A. Une phase d’optimisation a été réalisée afin d’obtenir une séparation satisfaisante des composés, en testant différents paramètres chromatographiques comme le type de phase stationnaire ou encore la composition de la phase mobile, afin d’obtenir une résolution optimale. Ensuite, des études de linéarité et de répétabilité ont été réalisées et des limites de détection et de quantification ont été déterminées afin d’obtenir une méthode fiable et robuste. Une deuxième partie a concerné la mise en place du couplage entre la SFC et un spectromètre de masse de type quadripôle-temps de vol (Q-TOF), afin d’améliorer la spécificité et la sensibilité des analyses. Différentes sources d’ionisation ont été utilisées : ESI, APCI et APPI. Chacune des sources présente des modes d’ionisation différents, qui permettent de pouvoir balayer une large gamme de polarité des analytes. Nous avons choisi 8 dérivés de la vitamine E, composés apolaires pour lesquels la SFC paraît être la technique d’analyse idéale. La séparation de ces composés a été optimisée de façon à obtenir une bonne résolution chromatographique et un temps d’analyse minimal. L’ionisation des composés est réalisée avec les 3 sources disponibles en faisant varier les paramètres de sources ou encore le solvant « make-up », de façon à obtenir une sensibilité optimale. La source APPI a été finalement choisie après une étude sur les performances de la méthode. Cette source présente une bonne répétabilité, linéarité et des limites de détection de l’ordre de celles retrouvées dans la littérature par HPLC-MS. Nous avons ensuite réalisé la quantification des ces composés dans 2 types de matrices alimentaire et biologique : l’huile de soja et le plasma de rat. Une troisième partie a été débutée sur le profilage de lipides à polarités variées par SFC-MS. Cette technique se révèle idéale de par la faible polarité de ces composés et leur absence d’absorbance dans le domaine UV. En effet, l’intégrité des lipides peut être altérée suite aux dommages causés par les radicaux libres, qui sont potentiellement impliqués dans de nombreuses maladies neurodégénératives. Il parait primordial de développer des outils analytiques présentant une haute sensibilité et résolution et la possibilité d’accéder aux informations structurales. La source d’ionisation ESI nous a permis de détecter 12 lipides sur les 20 sous-classes analysées en mode positif et 8 lipides en mode négatif. Une application a été réalisée sur un échantillon de plasma humain. Il serait intéressant à l’avenir d’effectuer cette étude en utilisant la source APPI, source propice à l’analyse structurale de lipides et présentant une bonne sensibilité et répétabilité. Ce couplage SFC-MS, présentant une bonne sensibilité et répétabilité, sera par la suite étendu à l’analyse de lipides dans diverses matrices biologiques et pourra à l’avenir être appliqué à l’étude de nouveaux biomarqueurs et au screening rapide d’un grand nombre d’échantillons / The aim of this PhD project was to couple supercritical fluid chromatography (SFC) with a high resolution mass spectrometer for apolar natural compounds analysis. Because mobile phase is principally constituted of CO2, SFC is called “green technic” contrary to normal phase liquid chromatography (NPLC), which uses lot of organic solvents toxic for environment. The CO2 presents a low viscosity, in this way high diffusivity and flow rate, and lower analysis times are obtained. Our work was focused on apolar molecules: the lipids. The aim was to quantify molecules in alimentary and biological matrices and to a lipidomic approach to study Parkinson disease. The first part was to develop the system SFC with a UV detection on a system on loan by Agilent Technologies. This first study was carried out on 6 vitamin A compounds. An optimization of chromatographic parameters has been realized in order to obtain a good separation of the compounds. Then, linearity, repeatability, detection and quantification limits have been determined in order to have a reliable and robust method. A second part concerned the coupling of SFC and a quadrupole time-of-flight mass spectrometer (Q-TOF), in order to improve specificity and sensitivity of analysis. Different ionization sources have been tested: ESI, APCI and APPI. Each ion source presents different ionization mode, which permits to analyze a wide range of polarities of compounds. We have chosen 8 vitamin E derivatives, which are apolar compounds for which SFC seems to be well suited. Separation compounds have been optimized in order to have a good chromatographic resolution and a short analysis time. This compounds ionization is realized with the 3 sources, varying ionization parameters and make-up solvent, to have an optimal sensitivity. The APPI source has been chosen after a performance evaluation method. This source presents a good repeatability, linearity and detection limit in the same order of magnitude than those found in the literature by HPLC-MS. Then we have quantified these compounds in alimentary and biological matrices: a soya oil and plasma rat. A third study