Les champignons ont développé diverses interactions avec les végétaux. Ces interactions peuvent être bénéfiques pour la plante dans le cas des champignons établissant des symbioses mutualistes ou néfastes si le champignon est pathogène. Elles reposent sur des mécanismes moléculaires mal élucidés. Des études réalisées sur le champignon mutualiste Hebeloma cylindrosporum associé au pin Pinus pinaster ont permis de créer une collection de mutants affectés dans leur capacité à interagir avec les plantes et à former l’organe mixte de la symbiose, l’ectomycorhize. L’objectif de ma thèse a été d’étudier un mutant affecté dans le gène codant une alpha-tubuline Hctubα2. Les tubulines sont des protéines présentes chez tous les Eucaryotes et permettent la formation des microtubules, des éléments clés du cytosquelette. Chez les champignons, on trouve une ou deux alpha tubuline(s). H. cylindrosporum en possède deux. J’ai étudié l’expression de ces deux tubulines lors l’établissement de l’interaction avec les racines de l’hôte. Les résultats indiquent que ces deux gènes sont différentiellement exprimés lors de l’interaction. J’ai étudié au niveau protéomique l’impact de la mutation en comparant les protéomes intracellulaires des deux souches. On retrouve deux alpha-tubulines chez certains champignons phytopathogènes comme Botrytis cinerea. L’hypothèse de l’implication de l’alpha-tubuline 2 dans l’établissement de la pathogénie a été émise. J’ai donc construit des mutants de Botrytis cinerea dans lesquels ce gène a été inactivé. J’ai également tenté de localiser à l’aide de fusions traductionnelles chacune des alpha-tubulines chez le champignon mycorhizien et chez le pathogène / In all terrestrial ecosystems, plants live in close interaction with numerous fungi. The interaction has a negative or positive effect on host plant depending upon the pathogenic or symbiotic status of the fungus. The establishment of these interactions is based on a tightly regulated molecular dialog between symbiotic partners. Previous studies on the ectomycorrhizal fungi, Hebeloma cylindrosporum associated with maritime pine (Pinus pinaster), created a collection of mutants affected in their mycorrhizal abilitiy. The aim of my thesis was to characterize one of these mutants affected in a gene, Hctubα2, encoding an alpha tubulin. Tubulins are eukaryotic cytoskeletal proteins involved in microtubules formation. Fungi have one or two alpha-tubulin. For example, H.cylindrosporum has two alpha-tubulin. The site of mutagenic DNA insertion in fungal genome was characterized. I studied the expression of both alpha-tubulins during the establishement of mycorrhizal interaction. Results showed that the two genes are differentially expressed during the interaction with host plant. At proteomic level, I studied the impact of the mutation comparing the two strains using 2D gel electrophoresis and sequencing differentially accumulated spots. Pathogenic fungi also bear two alpha-tubulins, as Botrytis cinerea. The hypothesis of the involvement of the alpha-tubulin 2 in pathogenesis was investigated. I created Botrytis cinerea mutants deleted for this gene. I also created translational fusions in order to visualize both alpha-tubulins in Hebeloma cylindrosporum and in Botrytis cinerea

La symbiose Methylobacterium nodulans / Crotalaria podocarpa est une symbiose originale. En effet, la méthylotrophie, propriété remarquable de la bactérie, s'exprime à l'apex du nodule et modifie localement le métabolisme : une dégradation apicale marquée des tissus est observée suite à une digestion des parois végétales, libérant du méthanol directement utilisable par la bactérie. Grâce à ce métabolisme, le bactéroïde -de taille et de forme inhabituellement grandes- fournirait l'énergie nécessaire à l'activité de la nitrogénase, et permettrait à la plante d'accumuler des réserves carbonées sous forme d'amyloplastes dans les cellules infectées. Cette propriété méthylotrophique bactérienne apporte également