Os surfatantes são substâncias químicas que têm uma ampla aplicação industrial principalmente como matéria-prima na fabricação de detergentes. No entanto, estas substâncias de origem sintética podem ser substituídas por biossurfatantes (BS), já que estes são biodegradáveis, menos tóxicos para o meio ambiente e além de estáveis em condições extremas de pH, temperatura e salinidade. O alto custo de produção dos BS inviabiliza até o presente momento a substituição dos surfatantes químicos (mais tóxicos). Pesquisadores acreditam que a produção de BS tenha que atingir custos abaixo de 5 dolares/lb para serem economicamente viáveis. Uma das estratégias usadas para diminuir o custo da produção de BS, é usar diferentes subprodutos agrícolas e industriais. Os resíduos de natureza celulósica vêm ganhando espaço nos últimos anos como fontes de carbono alternativas para produtos de base biotecnológica, devido principalmente a sua abundância na natureza e ao apelo das tecnologias sustentáveis. O sisal é uma fonte lignocelulósica de rápido ciclo de crescimento que contém alto teor de celulose vegetal, e que é encontrado em grandes quantidades no Brasil. Este projeto teve como objetivo a produção de biossurfatante por Bacillus subtilis ATCC 21332, utilizando como fonte de carbono o hidrolisado lignocelulósico ácido e enzimático obtido da polpa de sisal. A produção do BS no substrato alternativo proposto foi comparada com a produção em meio de cultivo convencional (glicose). Os BS sintetizados foram avaliados quanto às propriedades físico-químicas: concentração micelar crítica (CMC), tensão superficial (TS) e tensão interfacial (TI). O BS obtido a partir da fermentação do hidrolisado enzimático apresentou TS = 28,71 mN.m-1; TI = 3,81 mN.m-1; e CMC = 64,0 mg.L-1; e aquele produzido a partir da fermentação do hidrolisado ácido apresentou TS = 29,79 mN.m-1; TI = 5,70 mN.m-1; e CMC = 1394,0 mg.L-1. Os valores de tensão superficial inferiores a 30 mN.m-1 indicaram que o hidrolisado ácido e enzimático da polpa de sisal oferecem boas condições como substratos alternativos para a produção de surfactina. As soluções dos BS obtidos em hidrolisado ácido e enzimático removeram 79,96% e 70,35% do óleo diesel de areia contaminada respectivamente, evidenciando-se o potencial para biorremediação. / The surfactants are chemical products that have huge industrial applications, mainly as raw materials in detergent industry. However, these synthetic substances can be replaced by biosurfactants (BS), since they are biodegradable, less toxic and stable at a wide range of pH, temperature and salt concentrations. In spite of these favorable characteristics, the high production costs of BS difficult their use as substitutes to synthetic surfactants (more toxic). If the production costs were less than 5 dollar/lb, their commercialization of BS would be possible. One strategy that permits reducing costs is the use of alternatives substrates from different industries such as byproducts or wastes from agricultural processing units. The lignocellulosic residues are one the most abundant sources of renewable organic carbon, for this reason in the last years, they began to be used as an unconventional carbon source for the synthesis of biotechnology products. Sisal is a lignocellulosic source that growths rapidly and is found in high quantity in Brazil. The objective of this study was the production of biosurfactant by Bacillus subtilis ATCC 21332, using as carbon source enzymatic and acid hydrolysates obtained from sisal pulp. The production using the alternative substrates was evaluated and compared with the production in conventional medium. The critical micelle concentration (CMC), surface tension (TS) and interfacial tension (IT) of the BS were evaluated, the following values were obtained for surfactin synthesized through the fermentation with enzymatic hydrolysate: TS = 28.71 mN.m-1, TI = 3.81 mN.m-1 and CMC = 64.0 mg.L-1. When the acid hydrolysate was used as carbon source the physical-chemical properties were TS = 29.78 mN.m-1, TI = 5.70 mN.m-1 and CMC = 1394.0 mg.L-1. Surface tension values lower than 30.0 mN.m-1 demonstrated that enzymatic and acid hydrolysate offer good conditions as alternative substrates for biosurfactant production. The surfactin synthesized exhibited potential for bioremediation; washing soil with BS obtained in acid and enzymatic hydrolysate removed 80% and 70% of diesel from contaminated sand, respectively.

