Le syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) est une maladie auto-immune systémique. Il se caractérise principalement par une infiltration lymphocytaire des glandes salivaires (GS) et lacrymales responsable d’une sécheresse buccale et oculaire. Par ailleurs,les Toll-like récepteurs (TLR) endosomaux – notamment le TLR9 qui reconnait l’acide désoxyribonucléique (ADN) microbien mais aussi, dans certaines conditions, l’ADN du soi –s’avèrent être importants pour l’activation des lymphocytes B (LB) lors du lupus, une maladie proche du SGS. Nos travaux montrent que la stimulation du TLR9 chez les LB transitionnels,des LB immatures fraichement émigrés de la moelle osseuse, favorise leur différenciation selon la voie des LB de la zone marginale, et entraine la sécrétion d’auto-anticorps. L’analyse des LB infiltrant les GS lors du SGS révèle que ce phénomène pourrait être impliqué dans la physiopathologie de cette maladie. De plus, nous montrons que LL37, un peptide produit dans les GS, pourrait participer à l’activation du TLR9 des LB transitionnels. Enfin, nous avons mis en évidence une inattendue expression du TLR9 à la surface des LB. Si l’étude des conséquences fonctionnelles de cette localisation reste à poursuivre, elle semble avoir un effet négatif sur la stimulation du TLR9 endosomal. En conclusion, ces résultats suggèrent que leTLR9 puisse être une nouvelle cible thérapeutique lors du SGS. / Primary Sjögren’s syndrome (pSS) is a systemic autoimmune disease. It is mainly characterized by B cell and T cell infiltration in lacrimal and salivary glands (SG) responsible for eye and mouth dryness. In addition, endosomal Toll-like receptors (TLR) – especially TLR9 which recognizes microbial deoxyribonucleic acid (DNA) and also, under certain conditions, self DNA – are important for B cell activation during lupus, a disease close topSS. Our work shows that TLR9 stimulation on transitional B cells, immature B cells freshly emigrated from bone marrow, promotes their differentiation into marginal zone B cell pathway and drives to auto-antibodies production. Analysis of infiltrating B cells in pSS SG reveals that this phenomenon might be involved in the pathogenesis of the disease.Furthermore, we show that LL37, a peptide produced in the SG, could participate in TLR9activation of transitional B cells. Finally, we demonstrated an unexpected TLR9 expression on B cell surface. If the functional consequences of this localization remain to be more precisely evaluated, it seems that cell surface TLR9 has a negative effect on endosomal TLR9 stimulation. In conclusion, these results suggest TLR9 could be a new therapeutic target incase of pSS.

BAFF, «facteur d'activation des lymphocytes B (LB) » contribue à l'expansion des LB autoréactifs de faible affinité lors de la mise en place de la tolérance. Cependant, les mécanismes menant à la surexpression de BAFF dans les maladies auto-immunes ne sont pas compris. Nous avons découvert un nouveau variant de BAFF, 4BAFF (dans lequel l'exon 4 est épissé), qui agit comme un facteur de transcription de son propre gène et participe à sa régulation. Ainsi, 4BAFF est préférentiellement observé dans les cellules isolées de patients atteints de maladies auto-immunes. De plus, 4BAFF régule un grand nombre de gènes associés à la réponse immunitaire innée et à la régulation de l’apoptose. Une autre constatation importante est que 4BAFF est un élément clé pour comprendre l’activité des LB régulateurs. Notre travail présente un concept entièrement nouveau suggérant qu'une cytokine peut être régulée par l'activité de l'un de ses variants d'épissage. Par ailleurs, nous avons observé que les cellules épithéliales expriment le récepteur de BAFF : BR3. Le blocage de BR3 se traduit par la translocation nucléaire de PKC et l'apoptose des cellules épithéliales. Par un effet autocrine, nous démontrons que seules certaines formes de BAFF participent à la survie des cellules épithéliales. Enfin , nous avons étudié les conséquences de l'expression du TLR9 à la surface des LB et démontrons que ce TLR9 membranaire ne fixe pas le CpG et agit comme un co-récepteur négatif du BCR. En effet, l'activation des LB par le CpG capté au niveau endosomal, est inhibée par l’action d’un anticorps anti-TLR9 se fixant au niveau membranaire. Tous ces résultats contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l'immunopathologie des maladies autoimmunes avec des applications potentielles en thérapeutique. / Elevated expression of ‘B cell activating factor’ (BAFF), a potent B cell survival factor contributes to the expansion of low-affinity self-reactive B cells during the establishment of tolerance. However, mechanisms leading to BAFF over-expression in autoimmune diseases are not understood. We reported the discovery of a new variant for BAFF, 4BAFF in humans (in which exon 4 is excised) or 5BAFF in mice (in which exon 5 is excised), which acts as a transcription factor of