à la plante-hôte un gain de biomasse (>40 % par rapport aux mutants non méthylotrophes). En revanche, à l'échelle de l'espèce, la crotalaire n'est pas avantagée, en termes de fixation d'azote, à s'associer avec M. nodulans ou avec Bradyrhizobium sp., autre genre bactérien décrit en symbiose avec ces plantes. L'originalité de cette association symbiotique se situe également au niveau du dialogue moléculaire : les gènes nod de M. nodulans sont insensibles aux isoflavones, flavonoïdes inducteurs des Bradyrhizobium, mais sont induits par les flavanones et les flavones. L'analyse phylogénétique des gènes nod révèle que M. nodulans forme une branche particulière avec Methylobacterium sp. 4-46 et Burkholderia tuberum STM678, isolées de nodules de Légumineuses appartenant à la tribu des Crotalariae. Au niveau du signal bactérien, une structure unique de facteur Nod a été caractérisée chez M. nodulans ORS2060T : MnV(C18:1, S). Enfin, si la symbiose fonctionnelle M. nodulans/ Crotalaria a été identifiée seulement chez trois espèces de ce genre, la capacité du partenaire bactérien à former des pseudonodules avec d'autres Crotalaria laisse entrevoir un rôle clé de plusieurs composés pendant le processus d'infection suggérant différents mécanismes moléculaires impliqués dans la spécificité d'hôte.

L'objectif de cette thèse est l'étude par la technologie des puces à ADN, du transcriptome de la bactérie Buchnera aphidicola, qui vit en symbiose avec le puceron du pois Acyrthosiphon pisum. Le génome extrêmement réduit de Buchnera a perdu l'essentiel de ses gènes de régulation, mais conserve les voies de biosynthèse permettant la production des acides aminés essentiels pour son hôte. La première partie de cette thèse concerne le développement du logiciel ROSO, qui permet de déterminer les sondes oligonucléotidiques destinées aux puces. Une interface a été conçue pour son utilisation en ligne (http://pbil.univ-lyon1.fr/roso). Dans une seconde partie, la conception et l'utilisation d'une puce dédiée à Buchnera ont permis d'étudier le transcriptome de la bactérie, lorsque son hôte subit un stress nutritionnel et osmotique. Cette analyse montre que Buchnera est capable de réguler son expression génique et de réorienter son métabolisme, pour répondre à la demande changeante de son hôte.

Les nématodes entomopathogènes Steinernema sont associés symbiotiquement à des bactéries du genre Xenorhabdus. Leur cycle de vie comprend deux phases : une phase libre, dans le sol, où les nématodes portent leurs symbiotes dans le tube digestif, et une phase parasite, dans l'insecte, où les deux partenaires se multiplient côte à côte. Le bilan fin de l'interaction, globalement bénéfique pour les deux partenaires, a été peu étudié pour le moment. Dans un premier temps, nous avons abordé ces symbioses d'un point de vue coûts-bénéfices pour le nématode afin d'identifier les pressions de sélection agissant sur son investissement dans la symbiose. Nous montrons que l'association est à la fois bénéfique (reproduction en phase parasitaire) et coûteuse (mortalité en phase libre) pour le nématode, en proportion de sa charge symbiotique. Ces corrélations engendrent un compromis survie-reproduction pour le nématode, médié par ses symbiotes. Selon les conditions environnementales, elles pourraient éventuellement déstabiliser l'association, et, notamment, altérer sa spécificité. Dans un second temps, nous avons donc exploré la spécificité de ces associations dans la nature et au laboratoire. Lors d'un échantillonage de terrain, nous avons retrouvé la spécificité de ces associations largement décrite par ailleurs. Au laboratoire, la réassociation expérimentale entre nématodes et bactéries non natives montre que le spectre des bactéries retenues est plus étroit que le spectre des bactéries bénéfiques. De plus, des différences de modalités d'association apparaissent entre espèces de nématodes, qui suggèrent que la correspondance nématode - bactérie ne serait pas aussi stricte que prévu.

