Citrus tristeza virus (CTV) ocorre em quase todas as áreas produtoras de citros do mundo. O controle da doença se baseia, principalmente, no uso de porta-enxertos tolerantes e na premunização das copas. A obtenção de copas de laranjas doces ou de porta-enxerto de laranja azeda transgênicos resistentes ao CTV permitiria retornar a um uso mais intensivo deste excelente porta-enxerto. Com isso, esse trabalho buscou avaliar linhagens transgênicas de laranja doce (Citrus sinensis) e obter plantas transgênicas de laranja azeda (Citrus aurantium) para a resistência ao CTV, a fim de oferecer uma outra alternativa para o controle desta doença em citros. Foram avaliadas plantas transgênicas de laranja doce cv. Valência e cv. Hamlin contendo três diferentes construções gênicas. Uma contendo uma sequência sense (684 pb) do gene da capa protéica do CTV (pCTV-CP), outra contendo uma sequência conservada (559 pb) do CTV (pCTV-SC) e uma do tipo hairpin, contendo sequências sense e antisense do gene da capa protéica separadas por um íntron (pCTV-dsCP). Dez linhagens transgênicas de cada construção gênica e de cada cultivar foram previamente confirmadas por análises de Southern blot e RT-PCR, totalizando 60 linhagens transgênicas. Tais linhagens foram clonadas e enxertadas sobre limão Cravo (C. limonia) e laranja azeda (C. aurantium), totalizando 360 plantas. Essas plantas, juntamente com plantas não transgênicas utilizadas como controle, foram inoculadas com o CTV por meio de Toxoptera citricida virulífero. As técnicas de ELISA indireto utilizando anticorpo monoclonal contra a capa protéica do CTV ou de Real-time PCR utilizando primers amplificadores dos genes p20 e p23 do genoma do CTV foram utilizadas para detectar o vírus nas plantas avaliadas, 4 semanas após as inoculações. Ocorreu variação na resistência ao vírus nas diferentes construções transgênicas utilizadas e entre clones de uma mesma planta. Alguns clones não foram infectados com o vírus mesmo após a quarta inoculação, indicando uma possível resistência ao patógeno. Um total de 30 experimentos de transformação genética de laranja azeda foram realizados, utilizando como explantes segmentos internodal, de epicótilo e de cotilédone associado ao hipocótilo. O teste de GUS permitiu a identificação de duas gemas com reação positiva (0,13% de eficiência de transformação). Tais gemas foram enxertadas in vitro sobre citrange Carrizo, mas apenas uma gema se desenvolveu. A planta obtida foi aclimatizada em casa-de-vegetação. / Citrus tristeza virus (CTV) occurs in almost all citrus-growing areas of the world. Control of citrus tristeza relies mainly on the use of tolerant rootstocks and scion cross protection. Obtaining transgenic sweet oranges cultivars or sour orange resistant to CTV would allow a better use of this excellent rootstock. This way, the aim of this work was to evaluate transgenic sweet orange (Citrus sinensis) lines and to obtain transgenic sour orange (Citrus aurantium) for the resistance to CTV, in order to offer another alternative for the control of the disease in citrus. Transgenic sweet orange cv. Valencia and cv. Hamlin containing three different genetic constructs were evaluated. One gene construct contains a sense sequence (684 pb) of the coat protein gene of CTV (pCTV-CP), another contains a conserved sequence (559 pb) of CTV (pCTV-SC), and the last one a hairpin type, containing the sense and antisense sequences of the coat protein gene separated by an intron (pCTV-dsCP). Ten transgenic lines of each gene construct and each cultivar were previously confirmed by Southern blot and RT-PCR analysis, totalizing 60 transgenic lines. These lines were cloned and grafted into C. limonia and into C. aurantium, totaling 360 plants. The plants, along with non-transgenic plants used as control, were challenged four times with the CTV by means of viruliferous Toxoptera citricida. Indirect ELISA using monoclonal antibody against the CTV coat protein or the Real-time PCR using primers to amplify the CTV genes p20 and p23 were used to detect the virus in the tested plants, 4 weeks after inoculation. Variation in the virus resistance was observed among different transgenic constructs and different clones of the same plant. Some clones were not infected with the virus even after the fourth inoculation, indicating a possible resistance to the pathogen. A total of 30 genetic transformation experiments of sour orange were performed, using as explants internodal segments, epicotyl segments and cotyledon fragment with hypocotyl attached. GUS reaction detected two shoots positive (transformation efficiency of 0,13%). These shoots were in vitro grafted in Carrizo citrange, but only one shoot developed. The plant obtained was acclimatized in greenhouse.