Biosurfactants are naturally occurring surface active compounds with unique properties such as biodegradability, low toxicity and tolerance to extreme conditions. These unique properties promote their use as alternatives to traditional petrochemical and oleochemical surfactants, as they satisfy requirements for environmentally friendly manufacturing processes. However, the cost of biosurfactants is still significantly higher than chemical surfactants which hinders their large-scale commercialisation. This work presents an investigation into the production of surfactin, a lipopeptide biosurfactant, exploiting its foamability characteristics for the design and implementation of a recirculating continuous foam fractionation column operated in parallel with a bioreactor. Surfactin is a powerful amphiphilic compound produced by Bacillus subtilis. It is a plant-elicitor with antimicrobial properties offering a huge potential in the food and agricultural industries. However, surfactin has extreme foamability even at low concentrations. This foamability can lead to production problems such as large volumes of uncontrolled overflowing foam with significant product and biomass losses. Here, it is demonstrated that this overflow can be controlled, or eliminated, by integrating a foam fractionation system to the bioreactor in a recirculating loop. A dual production and separation process was engineered and enabled reaching high surfactin productivity in a controlled manner. After elucidating the surface properties of surfactin-rich broth, a foam fractionation column was designed for bench-scale production. Operation of the recirculating column in parallel with the bioreactor enabled air flow to be independently controlled for each unit. Surfactin solutions of various concentrations were tested to relate foamability to concentration over a range of bubble sizes. The sintered glass pore size was revealed to be the main factor influencing the enrichment, with a positive correlation with increasing pore size. Characterisation of the fermentation production rate enabled fractionation column air flow rate to be controlled to ensure sufficient foam surface area for product adsorption. The airflow rate was identified as the main factor impacting on the surfactin recovery rate. This characterisation enabled broth feed flow rate to be controlled to balance the removal rate with the production rate. Two processes were created coupling the newly designed fractionation column with the bioreactor operated either in aerated or non-aerated conditions. Under aerated settings, controlled surfactin production was successfully achieved at a productivity of 0.0019 g L-1 h-1 whilst simultaneously recovering 91% of the product at a maximum enrichment of 79 and 116 through the column and overflow routes, respectively. Under non-aerated settings, overflowing foam was fully avoided and 90% of the product was recovered solely through the fractionation column at an enrichment ratio of 40 under non-optimised settings. Additionally, up to 14% (g/g) increase in surfactin production was observed with the coupling of the fractionation column demonstrating a further benefit as a bioprocess intensifying device for surfactin production. This work provides a benchmark for a robust system for surfactin production, substantially improving the productivity at bench scale, potentially leading the way to more productive and less costly industrial processes for surface active compounds in a wide range of industrials fields.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os surfactantes sÃo molÃculas anfipÃticas, que possuem em sua estrutura quÃmica segmentos hidrofÃbicos e hidrofÃlicos, espacialmente separados que auxiliam na formaÃÃo de emulsÃes e disponibilizam compostos à cÃlula microbiana. Em funÃÃo dessas caracterÃsticas, os emulsificantes reduzem a tensÃo superficial na interface das fases imiscÃveis, permitindo, portanto, que elas se misturem, formando a emulsÃo. Muitos tipos de surfactantes quimicamente sintetizados sÃo hoje utilizados, embora o desenvolvimento de produtos alternativos, biodegradÃveis e menos tÃxicos, como os chamados biossurfactantes, agentes obtidos por via microbiolÃgica, seja uma estratÃgia importante na obtenÃÃo de componentes mais compatÃveis com o meio ambiente e na ampliaÃÃo das propriedades especÃficas e aplicaÃÃes desses compostos. Nesse contexto, o presente trabalho tem como objetivo, caracterizar o biossurfactante produzido por Bacillus subtilis LAMI005 utilizando suco de caju como fonte de carbono, ao realizar estudos de conformaÃÃo e estrutura dos compostos, determinando assim os grupos funcionais pertencentes à molÃcula; estudar os efeitos toxicolÃgicos da surfactina produzida, visando um maior entendimento sobre a toxicidade do biossurfactante em organismos vegetais e animais; avaliar a manutenÃÃo das caracterÃsticas tensoativas da surfactina ao ser submetida a diferentes condiÃÃes ambientais, alÃm de estudar a estabilidade das emulsÃes formadas com o biossurfactante que foi produzido em suco de caju clarificado, agregando-se valor ao processo, uma vez que a fonte utilizada à disponÃvel e de baixo custo. Os espectros obtidos indicaram a similaridade entre a surfactina produzida neste trabalho e a surfactina padrÃo (Sigma). O lipopeptÃdeo produzido apresentou atividade superficial altamente estÃvel, com uma CMC igual a 12,5 mg.L-1 e sendo capaz de reduzir a tensÃo superficial da Ãgua para 31,8 mN.m-1 e a tensÃo interfacial do n-hexadecano para 2 mN.m-1. A habilidade de emulsificaÃÃo a altas temperaturas, pHs Ãcidos e bÃsicos e diferentes concentraÃÃes de NaCl tambÃm foi demonstrada. Os diagramas de fase mostraram a possibilidade de aplicaÃÃo do biossurfactante na biorremediaÃÃo, no tratamento de resÃduos e em fluidos de corte. O biossurfactante tambÃm apresentou atÃxico quando analisado frente à Artemia salina com CL50 igual 612,27 μg.mL-1 e frente Lactuca sativa, no qual apresentou Ãndice de germinaÃÃo superior a 80% em concentraÃÃes elevadas, evidenciando seu potencial para aplicaÃÃes na indÃstria de cosmÃticos, alimentos e fÃrmacos. O biossurfactante produzido tambÃm se mostrou eficiente ao remover, aproximadamente, 82% do diesel e 77% do petrÃleo adsorvidos em areia. / The surfactants are amphipathic molecules which have in their chemical structure hydrophobic and hydrophilic segments, spatially separated to assist in the formation of emulsions available compounds and the microbial cell. Due to these characteristics, the emulsifiers decrease the surface tension at the interface of immiscible phases, allowing thus that they mix to form the emulsion. Many types of chemically synthesized surfactants are used used today, although the development of alternative products, less toxic and biodegradable, as so-called biosurfactants obtained by microbiological agents, is an important strategy in obtaining components more compatible with the environment and expanding specific properties and applications of these compounds. In this context, this study aims to characterize the biosurfactant produced by Bacillus subtilis LAMI005 using cashew apple juice as carbon source, to conduct studies of the structure and conformation of the compounds, thereby determining the functional groups belonging to the molecule, to study the toxicological effects of surfactin produced, designed to further understanding of the toxicity of the biosurfactant in vegetable and animal organisms; evaluate the maintenance of the characteristics of surfactants surfactin to be subjected to different environmental conditions, in addition to studying the stability of emulsions formed with biosurfactant which was produced in clarified cashew juice, adding value to the process, since the source used is available and inexpensive. The spectra obtained indicated the similarity between this work produced surfactin and surfactin standard (Sigma). The lipopeptide surface produced had a highly stable activity, with a CMC 12.5 mg.l-1 and capable of reducing the surface tension of water to 31.8 mN.m-1 and interfacial tension of n-hexadecane to 2 mN.m-1. The ability of emulsifying at high temperatures, acidic and basic pH and different concentrations of NaCl was also demonstrated. The phase diagrams shown the possibility of application of the biosurfactant in the bioremediation of waste treatment and cutting fluids. The biosurfactant also showed non-toxic when analyzed in the brine shrimp with LC50 equal to 612.27 Âg.mL-1 forward and Lactuca sativa, presented at which germination index higher than 80% high concentrations, demostrating its potential for applications in the cosmetics industry , food and drugs. The biosurfactant produced also efficient in removing, approximately, 82% diesel and 77% petroleum adsorbed on sand.