the full-length form of BAFF, and which is preferentially found in cells isolated from patients with autoimmune diseases. When transfected in human B cells, D4BAFF upregulates a large number of genes associated with immune response and especially innate immunity and regulation of apoptotis. Furthermore D4BAFF acts, in association with p50 from the NF- B pathway, as a transcription factor for its own parent gene. Another important finding is that 4BAFF is an important component of the efficacy of regulatory B cell activity. Our work introduces an entirely novel concept in biology suggesting that a human cytokine gene can be transcriptionally regulated by the activity of one of its own splice variants.We have also tried to understand the complexity of the various forms of BAFF. We observed that epithelial cells expressed BAFF-receptor (BR3) and produce BAFF suggesting autocrine properties. Blocking BR3 results in nuclear translocation of PKC promoting epithelial cell apoptosis.Furthermore, only some forms of BAFF are required for epithelial cell survival. Finally, we studied the consequences of the expression of TLR9 on the B cell surface and demonstrated that TLR9 acts as a co-receptor of the B cell receptor to influence B cell fate independently of CpG binding. We show that CpG activation of B cells, acting synergistically with BCR signals, was inhibited by anti-TLR9 stimulation. Induction of CD25 expression and proliferation of B cells were thus down-regulated by engagement of cell surface TLR9. Overall, our results indicate that TLR9 expressed on B cell plasma membrane might be a negative regulator of endosomal TLR9, and could provide a novel control by which activation of autoreactive B cells is restrained. All these findings contribute to a better understanding on immunopathology of autoimmune diseases with potential applications in therapy.

Le syndrome sec de Gougerot Sjögren (SGS) est une maladie auto-immune chronique qui présente des dommages progressifs et irréversibles des glandes exocrines lacrymales et salivaires. Cette pathologie affecte entre 0.1 et 3 % de la population et est plus commune chez les femmes avec un ratio de 9 femmes pour 1 homme. Dans la glande salivaire, une infiltration lymphocytaire est observée et est associée avec la destruction de l'épithélium sécrétoire, qui joue un rôle central dans l'initiation et le développement du SGS. Le processus physiopathologique est loin d’être compris et semble dépendant de phénomènes épigénétiques. En effet, des perturbations importantes de la méthylation de l'ADN sont observées dans les cellules épithéliales en lien avec le niveau d’infiltration lymphocytaire des glandes salivaires.L'objectif de ce travail est de mieux comprendre les changements épigénétiques au cours du SGS et en particulier les défauts de méthylation/déméthylation de l’ADN observés dans les Cellules Epithéliales de Glandes Salivaires (SGEC) et leurs rôles dans le développement de la pathologie.Dans ce but, Une étude globale de la méthylation de l'ADN a été réalisée après culture cellulaire destinée à isoler les SGEC de patients SGS. La puce « human methylation 450k » d’Illumina utilisée couvre plus de 485 000 sites CpG du génome. Des analysesbioinformatiques nous ont permis d'obtenir un panel de gènes différentiellement méthylés. Nous avons ainsi mis en évidence l’importance de la voie calcique (déméthylée, connue pour avoir un impact sur la salivation) et de la voie WNT (hyperméthylée). De plus nous avons pu identifier une régulation interféron et montrer l’importance d’un changement du type d'interféron (I à II) lors de l’évolution vers un lymphome de type MALT. En outre, nous montrons qu’il existe une inter-relation forte entre les processus épigénétiques et les facteurs génétiques associés au SGS. Enfin la dernière partie de ce travail met en lumière l’implication d’un environnement inflammatoire dans le contrôle du processus de méthylation/déméthylation de l’ADN dans les cellules épithéliales.Ainsi, les altérations du méthylome des SGECs pourraient contribuer à la pathophysiologie du SGS et à son évolution en un lymphome du MALT, ceci en lien avec son environnement inflammatoire. / Sjögren Syndrome (SjS) is a chronic autoimmune disease characterized by a progressive and irreversible damage of exocrine glands, particularly salivary and lacrymal glands. This pathology affects between 0.1 and 3% of the population and is more common in women with a ratio of 9 women for 1 man. In salivary glands, a lymphocytic infiltration is observed and associated with the destruction of the secretory epithelium, which plays a central role in initiation and development of the SjS. The process remains incompletely clarified and contains a strong epigenetic component. Indeed, important disturbances of the process of DNA methylation are observed in epithelial cells and they are linked with the level of lymphocyte infiltration in salivary glands.The objective of