La famille des protéines kinases C (PKC) est essentielle pour la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine qui signale et active les plaquettes via les proteases activated receptors (PAR-1 et PAR-4) et le GPIbα. Ces derniers constituent les récepteurs de moyenne/faible et de hautes affinités pour la thrombine, respectivement. L’isoforme PKCδ régule positivement ou négativement la fonction des plaquettes tout dépendamment de la nature du stimulus. Cependant, son importance dans la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine en aval de la GPIbα reste inconnue. L’objectif principal de ce projet de doctorat était de déterminer l'implication de l'axe thrombine/GPIbα/PKCδ dans la fonction plaquettaire et d’évaluer le rôle de cet axe dans la régulation de la thrombose. Dans les plaquettes humaines, le prétraitement avec l'inhibiteur spécifique de la PKCδ δ(V1-1)TAT, a significativement potentialisé l'activation et l’agrégation des plaquettes en réponse à de faibles concentrations de α-thrombine, mais pas en réponse à la γ-thrombine ou aux agonistes des PARs. Ce phénomène de potentialisation a été associé à une sécrétion accrue de granules, de génération de thromboxane A2 (TXA2) et une phosphorylation de la PKCδ sur la Tyr311, qui ont toutes été prévenues par l’inhibition spécifique du GPIbα à l’aide d’un anticorps monoclonal bloquant. En outre, l'inhibition de la p38 MAPK, ERK1/2 et le TXA2 a inversé ce processus de potentialisation. Les plaquettes murines déficientes en PKCδ étaient aussi plus réactives à la thrombine et ont montré une augmentation significative de l'agrégation, alors qu’une étude menée in vivo chez la souris PKCδ- /- a montré, suite à une stimulation par α-thrombine, une réaction thrombotique accrue caractérisée par une diminution significative du temps de saignement ainsi qu’une formation de thrombo-embolies pulmonaires. En bloquant le GPIbα, ces effets ont été renversés. Cette étude ouvre de nouvelles perspectives quant au rôle de la PKCδ dans les plaquettes en aval de GPIbα, où elle régule négativement la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine. Ainsi, l'axe thrombine/GPIbα/PKCδ dans les plaquettes pourrait représenter un régulateur critique de la fonction plaquettaire et l'hémostase, et le dysfonctionnement de cette voie pourrait conduire à des événements thrombotiques. / The protein kinase C (PKC) family is essential for platelet function in response to thrombin, which signals and activates platelets via protease-activated receptors (PARs) and GPIbα, the low/medium and high affinity receptors in human platelets, respectively. PKCδ positively and negatively regulates platelet function depending on the nature of the stimulus. However, its importance in platelet function in response to thrombin downstream of GPIbα remains unknown. Here, we aimed to determine the involvement of the thrombin/GPIbα/PKCδ axis in platelet function and investigate the relevance of this axis in regulating thrombosis. In human platelets, pre-treatment with the specific PKCδ inhibitor δ(V1-1)TAT significantly potentiated platelet activation and aggregation in response to a priming concentration of α-thrombin, but not to γ-thrombin or PAR agonists. This potentiation process was associated with enhanced granule secretion, TXA2 generation and PKCδ phosphorylation on Tyr311, all of which were prevented by GPIbα blockade. Moreover, inhibition of p38 MAPK, Erk1/2 and TXA2 reverses this potentiation process. Platelets from PKCδ-/- mice show increased aggregation, whereas PKCδ-/- mice exhibit significantly decreased in vivo tail bleeding times and exacerbated pulmonary thrombo-emboli in response to α-thrombin. Blockade of GPIbα protects PKCδ-/- mice from these effects. This study adds new insights into the role of PKCδ in platelets downstream of GPIbα, where it negatively regulates platelet function in response to thrombin. Thus, the thrombin/GPIbα/PKCδ axis in platelets may represent a critical regulator of platelet function and hemostasis, and dysfunction of this pathway could lead to adverse thrombotic events.