Orientador: Gláucia Maria Pastore / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-17T02:50:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_DianeTeode_D.pdf: 21600008 bytes, checksum: 9d2d940e83841a4b2fb091014e2703ef (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O lipoheptapeptídeo cíclico surfactina é produzido por diferentes cepas de Bacillus subtilis. Em uma concentração de 20 mM, a surfactina é capaz de reduzir a tensão superficial da água de 72 mN/m para 27 mN/m. Isto faz da surfactina o biossurfactante com maior potencial conhecido. O conjunto multienzimático, responsável pela síntese da surfactina, consiste de três grandes NRPSs: SrfA-A (402kDa), SrfA-B (401kDa) e SrfA-C (144 kDa), compreendendo um total de sete módulos. Os genes NRPSs correspondentes estão organizados no operon srfA. A produção de surfactina por B.subtilis é usualmente baixa e a produção em sistemas de expressão heterólogos como E.coli não é viável. Portanto, uma opção para aumentar a produção de surfactina seria o uso de sistemas de expressão utilizando o próprio Bacillus, colocando o operon srfA sob controle de um forte promotor que pode funcionar independentemente da regulação por feedback negativo endógeno. Para esta proposta, o promotor nativo do operon responsável pela síntese da surfactina em B.subtilis LB5a foi substituído pelo promotor Pgrac, o qual pode ser induzido por análogos de lactose. Este sistema de expressão é baseado em um forte promotor que não é inibido por fatores endógenos e, deve fornecer uma nova ferramenta para produzir altos níveis de surfactina em Bacillus subtilis. A eficácia do lipopeptídeo produzido pela cepa recombinante de B.subtilis pGrac-SrfA foi demonstrada usando testes de atividade hemolítica e avaliação da tensão superficial do meio. Os picos do lipopeptídeo obtido por HPLC para a cepa recombinante pGrac-SrfA apresentaram perfis semelhantes aos obtidos a partir da cepa selvagem. Análises de espectrometria de massas confirmaram a presença de uma série homóloga de lipopeptídeos com variações no tamanho da cadeia hidrocarbônica caracterizando o composto como surfactina. Verificou-se a predominância do homólogo de massa molecular de 1000,18 u. A produção de surfactina pela cepa de B.subtilis recombinante foi cerca de 57% superior ao da cepa selvagem, quando induzida por isopropil b-D-1-tiogalactopiranosídeo / Abstract: The cyclic lipoheptapeptide surfactin is produced by different Bacillus subtilis strains. At a concentration of 20µM, this biosusrfactant is able to reduce the surface tension of water from 72 mN/m to 27 mN/m. This makes surfactin one the most powerful biosurfactants known so far. The surfactin synthetase is a large multienzyme complex consisting of three enzymatic subunits, SrfA (402 kDa), SrfB (401 kDa), and SrfC (144 kDa), comprising of a total of seven modules. The corresponding NRPS genes are organized in the srfA operon. Surfactin production from Bacillus strains is usually low and production of such large proteins in a heterologous system such as E. coli is not viable. One option to improve surfactin production would be to use Bacillus subtilis itself as an expression system and to place the srfA operon under the control of a strong promoter that can function independently of endogenous negative feedback regulation. For this purpose, the native promoter of the surfactin operon in B.subtilis LB5a was replaced by the promoter Pgrac, which can be induced by lactose analogs. This expression system is based on a strong promoter and is not expected to be inhibited by endogenous factors and, should provide a new tool for producing higher levels of surfactin in Bacillus subtilis.The efficacy of the lipopeptide produced for the recombinant B.subtilis pGrac-SrfA was demonstrated using tests of hemolytic activity and evaluation of the surface tension of the medium. HPLC peaks of surfactin gotten of the genetically modified strain showed patterns of lipopeptides similar to those of the wild-type strain, and mass spectrometry analysis confirmed the presence of a lipopeptide homologous serie with variations in the hydrocarbon chain length, known as surfactin. Was verified the predominance of a homologue with a molecular mass of 1000.18 u. The surfactin production of the recombinant bacterium was up to about 57% greater than that of wild-type strain when it was induced by isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Lúcia Regina Durrant / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-16T00:44:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Faria_AndreiaFonsecade_D.pdf: 11493166 bytes, checksum: e3cd66f7090b963f62e89ca35a7c600a (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Os biossurfactantes são compostos amplamente estudados em todo o mundo. Suas características o tornam muito atrativo em relação aos surfactantes sintéticos. Dentre essas características podemos citar, a baixa toxicidade, boa compatibilidade com a pele e olhos, biodegradabilidade e produção a partir de substratos renováveis. No entanto, o custo de produção dos biossurfactantes ainda inviabiliza sua produção em escala industrial. Tradicionalmente, os hidrocarbonetos têm sido os substratos escolhidos para a produção de biossurfactantes e bioemulsicadores. É assumido que a produção de biossurfactantes é induzida para tornar o substrato hidrofóbico acessível a célula. Contudo, substratos solúveis em água também podem ser utilizados para a produção dos surfactantes biológicos. Esses últimos são mais baratos do que os hidrocarbonetos e preferidos em processos fermentativos, devido ao fato de que as fermentações monofásicas são mais simples do que as fermentações bifásicas. Além disso, o uso de hidrocarbonetos são inaceitáveis para a produção de