Les progrès fulgurants de ces dix dernières années réalisés dans les domaines de la microinformatique et de la microfluidique associés au génie génétique (PCR et séquençage) ont permis un changement d'échelle dans la quantité des données acquises au cours d'une même expérience. La transcriptomique est directement issue de ces avancées technologiques. Ce mémoire présenté pour l'obtention d'une Habilitation à Diriger des Recherdes porte sur l'analyse du transcriptome de la bactérie intracellulaire obligatoire des pucerons, Buchnera aphidicola. Dans la première partie, les principales méthodes d'analyses statistiques différentielles et d'intégration des données transcriptomiques sont présentées sous la forme d'une analyse bibliographique. La deuxième partie est consacrée au développement d'outils bioinformatiques : ROSO, un logiciel d'optimisation des sondes oligonucléotidiques, la puce Buchnera et SITRANS, un système d'information pour la gestion et la publication des données d'expression. Enfin, la dernière partie est consacrée à la caractérisation du transcriptome de Buchnera en condition de stress trophique de son hôte, le puceron du pois Acyrthosiphon pisum. La régulation transcriptionnelle chez les bactéries symbiotiques intracellulaires à génome réduit est encore actuellement très mal connue. Cette question sera abordée chez Buchnera tout d'abord au niveau évolutif par l'étude de la relation entre l'expression des gènes et leur organisation dans le génome, puis au niveau fonctionnel, par la caractérisation de la réponse de la bactérie à une diminution de la quantité d'acides aminés essentiels dans le substrat nutritif du puceron, combinée à un stress osmotique.

Overlooked for a long time, wood falls on the deep oceanic floor are now recognized as extreme, reducing ecosystems based on chemosynthesis, in the same way that hydrothermal vent, cold seeps and whale falls with which they share important physicochemical and faunistic similarities. In these ecosystems, bacterial chemosynthesis using reduced compounds (H2S, CH4) and/or digestion of refractory organic compounds (cellulose and lignin in wood, organic matrix of bone) by heterotrophic bacteria play an essential trophic role, and appear to promote establishment of mutualistic symbioses between bacteria and metazoans for the exploitation of environmental resources. Beyond the description of the taxonomic composition of fauna associated with these sites, current studies aim to understand the functioning and evolutionary links of these ecosystems. Digestive and/or chemoautotrophic associations with microorganisms that could be the key to survive in these habitats have been described in a number of molluscs and annelids but only few crustaceans. The latter distinguish from the other groups by the fact they do not realize intracellular symbioses (endosymbioses) but mainly carry ectosymbioses on their integument (epidermis and cuticle) even in the digestive tract that is partly lined by epidermis (in stomodeum and proctodeum). Moreover, up to now, nothing was known about crustaceans from deep-sea wood falls, their feeding habits and associations with microorganisms. The present work focused on the crustaceans and especially 15 species of decapods from wood falls in the South Pacific Ocean. The specimens were recovered during several French cruises (Salomon2, BOA1, SantoBOA, SalomonBOA3) organized near the Vanuatu, Solomon Island and New Caledonia by the Muséum National dHistoire Naturelle of Paris. The investigation of the feeding biology and microbial associations of the decapod species combined three complementary approaches : 1) a morphological approach using light and electron microscopy to describe the external and gut structures as well as the gut content and microflora, 2) a trophic approach based on stable isotopes analyses (C and N) together with the nature of the gut content and 3) a molecular approach based on 16S rRNA gene analyses and FISH labeling to identify and locate the bacteria in the gut content (ingested bacteria) and on the gut lining (resident bacteria or symbionts). Taxonomic identification and morphological observations of the species provided a first non-exhaustive inventory of the best represented decapod species in wood accumulations in the deep South Pacific and point out three interesting informations. 