Le syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) est une maladie autoimmune (MAI) systémique inflammatoire chronique caractérisée principalement par la diminution des secrétions salivaires et lacrymales, aboutissant à une sécheresse de la bouche et des yeux. Elle affecte principalement les femmes autour de la ménopause. Au niveau physiologique, le tissu épithélial des glandes salivaires (GS) est infiltré par des lymphocytes, ce qui provoque l’apoptose des cellules épithéliales (CE). L’épigénétique pouvant jouer un rôle important dans le développement des MAI comme le SGS, nous avons analysé l’expression d’éléments rétroviraux endogènes humains (HERV) et des microARN. Par ailleurs, afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les interactions lymphocytes-CE au niveau de la GS pathologique, nous avons mis en place un modèle de co-culture in vitro entre des CE et des lymphocytes B ou T (LB, LT). Nous avons également étudié le rôle de BAFF sur les CE qui expriment l’un de ses récepteurs, BR3.Dans un premier temps, nous avons montré que dans les GS des patients, les HERV et les miARN ont un profil d’expression distinct de celui des personnes saines, montrant ainsi une participation de l’épigénétique dans la pathologie. Dans un deuxième temps, nous avons montré que les CE entrent en apoptose suite à l’interaction directe avec les lymphocytes B etT, en faisant intervenir la voie Fas pour les LT et la voie de la PKCδ pour les LB. En lien avec l’apoptose induite par les LB, nous avons démontré que BAFF est impliqué dans la survie des CE, et que le blocage de sa signalisation ou la sous-expression de son récepteur conduit à la mort des CE. Nous pouvons supposer que les LB entrent en compétition avec les CE pour le signal de survie apporté par BAFF, et que les CE qui s’en trouvent privées meurent. Finalement, nous avons montré que plusieurs formes de BAFF sont produites parles CE et reconnues de manière différente par les anticorps anti-BAFF. Il pourrait s’agir d’isoformes plus ou moins glycosylés ou de variants de BAFF. Cependant d’autres études sont nécessaires afin de les identifier. / Sjögren’s syndrome (SS) is an inflammatory systemic autoimmune disease (AID), mainly characterized by the decrease of salivary and lachrymal secretions. This leads to dry mouthand dry eyes. This chronic disease principally affects women around menopause. At the physiological level, salivary gland (SG) epithelial tissue is infiltrated by lymphocytes, leading to epithelial cells (EC) apoptosis. As epigenetics can play an important role in AID- such asSS development, we investigated human endogenous retroviral elements (HERV) and microRNA expression. Furthermore, in order to better understand the cellular and molecular mechanisms implied in lymphocyte-EC interactions in pathological SG, we set up an in vitroco-culture model between EC and B and T cells. We also studied BAFF role on EC which express one of its receptors, BR3. First, we demonstrated that in SS SG, HERVs and miRNAs show a distinct profile from healthy controls, indicating that epigenetics is implied in the pathology. Secondly, we showed that EC undergo apoptosis following direct interaction with T and B cells, via two distincts ignaling pathways: Fas pathway for T cells and PKCδ pathway for B cells. Linked with Bcell-induced apoptosis, we demonstrated that BAFF is implied in EC survival, and that BAFFsignaling blocking or BR3 down-regulation leads to EC death. We may suppose that B cells compete with EC for survival signaling from BAFF, and that EC die from lack of it. Finally, we showed that several forms of BAFF are expressed by EC and that they are differentially recognized by anti-BAFF antibodies. These may be more or less glycozylated BAFF isoformsor BAFF variants. Further studies are needed to identify them.

Le syndrome de Gougerot-Sjögren (SGS) est une maladie autoimmune (MAI) systémique inflammatoire chronique caractérisée principalement par la diminution des secrétions salivaires et lacrymales, aboutissant à une sécheresse de la bouche et des yeux. Elle affecte principalement les femmes autour de la ménopause. Au niveau physiologique, le tissu épithélial des glandes salivaires (GS) est infiltré par des lymphocytes, ce qui provoque l'apoptose des cellules épithéliales (CE). L'épigénétique pouvant jouer un rôle important dans le développement des MAI comme le SGS, nous avons analysé l'expression d'éléments rétroviraux endogènes humains (HERV) et des microARN. Par ailleurs, afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les interactions lymphocytes-CE au niveau de la GS pathologique, nous avons mis en place un modèle de co-culture in vitro entre des CE et des lymphocytes B ou T (LB, LT). Nous avons également étudié le rôle de BAFF sur les CE qui expriment l'un de ses récepteurs, BR3.Dans un premier temps, nous avons montré que dans les GS des patients, les HERV et les miARN ont un profil d'expression distinct de celui des personnes saines, montrant ainsi une participation de l'épigénétique dans la pathologie. Dans un deuxième temps, nous avons montré que les CE entrent en apoptose suite à l'interaction directe avec les lymphocytes B etT, en faisant intervenir la voie Fas pour les LT et la voie de la PKCδ pour les LB. En lien avec l'apoptose induite par les LB, nous avons démontré que BAFF est impliqué dans la survie des CE, et que le blocage de sa signalisation ou la sous-expression de son récepteur conduit à la mort des CE. Nous pouvons supposer que les LB entrent en compétition avec les CE pour le signal de survie apporté par BAFF, et que les CE qui s'en trouvent privées meurent. Finalement, nous avons montré que plusieurs formes de BAFF sont produites parles CE et reconnues de manière différente par les anticorps anti-BAFF. Il pourrait s'agir d'isoformes plus ou moins glycosylés ou de variants de BAFF. Cependant d'autres études sont nécessaires afin de les identifier.