biossurfactantes destinados a aplicações em alimentos, cosméticos e produtos farmacêuticos. Uma grande variedade de matérias-primas estão atualmente disponíveis como substrato orgânico para fermentações industriais, dentre as quais podemos destacar os resíduos agroindustriais. Essas matérias-primas possuem vantagens de serem encontradas em excesso e produzidas em regiões de clima tropical ou temperado. Atualmente, com o aumento da demanda de produção de biodiesel, o glicerol tem ganhado atenção no cenário de bioprocessos, demonstrando ser uma matéria-prima de grande disponibilidade para produção de biomoléculas de interesse industrial. Segundo a Agência Nacional de Petróleo (ANP-Brasil), o Brasil é ranqueado como o maior produtor e consumidor de biodiesel do mundo: 1,2 bilhões de litros/ano em 2008, gerando de 120.000 toneladas de glicerina residual nesse processo. Logo, o presente trabalho teve como objetivo selecionar um substrato orgânico de baixo custo, de forma a tornar viável a produção e comercialização dos biossurfactantes em larga escala. Dentre as 19 linhagens microbianas avaliadas, o microrganismo Bacillus subtilis LSFM_05 foi selecionado para a produção de biossurfactantes, utilizando glicerina residual bruta como substrato orgânico. A temperatura de 32oC e concentração de glicerina de 5% v/v foram designadas como condições ótimas para a produção de biossurfactantes, através do planejamento experimental. A produção dos biossurfactantes foi realizada em fermentador um litro nas rotações de 150, 250 e 350 rev.min -1. A fermentação conduzida à 250 rev.min-1 apresentou melhor desempenho na formação de espuma e produção de biossurfactante. Em seguida, essa condição foi reproduzida em fermentador de 10 litros, que apresentou rendimento de 0,69 g.L-1. Após a execu-ção dos processos fermentativos, os biossurfactantes foram recuperados por precipitação ácida, puri_cados em coluna de adsorção e caracterizados utilizando Espectrometria no Infravermelho com Transformada de Fourier (IV-FT), Espectrometria de Ressonância Magnética (1H e 13C RMN) e Espectrometria de Massa (ESI-MS/MS). O biossurfactante foi caracterizado como uma isoforma do lipopeptídio surfactina, contendo 14 átomos de carbono na cadeia lipídica e sete aminoácidos do anel peptíco. A espectrometria de massa foi capaz de elucidar a composição e sequência de aminoácidos do peptídio cíclico GluOMe(1)/Leu(2)/Leu(3)/Val(4)/Asp(5)/Leu(6)/Leu(7) e os espectros de 1H e 13C - RMN foram de extrema importância para comprovar a esteri_cação do aminoácido ácido glutâmico. O microrganismo Bacillus subtilis LSFM_05 também foi caracterizado como co-produtor de fengicina. A espectrometria de massa apresentou ser uma técnica sensível e rápida para a caracterização dos homólogos A e B de fengicina. A surfactina C14/Leu7 foi avaliada com relação a toxicidade ambiental sobDaphnia similis, apresentando EC50 em 1500 mg.L-1. A surfactina apresentou atividade antiviral contra o vírus envelopado Herpervirus bovino (BoHV-1), inibindo 100% da infectividade do vírus na concentração de 0,25 _M, porém, não apresentou atividade antimicrobiana para os microrganismos avaliados até a concentração de 1mg.mL-1. A surfactina também foi avaliada com relação a citotoxicidade sob _broblastos c3T3 de camundongos, e o valor de EC50 não foi determinado na faixa de concentração estudada, indicando níveis de toxicidade para esse tipo de célula. No âmbito na nanotecnologia, o extrato bruto contendo os biossurfactantes mostrou-se uma ferramenta útil na dispersão de nanotubos de carbono, em água de cultivo de Daphnia, tornando possível o estudo de ecotoxicologia desses nanomateriais / Abstract: In recent years biosurfactants have attracted considerable attention because they o_er several advantages in comparison with synthetic surfactants: low toxicity, greater biodegradability, better environmental compatibility, greater foaming, speci_c activity at extreme temperatures, pH and salinity, and the possibility of being produced from renewable sources and industrial wastes However, biosurfactants have not yet been employed extensively in industry because of their relatively high production and recovery costs. The cost can be reduced by strain improvement, optimizing medium composition by statistical methods or by using alternative inexpensive substrates. Traditionally, hydrocarbons have been the substrates of choice to produce biosurfactants and bioemulsi_ers. It is assumed that surfactant production is induced to render hydrophobic substrates accessible to the cell, but water-soluble substrates such as molasses, cassava waste-water and potato substrates have also been used for biosurfactant production. The latter are cheaper than hydrocarbons and are the preferred substrates, because single-phase fermentation is simpler than biphasic fermentation and in addition the hydrocarbon substrates are unacceptable for many applications, such as in foods, cosmetics and pharmaceutical products. One alternative substrate aimed at decreasing costs in the production of biosurfactants could be the waste glycerol obtained from the biodiesel industry. Brazil is ranked amongst the greatest producers and consumers of biodiesel in the world: 1.2 billion liters /year in 2008, according to the National Petroleum Agency-Brazil (ANP) generating 120,000 tons of waste glycerol in this process. The data described above may support the idea of applying the raw glycerol in the production of biosurfactant on a large-scale. This present study aimed to select an low cost organic substrate, in order to become viable the biosurfactant production on a large scale. Among the 19 microbial strains evaluated, the microorganism Bacillus subtilis LSFM-05 was selected for the biosurfactant production