Submitted by Michele Mologni (mologni@unoeste.br) on 2017-06-23T19:31:58Z No. of bitstreams: 1 Luciana Machado Guaberto.pdf: 1335752 bytes, checksum: aa6bb850bf2257d472ca5dbfd2512a5a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-23T19:31:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciana Machado Guaberto.pdf: 1335752 bytes, checksum: aa6bb850bf2257d472ca5dbfd2512a5a (MD5) Previous issue date: 2016-12-16 / The DOF family proteins (DNA binding with One Finger) comprises unique plant transcription factors (FTs) characterized by the presence of a DNA binding domain Dof containing a similar structure to the "zinc-finger" domain. These transcription factors are involved in different roles in various biological processes in plants. Although the analysis and genomic characterization of this gene family was performed in many plant species, information on Dof genes in sweet orange (Citrus sinensis (L.) Osbeck) and their involvement in the development of the fruits is still limited. For the full identification of CsDof genes in C. sinensis, including the structures of genes, chromosomal locations, introns and phylogeny, the examination of three databases resulted in the identification of 24 genes of this FT family distributed on 7 out of 9 chromosomes of this species. Phylogenetic analysis and classification of Dof transcription factors in C. sinensis was compared with their orthologs of Arabidopsis (Arabidopsis thaliana L.) and rice (Oryza sativa L.), which allowed their classification in four major groups (A, B, C and D) and 9 subgroups (a, B1, B2, C1, C2.1, C2.2, C3, D1, D2) of DOF proteins. For gene expression analysis, the 12 Dof genes with higher abundance of transcripts in fruits based on public RNA-seq data were selected for further analysis by semi-quantitative RT-PCR. This analysis revealed the CsDof genes were differentially expressed at different stages of development (up to 90 days after anthesis). It was also possible to establish three groups regarding their transcriptional activity relative to that in leaf tissue: genes with high (up to 8X), intermediate (up to 3X) and low relative expression (below 3 X). The gene CsDof1 showed higher expression in all of the fruit development stages, indicating that this isoform plays an important role in regulating the development of the fruits of C. sinensis. Taken together, our results provide new information about the regulation of Dof genes in controlling the formation of fruits of this important fruit species. / A família de proteínas Dof (DNA binding with One Finger) compreende fatores de transcrição (FT) exclusivos de plantas, caracterizados pela presença do domínio Dof de ligação ao DNA Estes fatores de transcrição estão envolvidos em diversos processos biológicos em plantas. Embora a análise e caracterização genômica de genes desta família tenha sido realizada em muitas espécies, informações sobre genes Dof em Citrus sinensis (L.) Osbeck (laranja doce) e o seu envolvimento no desenvolvimento do fruto é limitado. Para a identificação completa dos genes CsDof em C. sinensis, incluindo as estruturas dos genes (Exons - Íntrons), localizações cromossômicas e filogenia, três bancos de dados foram analisados. Como resultado desta busca 24 genes desta família de FTs distribuídos em 7 dos 9 cromossomos desta espécie. A análise filogenética e classificação dos fatores de transcrição Dof em C. sinensis foi realizada com a inclusão dos seus ortólogos de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana L.) e arroz (Oryza sativa L.), sendo possível estabelecer quatro grupos principais (A, B, C e D) e 9 subgrupos (A, B1, B2, C1, C2.1, C2.2, C3, D1 e D2) de proteínas Dof. Foram selecionados 12 genes putativamente mais expressos em frutos de acordo com dados públicos de RNA-seq para a análise da expressão gênica por RT-PCR. Estes genes foram diferencialmente expressos durante as fases iniciais do desenvolvimento do fruto, sendo possível estabelecer três grupos: genes com alta expressão (acima de 8 X), expressão intermediária (acima de 3 X) e baixa expressão relativa (abaixo de 3 X) em relação à atividade transcricional em folhas. O gene CsDof1 se destacou como o gene com a maior expressão, sendo que esta manteve-se elevada em todos os estádios de desenvolvimento do fruto, evidenciando que esta isoforma desempenha um importante papel na regulação do desenvolvimento de frutos de C. sinensis. Considerados em conjunto, os nossos resultados fornecem novas informações sobre os genes CsDof na complexa rede regulatória envolvida no desenvolvimento dos frutos de laranja doce.