this work is to better understand epigenetic changes during the SjS and in particular the DNA methylation/demethylation defects observed in Salivary Gland Epithelial Cells Epithelial (SGEC) and their roles in the pathology development.For that purpose, a global study of DNA methylation was done on 12 patients SGECs with the Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina). The 450k HM allows to cover more than 485,000 CpG sites on the whole genome. Bioinformatic analysis allowed us to obtain genes panels which are differentially methylated during this pathological phenomenon. In an interesting way, we identified the potential involvement of the calcic (hypomethylated, known to impact salivation) and WNT pathways (hypermethylated). Besides we were able to identify interferon regulation and the shift from interferon type I to type II with mucosa associated lymphoid tissue (MALT) lymphoma evolution. Furthermore, the simultaneous genomic–epigenomic analysis revealed significant associations between SjS-associated genetic risk factors and epigenetic modifications. Finally, the last part of this work highlights inflammatory environment involvement to control DNA methylation/demethylation in salivary gland epithelial cells.Altogether, alterations of DNA methylation in SGEC may contribute to SjS pathophysiology and evolution to MALT and this in link with the inflammatory environment.

Le syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) est une maladie auto-immune systémique. Il se caractérise principalement par une infiltration lymphocytaire des glandes salivaires (GS) et lacrymales responsable d'une sécheresse buccale et oculaire. Par ailleurs,les Toll-like récepteurs (TLR) endosomaux - notamment le TLR9 qui reconnait l'acide désoxyribonucléique (ADN) microbien mais aussi, dans certaines conditions, l'ADN du soi -s'avèrent être importants pour l'activation des lymphocytes B (LB) lors du lupus, une maladie proche du SGS. Nos travaux montrent que la stimulation du TLR9 chez les LB transitionnels,des LB immatures fraichement émigrés de la moelle osseuse, favorise leur différenciation selon la voie des LB de la zone marginale, et entraine la sécrétion d'auto-anticorps. L'analyse des LB infiltrant les GS lors du SGS révèle que ce phénomène pourrait être impliqué dans la physiopathologie de cette maladie. De plus, nous montrons que LL37, un peptide produit dans les GS, pourrait participer à l'activation du TLR9 des LB transitionnels. Enfin, nous avons mis en évidence une inattendue expression du TLR9 à la surface des LB. Si l'étude des conséquences fonctionnelles de cette localisation reste à poursuivre, elle semble avoir un effet négatif sur la stimulation du TLR9 endosomal. En conclusion, ces résultats suggèrent que leTLR9 puisse être une nouvelle cible thérapeutique lors du SGS.

Le syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) est une maladie autoimmune (MAI) systémique inflammatoire chronique caractérisée principalement par la diminution des secrétions salivaires et lacrymales, aboutissant à une sécheresse de la bouche et des yeux. Elle affecte principalement les femmes autour de la ménopause. Au niveau physiologique, le tissu épithélial des glandes salivaires (GS) est infiltré par des lymphocytes, ce qui provoque l'apoptose des cellules épithéliales (CE). L'épigénétique pouvant jouer un rôle important dans le développement des MAI comme le SGS, nous avons analysé l'expression d'éléments rétroviraux endogènes humains (HERV) et des microARN. Par ailleurs, afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les interactions lymphocytes-CE au niveau de la GS pathologique, nous avons mis en place un modèle de co-culture in vitro entre des CE et des lymphocytes B ou T (LB, LT). Nous avons également étudié le rôle de BAFF sur les CE qui expriment l'un de ses récepteurs, BR3.Dans un premier temps, nous avons montré que dans les GS des patients, les HERV et les miARN ont un profil d'expression distinct de celui des personnes saines, montrant ainsi une participation de l'épigénétique dans la pathologie. Dans un deuxième temps, nous avons montré que les CE entrent en apoptose suite à l'interaction directe avec les lymphocytes B etT, en faisant intervenir la voie Fas pour les LT et la voie de la PKCδ pour les LB. En lien avec l'apoptose induite par les LB, nous avons démontré que BAFF est impliqué dans la survie des CE, et que le blocage de sa signalisation ou la sous-expression de son récepteur conduit à la mort des CE. Nous pouvons supposer que les LB entrent en compétition avec les CE pour le signal de survie apporté par BAFF, et que les CE qui s'en trouvent privées meurent. Finalement, nous avons montré que plusieurs formes de BAFF sont produites parles CE et reconnues de manière différente par les anticorps anti-BAFF. Il pourrait s'agir d'isoformes plus ou moins glycosylés ou de variants de BAFF. Cependant d'autres études sont nécessaires afin de les identifier.