1) Most decapods from the sunken woods belong to Reptantia. 2) Some species (e.g. Munidopsis spp.) belong to deep sea taxa and exhibit typical characteristics while others (e.g. Xylopagurus) much more resemble shallow-water species, indicating that the colonization of wood falls by decapods may have occurred from both deep and coastal habitats. 3) Association degree with sunken wood could be important for some species that appear endemic (e.g. Pylochelidae, Xylopagurus) or which probably have their complete life cycle on wood falls (most of the gravid females having big eggs with a direct larval development). From a trophic point of view, morphological observations of the digestive system, examinations of gut contents and stable isotope analyses carried out on 15 species, allow us to classify the decapod crustacean from deep-sea sunken woods into two major groups, detritivores and predators/scavengers, and four trophic guilds (trophic levels) depending on two primary food sources, the wood and the particulate organic matrix (marine snow). The four guilds were identified as bacteriovorous detritivores (M. nitida, M. pilosa, M. bispinoculata, Munidopsis sp.1), xylophagous detritivores (M. andamanica, R. amboinensis), omnivores (X. caledonicus) and predators/scavengers (pylochelid species, Munida spp, Axiidae sp.1, M. cylindrophthalma). A fifth guild could be represented by limivorous detritivores (C. acutirostella, Alpheidae sp.1). This breaks with the widespread idea that decapod crustaceans from wood falls are all scavengers or predators. In addition, these results have evidenced of some special dietary strategies and highlight the importance of xylophagous decapods in the ecosystem, by their mechanical degradation of the substrate and their production of feces which should enrich the sediment and have a significant impact on the composition of wood and sediment microbiota (bacteria and fungi). Microscopic observations also allowed us to identify potentially symbiotic associations with resident (and transient) microorganisms (bacteria and/or trichomycetes) in the hindgut of five detritivorous species. Owing that, three of these species have a wood-based diet (M. andamanica, M. nitida, R. amboinensis) and considering the location of these microflora, it is strongly suggested that the resident microorganisms are directly related to the xylophagous diet of the host and most particularly involved in the digestion of wood. More detailed in two xylophagous species, M. andamanica and R. amboinensis, not only these microflora can be distinguished on the basis of their morphology, location and probable genetic differences but also by their roles and involvement in the digestion of the woody substrate. The digestive bacteria of M. andamanica could act as trophic intermediates while those of R. amboinensis probably only help in its digestion. From the stable isotopes ratio, it is likely that R. amboinensis directly assimilates the wood digestion products while M. andamanica feeds on wood with a trophic intermediate. Cloning and sequencing 16S rRNA gene from the gut bacteria of M. andamanica revealed its resident hindgut microflora is largely dominated by two phylotypes (OTUs) of possibly symbiotic bacteria that belong to Firmicutes and Alphaproteobacteria. Surprisingly, these OTUs are very close to gut bacteria isolated from a coastal thalassinid shrimp N. californiensis and from the Chinese crab E. sinensis. The results raise the question of the development and evolution of digestive symbioses in decapods and crustaceans in relation to the diet and/or adaptation to a special habitat, owing that among galatheid crabs the symbiotic relationships appear closer in certain species (M. andamanica) than in others (M. nitida, M. bispinoculata) and that similar differences appear between taxonomic groups. On the other hand, the genetic proximity of bacteria from distant crustacean species raise the question of an eventual co-evolution of linked hosts and symbionts contrasting with the permanent re-acquisition of symbionts from the medium.