using raw glycerol as organic substrate. The temperature of 32oC and glycerol concentration of 5% v/v were designated as optimal conditions for the production of biosurfactants, by response surface methodology. The production of biosurfactants was carried out by one liter fermentor at 150, 250 and 350 rev.min-1. The 250 rev.min-1 fermentation was the best performance in foaming and biosurfactant production. Then, this condition was reproduced in 10 liter fermentor, with yield of 0.69 g.L-1. After the fermentation processes, the biosurfactants were recovered by acid precipitation, puri_ed by adsorption column and characterized using Infrared Spectroscopy Fourier Transform (FT-IR), Magnetic Resonance Spectroscopy ( 1H and 13C NMR) and Mass Spectrometry (ESI-MS/MS). The biosurfactant was characterized as a surfactin isoform, containing14 carbon atoms in the lipid chain and 7 aminoacids in the peptide portion. The mass spectrometer was able to elucidate the composition and aminoacids sequence in the cyclic peptide GluOMe(1)/Leu(2)/Leu(3)/Val(4)/Asp(5)/Leu(6)/Leu(7). The microorganism Bacillus subtilis LSFM-05 was characterized as a fengycin co-producer. The mass spectrometry have been a sensitive and rapid technique for fengycin homologues characterization. The C14/Leu7 surfactin presented EC50 value of the 1500 mg.L-1 against Daphnia similis in ecotoxicological studies. The surfactin showed antiviral activity against enveloped bovine herpesvirus (BoHV-1), inhibiting 100 % of the infectivity at concentration of 0.25 _M, however, it didn't show antimicrobial activity for microorganisms evaluated until concentration of 1mg.mL-1. The surfactin cytotoxicity in mice _broblasts c3T3 was evaluated as well, and the EC50 value was not determined in the studied concentration range, indicating low levels of toxicity for this cell type. Concerning to applications in nanotechnology, the biosurfactants proved to be a useful tool in the dispersion of carbon nanotubes in standard water cultivation of Daphnia, enabling future studies about the environmental toxicology of these nanomaterials / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Na natureza, os microorganismos podem apresentar forma de vida planctônica ou podem estar aderidos a superfícies formando comunidades conhecidas como biofilmes. A formação de biofilmes na indústria alimentícia é uma constante preocupação visto que os microorganismos aderidos podem causar contaminações persistentes, levando a deterioração do alimento e a transmissão de doenças. Uma alternativa para evitar a adesão bacteriana e a formação de biofilmes é o pré-condicionamento de superfícies com biosurfatantes, que são compostos tensoativos de origem microbiana capazes de alterar as propriedades físico-químicas e conseqüentemente modificar as interações entre a bactéria e a superfície. Os biosurfatantes, surfactina obtida de Bacillus subtilis e ramnolipídeo de Pseudomonas aeruginosa, foram testados quanto a capacidade de evitar a adesão e remover biofilmes de bactérias patogênicas de interesse alimentar. Foram avaliadas culturas individuais e mistas de Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, e Salmonella Enteritidis utilizando-se como modelo superfícies de poliestireno. O pré-condicionamento da superfície com surfactina na concentração de 0,25% reduziu a adesão de Salmonella Enteritidis e Listeria monocytogenes em 42%, enquanto que o tratamento com ramnolipídeo a 1% reduziu a adesão de Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus ao poliestireno em 57,8% e 67,8% respectivamente. O condicionamento com os biosurfatantes não se mostrou eficiente na redução da adesão das culturas mistas das bactérias se comparado aos resultados obtidos para as culturas individuais. O poliestireno condicionado com os biosurfatantes apresentou redução na hidrofobicidade devido ao caráter aniônico destas moléculas. A repulsão eletrostática e a redução das interações hidrofóbicas promovidas pelo condicionamento do poliestireno com ramnolipídeo foram fatores determinantes na atividade antiadesiva observada para L. monocytogenes e S. aureus, entretanto os resultados obtidos para a superfície tratada com surfactina sugerem que outros parâmetros influenciaram nos resultados observados. Após 2 h de contato a surfactina na concentração de 0,1% promoveu a remoção de 63,7% do biofilme de S. aureus, 95,9% do biofilme de L. monocytogenes, 35,5% do biofilme de S. Enteritidis e 58,5% do biofilme da cultura mista das três bactérias. Já o ramnolipídeo na concentração de 0,25% removeu 58,5% do biofilme de S. aureus, 26,5% do biofilme de L. monocytogenes, 23,0 % do biofilme de S. Enteritidis e 24% do biofilme da cultura mista após 2 h contato. De modo geral, o aumento do tempo de contato e da concentração dos biosurfatantes reduziu a remoção dos biofilmes. A surfactina e o ramnolipídeo demonstraram potencial para uso como agentes anti-adesivos assim como para a remoção de biofilmes de bactérias patogênicas de importância alimentar. / In nature, microrganisms can live as planktonic cells or can be found living in communities attached in surfaces forming biofilms. Biofilm represents a great concern for food industry, since it can be a source of persistent contamination that can lead to food spoilage and the transmission of diseases. To avoid the adhesion of bacteria and the formation of biofilms, an alternative is the pre-conditioning of surfaces using biosurfactants that are microbial compounds that can modify the physico-chemical properties of the surfaces changing bacterial interactions and consequently adhesion. The biosurfactants, surfactin obtained from Bacillus subtilis and rhamnolipids from Pseudomonas aeruginosa, were evaluated as agents to avoid the adhesion and to