[pt] Um método analítico simples e verde para a quantificação dos teores de óleos essenciais de laranja doce e lavanda em blends foi desenvolvido utilizando a primeira derivada dos espectros de fluorescência sincronizada com preparação de amostras por microemulsões sem surfactante. Os pares de comprimentos de onda de excitação e emissão (Medições de absorvância no comprimento de onda de excitação/Medições de absorvância no comprimento de onda de emissão) foram determinados para ambos os óleos essenciais (336/436 nm para laranja doce e a 330/388 nm para lavanda). A otimização univariada foi conduzida para estabelecer as condições de preparo para os sistemas microemulsionados: 50 μL de fase oleosa contendo óleo essencial diluído em octan-1-ol (1:4, v/v), 2,0 mL de água e propan-1-ol até o volume final de 5,0 mL. Diferentes proporções de óleo essencial na fase oleosa foram preparadas para a construção das curvas analíticas a fim de monitorar a sensibilidade das curvas. Medições de fluorescência síncrona foram realizadas e os dados adquiridos foram corrigidos pelo efeito do filtro interno. Considerando a primeira derivada da varredura síncrona, os dados foram extraídos a 316,8 nm (Mudança de Stokes) e 352,0 nm (Mudança de Stokes= 58 nm) para os óleos essenciais de laranja doce e lavanda, respectivamente, com coeficientes de determinação acima de 0,99. Limites de quantificação de 8,0 microgamas mL-1 e 65,8 microgramas mL-1 foram obtidos, indicando que 0,46 porcento de óleo essencial de laranja doce e 3,69 porcento de óleo essencial de lavanda podem ser quantificados em misturas dos dois óleos. Misturas simuladas (proporções de volume de 25:75 porcento, 50:50 porcento e 75:25 porcento) também foram avaliadas com recuperações de 71,5 porcento a 128,9 porcento e coeficiente de variação entre 3,1 porcento e 11,6 porcento. Além disso, o método foi avaliado quanto ao seu impacto ecológico por meio de três métricas verdes (Analytical Eco-Scale, GAPI e AGREE) com resultados concordantes. / [en] A simple green analytical method for the quantification of sweet orange and lavender essential oils (EOs) content in blends was developed using synchronous fluorescence first derivative spectra and sample preparation by surfactant-free microemulsions (SFMEs). Excitation and emission wavelengths pairs (Absorbance measurements in the excitation wavelength/Absorbance measurements in the emission wavelength) were determined for both EOs (at 336/436 nm for sweet orange and at 330/388 nm for lavender). Optimization was conducted to establish the condition to prepare the SFMEs systems: 50 microlitres of oily phase containing EO diluted in octan-1-ol (1:4, v/v), 2.0 mL of water and propan-1-ol up to 5.0 mL final volume. Different proportions of EO in the oily phase were prepared for analytical curves construction to monitor curve s sensibility. Synchronous fluorescence measurements were performed, and the acquired data were corrected by inner filter effect. Considering the first derivative of the synchronous scanning, data were extracted at 316.8 nm (Stokes shift = 100 nm) and 352.0 nm (Stokes shift = 58 nm) for sweet orange and lavender EOs, respectively, with determination coefficients above 0.99. Limits of quantification of 8.0 micrograms mL-1 and 65.8 micrograms mL-1 were obtained indicating that 0.46 percent of sweet orange and 3.69 percent of lavender EOs can be quantified in mixtures. Simulated blends (25:75 percent, 50:50 percent and 75:25 percent, volume proportions) were also evaluated with recoveries of 71.5 – 128.9 percent and coefficient of variation between 3.1 percent – 11.6 percent. Additionally, the method s greenness was evaluated through three green metrics (Analytical Eco-Scale, GAPI, and AGREE) with aligned results.