Le syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) est une maladie autoimmune (MAI) systémique inflammatoire chronique caractérisée principalement par la diminution des secrétions salivaires et lacrymales, aboutissant à une sécheresse de la bouche et des yeux. Elle affecte principalement les femmes autour de la ménopause. Au niveau physiologique, le tissu épithélial des glandes salivaires (GS) est infiltré par des lymphocytes, ce qui provoque l’apoptose des cellules épithéliales (CE). L’épigénétique pouvant jouer un rôle important dans le développement des MAI comme le SGS, nous avons analysé l’expression d’éléments rétroviraux endogènes humains (HERV) et des microARN. Par ailleurs, afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les interactions lymphocytes-CE au niveau de la GS pathologique, nous avons mis en place un modèle de co-culture in vitro entre des CE et des lymphocytes B ou T (LB, LT). Nous avons également étudié le rôle de BAFF sur les CE qui expriment l’un de ses récepteurs, BR3.Dans un premier temps, nous avons montré que dans les GS des patients, les HERV et les miARN ont un profil d’expression distinct de celui des personnes saines, montrant ainsi une participation de l’épigénétique dans la pathologie. Dans un deuxième temps, nous avons montré que les CE entrent en apoptose suite à l’interaction directe avec les lymphocytes B etT, en faisant intervenir la voie Fas pour les LT et la voie de la PKCδ pour les LB. En lien avec l’apoptose induite par les LB, nous avons démontré que BAFF est impliqué dans la survie des CE, et que le blocage de sa signalisation ou la sous-expression de son récepteur conduit à la mort des CE. Nous pouvons supposer que les LB entrent en compétition avec les CE pour le signal de survie apporté par BAFF, et que les CE qui s’en trouvent privées meurent. Finalement, nous avons montré que plusieurs formes de BAFF sont produites parles CE et reconnues de manière différente par les anticorps anti-BAFF. Il pourrait s’agir d’isoformes plus ou moins glycosylés ou de variants de BAFF. Cependant d’autres études sont nécessaires afin de les identifier. / Sjögren’s syndrome (SS) is an inflammatory systemic autoimmune disease (AID), mainly characterized by the decrease of salivary and lachrymal secretions. This leads to dry mouthand dry eyes. This chronic disease principally affects women around menopause. At the physiological level, salivary gland (SG) epithelial tissue is infiltrated by lymphocytes, leading to epithelial cells (EC) apoptosis. As epigenetics can play an important role in AID- such asSS development, we investigated human endogenous retroviral elements (HERV) and microRNA expression. Furthermore, in order to better understand the cellular and molecular mechanisms implied in lymphocyte-EC interactions in pathological SG, we set up an in vitroco-culture model between EC and B and T cells. We also studied BAFF role on EC which express one of its receptors, BR3. First, we demonstrated that in SS SG, HERVs and miRNAs show a distinct profile from healthy controls, indicating that epigenetics is implied in the pathology. Secondly, we showed that EC undergo apoptosis following direct interaction with T and B cells, via two distincts ignaling pathways: Fas pathway for T cells and PKCδ pathway for B cells. Linked with Bcell-induced apoptosis, we demonstrated that BAFF is implied in EC survival, and that BAFFsignaling blocking or BR3 down-regulation leads to EC death. We may suppose that B cells compete with EC for survival signaling from BAFF, and that EC die from lack of it. Finally, we showed that several forms of BAFF are expressed by EC and that they are differentially recognized by anti-BAFF antibodies. These may be more or less glycozylated BAFF isoformsor BAFF variants. Further studies are needed to identify them.