Les Scléractiniaires symbiotiques (coraux) qui se développent dans des eaux oligo-trophes survivent grâce à une utilisation optimale des nutriments tels que le phosphore et l'azote. Alors que l'utilisation de l'azote par les coraux a été bien étudiée, ce n'est pas le cas du phosphore. L'enjeu principal de cette thèse a été d'évaluer l'utilisation du phos-phore inorganique et organique dissous (PID, POD) par les coraux dans diverses condi-tions environnementales, ainsi que leurs besoins métaboliques en phosphore. Les résul-tats obtenus ont montré que l'absorption de PID, mesurée par déplétion dans le milieu, et de POD, mesurée via l'activité de l'alcaline phosphatase, dépendent de l'éclairement, de la présence de Dinoflagellés symbiotiques dans les tissus coralliens, de la présence d'azote inorganique, et du statut nutritionnel de l'hôte (réplétion en phosphore organique particulaire, POP, ingéré sous forme de plancton). Lors d'un stress de température, seul ou combiné à une acidification du milieu, l'absorption de PID a été affectée. Sous l'effet d'un enrichissement du milieu en PID, la photosynthèse et la calcification corallienne ont été augmentées, suggérant qu'en conditions oligotrophes, la symbiose est limitée par le phosphore. Enfin, des analyses en résonance magnétique nucléaire ont montré que le phosphore se trouve principalement sous forme de phosphate dans la symbiose, mais aussi de phosphonates chez l'hôte, et de polyphosphates et esters de phosphate chez les symbiotes. Un premier bilan de l'importance relative du PID, POD et POP a été établi à l'issue de ce travail, et un examen critique des outils permettant d'évaluer la limitation par le phosphore a été réalisé.

Depuis leur radiation après le Carbonifère, il y a 325 millions d'années, les insectes ont colonisé la majorité des milieux terrestres. Ce grand pouvoir colonisateur est en partie dû à leur association avec des bactéries symbiotiques intracellulaires, nommés endosymbiotes. Ces derniers complémentent le régime alimentaire de l'insecte et lui permettent de survivre sur des milieux nutritionnellement pauvres ou déséquilibrés. Les endosymbiotes sont transmis maternellement, ce qui assure la pérennité de l'association au cours des générations. Ils sont maintenus dans des cellules spécialisées, les bactériocytes, qui forment à leur tour un organe, le bactériome. L'étude des spécificités moléculaires et cellulaires des bactériocytes est un enjeu majeur dans la compréhension des mécanismes de régulation des endosymbiotes. Toutefois, la caractérisation de ces spécificités reste peu élucidée. Afin d'approcher les spécificités moléculaire, cellulaire et immunitaire du bactériome, ainsi que la réponse immunitaire systémique du charançon dirigée contre un pathogène, nous avons construit et séquencé 7 banques d'ADNc provenant du charançon des céréales : Sitophilus oryzae (Coléoptère, Curculionide). L'analyse in silico des banques, appuyée par une étude transcriptomique, a montré que le bactériome présente une forte expression de gènes impliqués dans la survie et le développement cellulaire, et dans le trafic vésiculaire. Le bactériome présente aussi une réponse immunitaire spécifique et modulée, puisqu'à l'exception d'un peptide antimicrobien, la coléoptéricine-A, les effecteurs de l'immunité ne sont pas (ou peu) exprimés. Par ailleurs, nous avons montré que la réponse immunitaire des larves de charançon aux infections bactériennes serait modulée en présence des endosymbiotes. Le deuxième volet de cette thèse s'est focalisé sur le stade adulte du charançon, chez qui les bactéries symbiotiques sont hébergées dans des bactériomes situés à l'apex des caeca mésentériques qui tapissent l'intestin moyen de l'insecte. Cette association est éphémère chez l'adulte qui perd ses endosymbiotes 15 jours après la mue imaginale. Nous avons recherché les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de cette élimination, ainsi que les causes écophysiologiques et évolutives sous-jacentes. Par des approches histologiques et transcriptomiques, nous avons démontré que l'élimination des symbiotes est la conséquence de l'activation simultanée de l'apoptose et de l'autophagie. Par ailleurs, nous avons montré que l'élimination du symbiote survient après la formation ultime de la cuticule par l'insecte adulte, et que cette élimination symbiotique était corrélée à une diminution des besoins nutritionnels de l'insecte, notamment en acides aminés aromatiques.