disrupt biofilms of food-borne pathogenic bacteria. Individual cultures and mixed cultures of Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes e Salmonella Enteritidis were studied using polystyrene as the model surface. The pre-conditioning with surfactin 0,25% reduces in 42,0% the adhesion of L. monocytogenes and S. Enteritidis, whereas the treatment using rhamnolipids 1,0% reduced in 57,8% the adhesion of L. monocytogenes and in 67,8% the adhesion of S. aureus to polystyrene. The conditioning of surface with biosurfactants was less effective to avoid adhesion of mixed cultures of the bacteria when compared with the results obtained for individual cultures. The polystyrene surface conditioned with the biosurfactants showed a reduction in the hydrophobicity due to the anionic character of the molecules. The electrostatic repulsion and the reduction on hydrophobic interactions promoted by the conditioning of surface with rhamnolipids were determinant factors to explain the anti-adhesive activity observed for L. monocytogenes and S. aureus, however, the data obtained with surfactin suggest that other parameters have influenced the results observed. After 2 h contact with surfactin at 0,1% concentration, the pre-formed biofilms of S. aureus were reduced by 63,7%, L. monocytogenes biofilms were reduce by 95,9% , S. Enteritidis biofilms by 35,5% and the mixed culture biofilm by 58,5%. The rhamnolipids at 0,25% concentration removed 58,5% of biofilm of S. aureus, 26,5% of the biofilm of L. monocytogenes, 23,0% the biofilm of S. Enteritidis and 24,0% the biofilm of the mixed culture after 2 h of contact. In general, the increase in concentration of biosurfactants and in the time of contact decreases the biofilm remove percentage. These results demonstrate that surfactin and rhamnolipids present potential to be used as agents to control the attachment and to disrupt biofilms of food-borne pathogens.

Os surfatantes são substâncias químicas que têm uma ampla aplicação industrial principalmente como matéria-prima na fabricação de detergentes. No entanto, estas substâncias de origem sintética podem ser substituídas por biossurfatantes (BS), já que estes são biodegradáveis, menos tóxicos para o meio ambiente e além de estáveis em condições extremas de pH, temperatura e salinidade. O alto custo de produção dos BS inviabiliza até o presente momento a substituição dos surfatantes químicos (mais tóxicos). Pesquisadores acreditam que a produção de BS tenha que atingir custos abaixo de 5 dolares/lb para serem economicamente viáveis. Uma das estratégias usadas para diminuir o custo da produção de BS, é usar diferentes subprodutos agrícolas e industriais. Os resíduos de natureza celulósica vêm ganhando espaço nos últimos anos como fontes de carbono alternativas para produtos de base biotecnológica, devido principalmente a sua abundância na natureza e ao apelo das tecnologias sustentáveis. O sisal é uma fonte lignocelulósica de rápido ciclo de crescimento que contém alto teor de celulose vegetal, e que é encontrado em grandes quantidades no Brasil. Este projeto teve como objetivo a produção de biossurfatante por Bacillus subtilis ATCC 21332, utilizando como fonte de carbono o hidrolisado lignocelulósico ácido e enzimático obtido da polpa de sisal. A produção do BS no substrato alternativo proposto foi comparada com a produção em meio de cultivo convencional (glicose). Os BS sintetizados foram avaliados quanto às propriedades físico-químicas: concentração micelar crítica (CMC), tensão superficial (TS) e tensão interfacial (TI). O BS obtido a partir da fermentação do hidrolisado enzimático apresentou TS = 28,71 mN.m-1; TI = 3,81 mN.m-1; e CMC = 64,0 mg.L-1; e aquele produzido a partir da fermentação do hidrolisado ácido apresentou TS = 29,79 mN.m-1; TI = 5,70 mN.m-1; e CMC = 1394,0 mg.L-1. Os valores de tensão superficial inferiores a 30 mN.m-1 indicaram que o hidrolisado ácido e enzimático da polpa de sisal oferecem boas condições como substratos alternativos para a produção de surfactina. As soluções dos BS obtidos em hidrolisado ácido e enzimático removeram 79,96% e 70,35% do óleo diesel de areia contaminada respectivamente, evidenciando-se o potencial para biorremediação. / The surfactants are chemical products that have huge industrial applications, mainly as raw materials in detergent industry. However, these synthetic substances can be replaced by biosurfactants (BS), since they are biodegradable, less toxic and stable at a wide range of pH, temperature and salt concentrations. In spite of these favorable characteristics, the high production costs of BS difficult their use as substitutes to synthetic surfactants (more toxic). If the production costs were less than 5 dollar/lb, their commercialization of BS would be possible. One strategy that permits reducing costs is the use of alternatives substrates from different industries such as byproducts or wastes from agricultural processing units. The lignocellulosic residues are one the most abundant sources of renewable organic carbon, for this reason in the last years, they began to be used as an unconventional carbon source for the synthesis of biotechnology products. Sisal is a lignocellulosic source that growths rapidly and is found in high quantity in Brazil. The objective of this study was the production of biosurfactant by Bacillus subtilis ATCC 21332, using as carbon source enzymatic and acid hydrolysates obtained from sisal pulp. The production using the alternative substrates was evaluated and compared with the production in conventional medium. The critical micelle concentration (CMC), surface tension (TS) and interfacial tension (IT) of the BS were evaluated, the following values were obtained for surfactin synthesized through the fermentation with enzymatic hydrolysate: TS = 28.71 mN.m-1, TI = 3.81 mN.m-1 and CMC = 64.0 mg.L-1. When the acid hydrolysate was used as carbon source the physical-chemical properties were TS = 29.78 mN.m-1, TI = 5.70 mN.m-1 and CMC = 1394.0 mg.L-1. Surface tension values lower than 30.0 mN.m-1 demonstrated that enzymatic and acid hydrolysate offer good conditions as alternative substrates for biosurfactant production. The surfactin synthesized exhibited potential for bioremediation; washing soil with BS obtained in acid and enzymatic hydrolysate removed 80% and 70% of diesel from contaminated sand, respectively.