Le virus d'Epstein-Barr (EBV), est un gamma herpes virus exclusivement humain qui infecte près de 95% de la population adulte. EBV établit un cycle de latence dans les cellules B mémoires et les cellules épithéliales. EBV entre périodiquement dans une réplication lytique avec sécrétion des virions dans la salive. L’infection EBV est associée à l’apparition de lymphomes, de cancers et de maladies auto-immunes. Les conditions favorisant le développement de ces pathologies restent mal connues mais l’immunodépression et potentiellement l’activation des lymphocytes B nécessaire à la réplication d’EBV jouent un rôle clé.Nous avons examiné l’association entre activation des cellules B dans le compartiment systémique et le contrôle sur le réservoir de l’EBV. Deux situations cliniques d’activation chronique des cellules B ont été explorées ; le syndrome de Gougerot-Sjögren et la mastite subclinique dans le contexte de l’infection par le VIH.Dans ce travail de thèse, nous avons tout d’abord développé une PCR en temps réel pour la quantification de l'ADN de EBV ciblant la région répétée BamHI-W du génome. Le travail de validation de la technique a permis d’évaluer précisément le gain de sensibilité comparativement à une qPCR LMP2 (cible unique). L’impact des variations de répétition de la séquence BamHI-W suivant les souches et isolats EBV a également été analyse.Dans un deuxième travail, nous avons montré que, la mastite subclinique était fréquente au cours de l’allaitement et qu’elle était un facteur indépendant associé à une augmentation de l'excrétion EBV par le lait maternel. Cette sécrétion est associée localement à l’inflammation et à l’excrétion du VIH ce qui témoigne de phénomène de synergie entre les deux virus. Nous avons également démontré que l'ADN EBV dans le lait maternel peut être résistant à la DNase et que le virus était est probablement encapsidé dans le lait, donc potentiellement infectieux.Enfin, bénéficiant d’un accès aux prélèvements de la cohorte ASSESS nous avons recherché de possible anomalie du contrôle de l’infection EBV dans le compartiment sanguin au cours du syndrome de Gougerot-Sjögren primaire dans lequel les lésions glandulaires salivaires et lacrymales sont associées à la présence d’EBV. Nous avons démontré que le réservoir EBV et la réplication EBV dans le compartiment systémique sont bien contrôlées au cours du syndrome de Gougerot-Sjögren primaire. La réponse anticorps contre l’antigène précoce d’EBV (EA) n'était pas associée à une augmentation de l'ADN de EBV.Ce travail de thèse, souligne le lien entre l'activation des lymphocytes B, l'inflammation chronique et le contrôle sur le réservoir d’EBV. Dans la glande mammaire le contrôle de l’infection EBV est perturbé en cas de mastite subclinique. Au contraire dans le syndrome de Gougerot-Sjögren l’infection reste bien contrôlée dans le compartiment sanguin malgré l’activation des lymphocytes B et la présence renforcée du virus dans les lésions glandulaires. / TEpstein-Barr virus (EBV), an ubiquitous human gammaherpesvirus affects 95% of adult human population and establishes a lifelong latency in memory B cells periodically entering into lytic replication with further propagation in oropharyngeal epithelia and shedding through saliva. Latent EBV infection is associated with lymphomas, carcinomas and autoimmune diseases. Although the conditions favoring the development of these pathologies are not completely understood, the immunosuppression and B cell activations play an important role in EBV-associated diseases.We examined the control over the EBV reservoir in a diseases associated with B cell activation. Two clinical situations associated with altered B cell activation were explored: primary Sjogren’s syndrome and subclinical mastitis in HIV-infected mothers.Primarily, we developed an in-house real-time PCR for EBV DNA quantification targeting the repetitive BamHI-W region of EBV DNA. The validation analyses enabled to evaluate the gain in sensitivity of the BamHI-W test relative to single repeat LMP2 qPCR. The impact of the variations in BamHI-W reiteration on EBV DNA quantification was further assessed on different EBV strains and clinical samples.In a second study, we showed that subclinical mastitis was common during breastfeeding, and it was an independent factor associated with increased EBV breast milk shedding. This secretion was associated with local inflammation and HIV shedding, reflecting synergy between the two viruses. We have also demonstrated that breast milk EBV DNA may be resistant to DNase, and the virus was probably encapsidated in the breast milk and thus potentially infectious.Finally, with an access to ASSESS cohort we looked for possible abnormal control over EBV infection in the blood compartment in primary Sjögren's syndrome, where salivary and lacrimal gland lesions were shown to be associated with the local activation of EBV. We have demonstrated that in primary Sjogren's syndrome EBV reservoir and replication in the systemic compartment are well controlled. The antibody response against EBV early antigen (EA) was not associated with increased DNA EBV.This thesis points out the link between the activation of B cells, chronic inflammation and control over the reservoir of EBV. In the mammary gland disturbed control of EBV infection is linked with subclinical mastitis. In contrast, in primary Sjogren’s syndrome EBV infection remains well controlled in the blood compartment despite the activation of B cells and the increased presence of the virus in glandular lesions.