Cette thèse est une étude systémique de la régulation de la transcription des gènes de la bactérie Buchnera aphidicola vivant en symbiose intracellulaire obligatoire avec le puceron du pois, Acyrthosiphon pisum. Plusieurs études expérimentales antérieures sur ce modèle de symbiose attestent d'une part que la bactérie fournit à son hôte le complément nutritionnel qu'il ne trouve pas dans son alimentation, et d'autre part, que la bactérie adapte cette fourniture aux variations de la demande de son hôte, les mécanismes impliqués dans cette régulation demeurant relativement obscurs. Nous avons structuré notre analyse de la régulation de la transcription chez Buchnera en quatre parties. La première dresse l'inventaire de la machinerie transcriptionnelle de Buchnera. La deuxième partie analyse l'architecture génomique de Buchnera, i.e. l'organisation et l'évolution de sa carte opéronique. Pour cette étude, nous avons été amenés à développer une méthode bayésienne de prédiction d'opérons adaptée à Buchnera, ce qui nous a permis de proposer une nouvelle carte opéronique de la bactérie. La troisième partie porte sur les propriétés structurelles séquence-dépendantes du chromosome de Buchnera. Les résultats obtenus à l'Issue de cette approche ascendante, nous ont amené à construire un premier modèle de réseau de la régulation transcriptionnelle chez Buchnera. Enfin, la quatrième partie est un travail de modélisation suivant une approche descendante. Il s'agit du développement d'une méthode d'inférence de réseau de régulation à partir de données d'expression que nous avons appelée IGOIM. Cette méthode a été validée sur des jeux de données simulées et de la littérature.

Les plantes actinorhiziennes appartiennent à 8 familles d'angiosperme et forment une symbiose fixatrice d'azote avec l'actinomycète du sol Frankia qui aboutit à la formation de nodules au niveau du système racinaire de la plante. Le nodule actinorhizien est considéré comme une racine latérale modifiée car i) il provient de divisions des cellules du péricycle situées en face du pôle de xylème, ii) il possède un méristème apical et un système vasculaire central et iii) chez certaines espèces comme Casuarina glauca une racine nodulaire est produite à l'apex de chaque lobe nodulaire. L'auxine, et notamment le transport d'influx, est impliquée dans la mise en place de la racine latérale. Nous avons donc identifié des gènes de transporteurs d'influx d'auxine chez la plante actinorhizienne C. glauca et étudié le rôle du transport d'influx au cours de la mise en place du nodule actinorhizien.<br />Deux gènes de la famille AUX-LAX codant des transporteurs d'influx d'auxine ont été identifiés C. glauca. Les profils d'expression des gènes CgAUX1 et CgLAX3 sont très conservés entre C. glauca et Arabidopsis thaliana. De plus, des analyses fonctionnelles par complémentation de mutants d'A. thaliana ont mis en évidence une équivalence entre CgAUX1 et AtAUX1. Nos études suggèrent également qu'il existe une divergence fonctionnelle au sein de la famille AUX-LAX.<br />Nous avons analysé le rôle de ces gènes au cours de la mise en place de la symbiose. Notre étude montre que le gène CgAUX1 est exprimé dans les cellules infectées tout au long de l'infection. De plus, le rôle du transport d'influx d'auxine dans le mécanisme d'infection a été confirmé par l'utilisation d'un inhibiteur du transport d'influx. Par ailleurs, le gène CgAUX1 est exprimé dans le primordium de racine latérale mais pas dans le primordium nodulaire. Cela suggère que ces deux organes présentent des différences dans leur programme de développement.<br />Afin d'identifier les mécanismes agissant en aval du transport d'influx d'auxine, nous avons étudié le rôle d'AtLAX3 chez Arabidopsis. Nous avons montré qu'un certain nombre de gènes de remodelage de la paroi sont induits par l'auxine de façon dépendante d'AtLAX3 au cours de l'émergence de la racine latérale. Nous avons cherché à identifier des gènes de remodelage de la paroi qui pourraient être impliqués dans l'infection par la bactérie Frankia de façon dépendante de CgAUX1. Cg12 qui code une protéase de type subtilisine spécifiquement exprimée dans les cellules infectées pourrait être une cible de la signalisation auxinique dépendante de CgAUX1.<br />Nos résultats suggèrent que le transport d'influx d'auxine est impliqué dans la mise en place du nodule actinorhizien chez C. glauca.