Le virus d'Epstein-Barr (EBV) est un γ -herpesvirus humain. Il est responsable de maladies telles que la mononucléose-infectieuse et il est associé à de nombreux<br />carcinomes et syndromes immunoprolifératifs. A la différence d'autres herpesvirus tel que herpes-simplex, il n'existe actuellement aucun médicament efficace contre EBV. Le génome d'EBV contient 86 cadres de lecture soit autant de cibles potentielles pour une approche de génomique structurale, permettant le développement rationnel de nouvelles thérapies. La première série de cibles sur laquelle nous avons travaillé code pour 23 protéines. De façon inattendue, le principal problème rencontré lors de ce projet fut la faible expression ainsi que l'insolubilité d'une grande partie des cibles.<br />Parmi les 8 protéines solubles, 5 furent cristallisées à l'issue de quoi, 4 structures furent résolues. La clef de la réussite de ce projet fut un traitement individuel de chaque cible plutôt que l'utilisation de protocoles standards. La partie centrale de ce travail porte sur l'Uracile-ADN Glycosylase (UNG). C'est une enzyme de réparation de l'ADN. Il nous fut impossible d'obtenir des cristaux de la protéine seule, mais, grâce à la formation d'un complexe avec une protéine inhibitrice produite par le phage PBS-2, nous obtînmes des cristaux diffractant à 2.3 Å. La structure de ce complexe nous permis l'expliquer l'organisation de la « boucle leucine », un domaine du site actif, qui comporte une insertion de 7 résidus chez tous les γ-herpesvirus. Malgré cette différence, les constantes catalytiques de l'UNG d'EBV sont proches de celles des autres UNGs ce qui suggère un mécanisme similaire d'interaction avec l'ADN. Le travail sur d'autres cibles et les difficultés qui leur sont <br />inhérentes est également abordé (notamment l'Alkaline Exonucléase).

Dans les pays occidentaux, les lymphomes T périphériques et NK représentent environ 10% des lymphomes non-Hodgkiniens. Le lymphome NK/T de type nasal est l'une des entités de présentation extra-ganglionnaire les plus fréquentes, en Asie, et en Amérique Centrale et du Sud. Il survient classiquement dans la sphère nasopharyngée avec une prédilection pour les adultes jeunes. Morphologiquement, la tumeur est souvent angiocentrique avec une invasion de la paroi des vaisseaux par les cellules tumorales d'aspect variable. Ces lymphomes ont le plus souvent une origine NK avec un phénotype CD3+ (cytoplasmique), CD5-, CD56+, CD4-/CD8-, expression des molécules cytotoxiques et absence de réarrangement des gènes des récepteurs T. Le virus d'Epstein-Barr est présent dans la quasi-totalité des cellules tumorales dans sa forme clonage épisomale, avec une latence de type II, suggérant son rôle dans l'oncogenèse. A côté des mutations fréquentes des gènes FAS et TP53 (p53) et des méthylations de TP73 et CDKN2A (p16), des délétions du bras long du chromosome 6q sont fréquemment observées. Très récemment, des méthylations et des mutations des gènes suppresseurs de tumeur PRDM1, ATG5, et AIM1 localisés en 6q21 ont été retrouvées dans les lignées de lymphome NK/T de type nasal. Nous avons réalisé une analyse combinée du profil d'expression génique et du profil génomique par hybridation comparative sur puces, d'échantillons tumoraux de lymphome NK/T de type nasal (n=9) et de lignées, comparés à celle de lymphocytes NK normaux et de lymphomes T périphériques, sans autre spécificité (PTCL, NOS). Nous avons identifié la signature moléculaire particulière du lymphome NK/T de type nasal caractérisée par un haut niveau des trascrits de marqueurs de cellules NK et de molécules cytotoxiques, notamment de granzyme H dans les lymphomes NK/T de type nasal comparé aux PTCL, NOS. Par immunohistochimie, nous avons validé l'expression "spécifique" de granzyme H par les cellules tumorales du lymphome NK/T de type nasal, qui pourrait constituer un nouveau marqueur de ces