Orientador: Glaucia Maria Pastore / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-18T13:15:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrade_CristianoJosede_M.pdf: 12087429 bytes, checksum: e7e52d39533950f814bfe0b0170abd81 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Os parâmetros ótimos de desodorização (temperatura, porcentagem de vapor e pressão de operação) são determinados de acordo com o tipo de óleo e o processo de refino selecionado. O refino do óleo de palma é realizado preferencialmente através do refino físico, pois sua elevada acidez pode provocar uma perda excessiva de óleo neutro no caso da utilização do refino químico. O refino físico de óleos vegetais consiste num processo de esgotamento ou stripping, no qual sob pressões reduzidas e elevadas temperaturas os compostos voláteis são removidos do óleo neutro através da utilização de um agente de arraste, que pode ser um gás ou vapor. No entanto, estas condições de processo também facilitam a ocorrência de volatilização de valiosos compostos minoritários como esqualeno, tocoferóis, tocotrienóis, fitoesteróis, bem como uma pequena porção dos acilgliceróis. Desta forma, este trabalho apresenta a aplicação da metodologia de superfície de resposta (MSR) no estudo dos efeitos de três variáveis de processo (temperatura, porcentagem de vapor e fração estearina/oleína), sobre a perda/transferência de compostos graxos durante a desacidificação física. As respostas de interesse foram acidez final do óleo e perda de óleo neutro (PON). Os resultados revelaram que a composição do óleo é um fator importante e estatisticamente significante a ser considerado na seleção de variáveis de processo mais adequadas, além da temperatura e da porcentagem de vapor. Na segunda etapa, foi realizado um estudo detalhado da degradação térmica dos carotenóides no óleo de palma considerando-se temperaturas variando na faixa de 170 ºC a 230 ºC. O processo de aquecimento foi realizado com injeção de nitrogênio e a coleta de amostra foi feita a cada 20 min durante um período de aquecimento total de 140 min. Os dados experimentais foram então comparados com dados da literatura relacionados à degradação de carotenóides. A degradação térmica dos carotenóides mostrou uma melhor adequação a uma ordem de reação superior a 1. Em uma etapa posterior, a metodologia de superfície de resposta (MSR) foi aplicada para o refino físico de amostras de óleo de palma de diferentes qualidades, medidas através de sua acidez inicial. Foram consideradas a influência de duas condições de operação e um terceiro parâmetro de qualidade, sendo estes: temperatura, porcentagem de vapor e acidez inicial das amostras. As respostas de interesse foram acidez final do óleo, retenção de tocóis, perda de óleo neutro (PON) e retenção de carotenóides. Os resultados mostraram que a acidez inicial é um parâmetro estatisticamente importante para a obtenção de valores aceitáveis de acidez final. Este parâmetro está diretamente relacionado à concentração de componentes minoritários no óleo, pois caso o valor de acidez final não tenha atendido aos padrões pré-determinados, o óleo deve ser submetido a tratamentos subseqüentes utilizando-se temperaturas mais elevadas ou maiores tempo de processo, portanto, acarretando a redução dos compostos minoritários. Para finalizar este trabalho foi avaliada a ocorrência da reação de hidrólise de óleo neutro durante o processo de desacidificação física. Os resultados revelaram que as maiores concentrações de ácidos graxos livres (AGL) no óleo e as menores concentrações de AGL no destilado foram obtidas para as maiores vazões de vapor e menores tempos de processo. Observou-se também, que a geração de AGL aumenta com o aumento da porcentagem de vapor e da temperatura do processo. Através da análise da cinética da hidrólise de óleo neutro, foi possível verificar uma boa adequação dos dados à equação de primeira-ordem / Abstract: Optimal deodorizing parameters (temperature, steam percentage, and operating pressure) are determined by the type of oil and the selected refining process. Refining of palm oil is preferably performed by physical means since its high acidity can lead to excessive losses of neutral oil in case of the caustic refining process. Physical refining of vegetable oils is a stripping process in which, under low absolute pressure and high temperatures, the accompanying lower boiling compounds are distilled off from neutral oil, by using gas or steam, as effective stripping agent. However, these processing conditions also increase the occurrence of volatilization of the valuable minor components present in the oil such as squalene, tocopherols, phytosterols, as well as some portion of acylglycerols. Thus, this work presents the application of response surface methodology (RSM) to the study of the effects of three factors (temperature, percentage of stripping steam and the stearin/olein ratio) on the losses/transfer of fatty compounds during the steam deacidification. The responses of interest were the final oil acidity and the loss of neutral oil (NOL). The results revealed that the oil composition