has been started on lipid profiling with various polarities by SFC-MS. This technic is well suited because of the low polarity of this molecules and their lack of absorbance in the UV range. The integrity of lipids can be altered with damages caused by free radicals, and are potentially involved in neurodegenerative diseases. It is essential to develop analytical systems with a high sensitivity and resolution and the possibility to access to structural information. The ESI source permits to detect 12 lipids on the 20 sub-classes analyzed in positive ion mode and 8 lipids in negative mode. An application has been realized on human plasma. In the future, it will be interesting to analyze these lipids with the APPI source, which is good choice for structural analysis of lipids, with good sensitivity and repeatability. Studies with this SFC-MS system, presenting good sensitivity and repeatability, will be extended to lipid analysis in biological matrices and could be applied to new biomarkers study and for fast screening of a large number of samples

Les plantes médicinales constituent une source inexhaustible de composés (des produits naturels - PN) utilisé en médecine pour la prévention et le traitement de diverses maladies. L'introduction de nouvelles technologies et méthodes dans le domaine de la chimie des produits naturels a permis le développement de méthodes ‘high throughput’ pour la détermination de la composition chimique des extraits de plantes, l'évaluation de leurs propriétés et l'exploration de leur potentiel en tant que candidats médicaments. Dernièrement, la métabolomique, une approche intégrée incorporant les avantages des technologies d'analyse moderne et la puissance de la bioinformatique s’est révélé un outil efficace dans la biologie des systèmes. En particulier, l'application de la métabolomique pour la découverte de nouveaux composés bioactifs constitue un domaine émergent dans la chimie des produits naturels. Dans ce contexte, le genre Acronychia de la famille des Rutaceae a été choisi sur la base de son usage en médecine traditionnelle pour ses propriétés antimicrobienne, antipyrétique, antispasmodique et anti-inflammatoire. Nombre de méthodes chromatographiques modernes, spectrométriques et spectroscopiques sont utilisées pour l'exploration de leur contenu en métabolites suivant trois axes principaux constituant les trois chapitres de cette thèse. En bref, le premier chapitre décrit l’étude phytochimique d’Acronychia pedunculata, l’identification des métabolites secondaires contenus dans cette espèce et l'évaluation de leurs propriétés biologiques. Le deuxième chapitre vise au développement de méthodes analytiques pour l'identification des dimères d’acétophénones (marqueurs chimiotaxonomiques du genre) et aux stratégies utilisées pour la déréplication de ces différents extraits et la caractérisation chimique des composés par UHPLC-HRMSn. Le troisième chapitre se concentre sur l'application de méthodologies métabolomique (RMN et LC-MS) pour l'analyse comparative (entre les différentes espèces, origines, organes), pour des études chimiotaxonomiques (entre les espèces) et pour la corrélation des composés contenus avec une activité pharmacologique. / Medicinal plants constitute an unfailing source of compounds (natural products – NPs) utilised in medicine for the prevention and treatment of various deceases. The introduction of new technologies and methods in the field of natural products chemistry enabled the development of high throughput methodologies for the chemical composition determination of plant extracts, evaluation of their properties and the exploration of their potentials as drug candidates. Lately, metabolomics, an integrated approach incorporating the advantages of modern analytical technologies and the power of bioinformatics has been proven an efficient tool in systems biology. In particular, the application of metabolomics for the discovery of new bioactive compounds constitutes an emerging field in natural products chemistry. In this context, Acronychia genus of Rutaceae family was selected based on its well-known traditional use as antimicrobial, antipyretic, antispasmodic and anti-inflammatory therapeutic agent. Modern chromatographic, spectrometric and spectroscopic methods were utilised for the exploration of their metabolite content following three basic axes constituting the three chapters of this thesis. Briefly, the first chapter describes the phytochemical investigation of Acronychia pedunculata, the identification of secondary metabolites contained in this species and evaluation of their biological properties. The second chapter refers to the development of analytical methods for the identification of acetophenones (chemotaxonomic markers of the genus) and to the dereplication strategies for the chemical characterisation of extracts by UHPLC-HRMSn. The third chapter focuses on the application of metabolomic methodologies (LC-MS & NMR) for comparative analysis (between different species, origins, organs), chemotaxonomic studies (between species) and compound-activity correlations.