lymphomes. Comparé aux cellules NK normales, le lymphome NK/T de type nasal a une signature plus proche des cellules NK activées que des NK au repos et sur-expriment des gènes associés à la biologie vasculaire, des gènes induits par l'EBV, et PDGFRA. Nous avons confirmé l'expression protéique de PDGFRAa et de sa forme phosphorylée, et montré in vitro la sensibilité de la lignée tumorale MEC04 à l'imatinib mesytale. La dérégulation des voies de signalisation AKT, JAK-STAT et NF-kB, suggérée par les analyses bioinformatiques, a été corroborée par la mise en évidence d'une expression nucléaire des formes phosphorylées d'AKT, de STAT3 et de RelA dans les lymphomes NK/T de type nasal. De plus, plusieurs gènes dérégulés dans ces voies moléculaires sont localisés dans des régions altérées de manière récurrente par des gains ou des pertes (AKT3 (1q44), IL6R (1q21.3), CCL2 (17q12), TNFRSF21 (6p12.3)). En plus de l'activation constitutive de STAT3 confirmée par l'expression nucléaire de phospho-STAT3, l'inhibition de croissance et l'augmentation de la mort cellulaire des cellules de la lignée MEC04 résultant de l'inhibition de STAT3 conforte le rôle de STAT3 dan la lymphomagenèse du lymphome NK/T nasal. L'analyse intégrée a également mis en évidence la dérégulation du gène suppresseur de tumeur HACE1 en 6q21, confirmée par RT-PCR quantitative. Bien que les mécanismes exacts conduisant à l'activation de plusieurs voies moléculaires, de même qu'à la dérégultaion de HACE1 ne soient pas déterminés, nos résultats identifient plusieurs voies oncogéniques impliquées dans le lymphome NK/T de type nasal ainsi que de nouveaux biomarqueurs diagnostiques - comme granzyme H - et des cicles thérapeutiques d'intérêt. L'étude en cours du profil d'expression des microARNs pourrait apporter un éclairage sur les mécanismes impliqués dans certaines voies identifiées / In Western countries, mature natural killer (NK)- and T-cell lymphomas account for 15% to 20% of aggressive lymphomas and around 10 % of all non-Hodgkin lymphomas. This number is higher in Asia, with 25% in Japan and 39% in Taiwan. Among those T- and NK-cell lymphomas with primary extranodal presentation, extranodal NK/T-cell lymphoma of nasal type (nasal NKTCL) is one of the most common entities in Asian, Central and South American populations. It classically arises in the nasal region showing a predilection for young adults with male predominance. This tumor morphologically exhibits an angiocentric and angio destructive growth pattern, admixed with polymorphous non-neoplastic infiltrates. Most tumor cells have a cytoplasmic CD3+, CD5-, CD56+, CD4-/CD8- phenotype with expression of cytotoxic granule-associated proteins and without rearrangement of T-cell receptors genes. Killer immunoglobulin-like receptors have been reproted to be expressed in a subset of this lymphoma and its expression might be associated with prognosis. Epstein-Barr virus is present in virtually all neoplastic cells in its clonal episomal form with type II latency program, implying a role in oncogenesis. Although the results were variable between different studies, methylations of TP73 (p73) and CDKN2A (p16) and mutations of FAS and TP53 (p53) were frequently found in nasal NKTCL. Genomic alterations have also been reported in nasal NKTCL with frequent deletion in chromosome 6q. A very recent study also identified both methylations and mutations of three putative tumor suppressor genes PRDM, ATG5, and AIM1 mapping to del6q21 in nasal NKTCL cell times. We performed integrative gene expression profiling and array-based comparative genomic hybridization analyses of nasal NKTCL tumors as well as tumour-derived cell lines, compared to that of normal NK cells and peripheral T-cell lymphomas, not otherwise specified (PTCL, NOS). We identified the distinctive molecular signature of nasal NKTCL with high transcript levels for NK-cell markers