was an important and statistically significant factor in the selection of more suitable processing variables, besides temperature and steam. In the second step, a detailed study was performed for carotene thermal degradation in palm oil at four temperatures ranging from 170 ºC to 230 ºC. The heating process was carried out with injection of nitrogen and the samples were collected every 20 min during a total heating period of 140 min. The experimental data were then compared to literature data concerning carotenoids thermal degradation. The thermal degradation kinetics of carotenoids in palm oil followed an order superior to 1. In the next step of this work, response surface methodology (RSM) was applied to study the physical refining process of palm oil samples of different qualities, measured by their initial acidity. The influence of two operative conditions and a third quality parameter are considered: the temperature, the steam percentage, and the initial FFA. Their effect on the final FFA, tocols retention, neutral oil loss (NOL), and carotene retention was investigated. The results revealed that the initial FFA is a statistically important parameter to obtain acceptable values for final FFA, which has directly relation with the concentration of minor components in the oil by the submission to higher temperatures or longer refining periods, in order to reach the standard values. To end this work, it was evaluated the occurrence of hydrolysis of neutral oil during the steam deacidification. The results revealed that the highest percentages of FFA into the oil and the lowest percentages of FFA on the distillate were obtained when applying high steam flow rates associated with reduced stripping times. It was also observed that the generation of free fatty acids increases with the increasing of the percent of steam injected into the oil as well as with the increasing of the process temperature. The kinetic investigation revealed that the hydrolysis of neutral oil follows a first-order reaction / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Elias Basile Tambourgi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-26T17:48:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ehrhardt_DanielaDiniz_M.pdf: 1295191 bytes, checksum: fa70dc68bb798428fff1677668957a8a (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O crescente comprometimento com questões ambientais, juntamente com as novas legislações vigentes fizeram com que o uso de surfactantes sintéticos se tornasse inviável pela indústria. Assim, o desenvolvimento de novas tecnologias para produção de biossurfactantes aumentou consideravelmente. Biossurfactantes são grupos de compostos químicos produzidos por microrganismos através da biodegradação de matérias-primas renováveis. A utilização de biossurfactantes tornou-se uma alternativa bastante interessante em substituição aos surfactantes sintéticos, pois geram menor impacto ambiental devido à sua biodegrabilidade, diversidade estrutural e baixa toxicidade. Entretanto, os altos custos de produção são fatores limitantes para sua aplicação industrial. Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo a produção de biossurfactante, através da fermentação do resíduo do processamento do abacaxi, por Bacillus subtilis, a 37 ? C. O resíduo do abacaxi como substrato de fonte renovável garante o baixo custo na produção do surfactante microbiológico, uma vez que este fruto é extensivamente cultivado no Brasil. Foram realizadas fermentações com três diferentes concentrações de glicose (1%, 3%, 5%) e, posteriormente, enriquecendo o substrato com glicerol comercial (3%, 5% e 10%). Foram realizados testes de tensão superficial e indíce de emulsão e observou-se melhores resultados com 5% de glicose e sem adiação de glicerol, com redução da tensão em 25% e índices de emulsão de 67%, entretando não foi observado estabilidade do bissurfactante produzido quando expostos à condições extremas de temperatura (100°C e 121°C), variação de pH de 4 a 8 e frente à força iônica com soluções de NaCl em concentrações de 2,5%, 5%, 10% e 20% / Abstract: The growing commitment to environmental issues, with the new current legislation made the use of synthetic surfactants become unviable in industry. Thus, the development of new technologies for producing biossufactantes increased considerably. Biosurfactants are groups of chemical compounds produced by microorganisms by biodegradation renewable raw materials. The use of biosurfactants has become an interesting alternative to replace synthetic surfactants because they generate less environmental impact due to their biodegradability, low toxicity and structural diversity. However, the high production costs are limiting factors for their industrial application. Therefore, this study aimed to produce biosurfactant by Bacillus subtilis at 37 °C, usign the residue from processing of pinneaple as substrate. The pineapple residue as a renewable source substrate ensures low cost production of microbial surfactant, since this fruit is extensively cultivated in Brazil. Fermentations were performed at three different glucose concentrations (1%, 3%, 5%) and then enriching the substrate with commercial glycerol (3%, 5% and 10%). The surface tension and emulsion index analysis showed that the best results was with 5% glucose and without glycerol, with tension reduction of 25% and emulsion index of 67%. However, was observed that the bissurfactant produced wasn't stable when exposed to extreme conditions of temperature (100 ° C and 121 ° C), pH range 4 to 8 and ionic strength of NaCl solutions with concentrations of 2.5%, 5%, 10% and 20% / Mestrado / Engenharia Química / Mestra em Engenharia Química

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