ans cytotoxic molecules, especially granzyme H in nasal NKTCL compared to PTCL, NOS. By immunohistochemistry, we validated expression of grnzyme H which appears a novel sensitive biomarker of nasal NKTCL. Compared to normal NK cells, nasal NKTCL tumors were closer to activated than resting cells and overexpressed several genes related to vascular biology, EBV-induced genes and PDGFRA. Notably, we confirmed the expression of PDGFRa and its phosphorylated form at the protein level, and in vitro the MEC04, nasal NKTCL-cell line, was sensitive to imatinib mesylate. Deregulation of the AKT, JAK-STAT and NF-kB pathways suggested by bioinformatical analysis, was corroborated by nuclear expression of phosphorylated AKT, STAT3 and RelA in nasal NKTCL, and several deregulated genes in these pathways mapped to regions of recurrent copy number aberrations (AKT3 (1q44), IL6R (1q21.3), CCL2 (17q12), TNFRSF21 (6p12.3)). In addition to constitutive activation of STAT3 as confirmed by the demonstration of phosphorylated STAT3 in the nuclei of neoplastic nasal NKTCL cells, growth inhibition and cell death of nasal NKTCL cells induced by STAT3 inhibition implied the role of STAT3 in the nasal NK/T-cell lymphomagenesis. Integrative analysis and qRT-PCR analysis also evidenced deregulation of another tumor suppressor HACE1 in the frequently deleed 6q21 region. Although the exact mechanism of activation of several pathways as well as that of HACE1 deregulation remains to be determined, our studies highlight emerging oncogenic pathways in nasal NKTCL and identify novel diagnostic and therapeutic targets. The ongoing investigation of microRNA expression profiling might shed light in a better understanding of the pathogenesis of nasal NKTCL and especially of the activation of oncogenic pathways. Connectivity map analysis may also help to depict other targeted therapies useful to improve the prognosis of this agressive lymphoma

Le virus d'Epstein-Barr (EBV) est un gamma-Herpesvirus associé à de nombreux cancers chez l'homme. In vitro, l'infection de lymphocytes B primaires par EBV conduit à leur immortalisation (genèse de lignées lymphoblastoides (LCL)). Dans ces cellules, seules 9 protéines virales (protéines dites de latence) sont exprimées et coopèrent pour stimuler la prolifération des cellules. Afin de comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels les 3 protéines de latence de la famille EBNA3 (-3A, -3B et -3C) participent à l'induction et au maintien de la prolifération cellulaire induite par EBV, nous avons réalisé un crible deux-hybrides dans la levure en utilisant EBNA-3A, -3B ou -3C comme appâts. Ce crible nous a permis d'identifier de nombreux nouveaux partenaires particulièrement pertinents au vu de ce que l'on connaît des rôles respectifs des protéines EBNA3. Parmi les nouveaux partenaires de la protéine EBNA-3A se trouve le facteur de transcription Miz-1 qui est connu pour jouer un rôle clef dans l'arrêt du cycle cellulaire en transactivant l'expression de gènes tels CDKN1A, CDKN1C et CDKN2B. Nous avons validé cette interaction par GST-pull down ainsi que par co-immunoprécipitation en cellules humaines. Nous avons ensuite étudié l'effet de la protéine virale EBNA-3A sur l'activation de la transcription induite par Miz-1. Pour cela, nous avons comparé le niveau des transcrits de certains gènes cibles de Miz-1 dans des LCL exprimant ou non EBNA-3A et avons trouvé que certains gènes codant des inhibiteurs du cycle cellulaire sont différemment exprimés en présence d'EBNA-3A. Enfin, nous avons pu montrer que la protéine virale EBNA-3A est capable de réprimer l'activation de la transcription de Miz-1 en inhibant le recrutement de l'une de ses protéines co-activatrices, la protéine NPM. Ces résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes par lesquels les protéines EBNA3 et plus largement EBV, dérégulent le cycle cellulaire.

Le virus d'Epstein-Barr (EBV), est un gamma herpes virus exclusivement humain qui infecte près de 95% de la population adulte. EBV établit un cycle de latence dans les cellules B mémoires et les cellules épithéliales. EBV entre périodiquement dans une réplication lytique avec sécrétion des virions dans la salive. L’infection EBV est associée à l’apparition de lymphomes, de cancers et de maladies auto-immunes. Les conditions favorisant le développement de ces pathologies restent mal connues mais l’immunodépression et potentiellement l’activation des lymphocytes B nécessaire à la réplication d’EBV jouent un rôle clé.Nous avons examiné l’association entre activation des cellules B dans le compartiment systémique et le contrôle sur le réservoir de l’EBV. Deux situations cliniques d’activation chronique des cellules B ont été explorées ; le syndrome de Gougerot-Sjögren et la mastite subclinique dans le contexte de l’infection par le VIH.Dans ce travail de thèse, nous avons tout d’abord développé une PCR en temps réel pour la quantification de l'ADN de EBV ciblant la région répétée BamHI-W du génome. Le travail de validation de la technique a permis d’évaluer précisément le gain de sensibilité comparativement à une qPCR LMP2 (cible unique). L’impact des variations de répétition de la séquence BamHI-W suivant les souches et isolats EBV a également été analyse.Dans un deuxième travail, nous avons montré que, la mastite subclinique était fréquente au cours de l’allaitement et qu’elle était un facteur indépendant associé à une augmentation de l'excrétion EBV par le lait maternel. Cette sécrétion est associée localement à l’inflammation et à l’excrétion du VIH ce qui témoigne de phénomène de synergie entre les deux virus. Nous avons également démontré que l'ADN EBV dans le lait maternel peut être résistant à la DNase et que le virus était est probablement encapsidé dans le lait, donc potentiellement infectieux.Enfin, bénéficiant d’un accès aux prélèvements de la cohorte ASSESS nous avons recherché de possible anomalie du contrôle de l’infection EBV dans le compartiment sanguin au cours du syndrome de Gougerot-Sjögren primaire dans lequel les lésions glandulaires salivaires et lacrymales sont associées à la présence d’EBV. Nous avons démontré que le réservoir EBV et la réplication EBV dans le compartiment systémique sont bien contrôlées au cours du syndrome de Gougerot-Sjögren primaire. La réponse anticorps contre l’antigène précoce d’EBV (EA) n'était pas associée à une augmentation de l'ADN de EBV.Ce travail de thèse, souligne le lien entre l'activation des lymphocytes B, l'inflammation chronique et le contrôle sur le réservoir d’EBV. Dans la glande mammaire le contrôle de l’infection EBV est perturbé en cas de mastite subclinique. Au contraire dans le syndrome de Gougerot-Sjögren l’infection reste bien contrôlée dans le compartiment sanguin malgré l’activation des lymphocytes B et la présence renforcée du virus dans les lésions glandulaires. / TEpstein-Barr virus (EBV), an ubiquitous human gammaherpesvirus affects 95% of adult human population and establishes a lifelong latency in memory B cells periodically entering into lytic replication with further propagation in oropharyngeal epithelia and shedding through saliva. Latent EBV infection is associated with lymphomas, carcinomas and autoimmune diseases. Although the conditions favoring the development of these pathologies are not completely understood, the immunosuppression and B cell activations play an important role in EBV-associated diseases.We examined the control over the EBV reservoir in a diseases associated with B cell activation. Two clinical situations associated with altered B cell activation were explored: primary Sjogren’s syndrome and subclinical mastitis in HIV-infected mothers.Primarily, we developed an in-house real-time PCR for EBV DNA quantification targeting the repetitive BamHI-W region of EBV DNA. The validation analyses enabled to evaluate the gain in sensitivity of the BamHI-W test relative to single repeat LMP2 qPCR. The impact of the variations in BamHI-W reiteration on EBV DNA quantification was further assessed on different EBV strains and clinical samples.In a second study, we showed that subclinical mastitis was common during breastfeeding, and it was an independent factor associated with increased EBV breast milk shedding. This secretion was associated with local inflammation and HIV shedding, reflecting synergy between the two viruses. We have also demonstrated that breast milk EBV DNA may be resistant to DNase, and the virus was probably encapsidated in the breast milk and thus potentially infectious.Finally, with an access to ASSESS cohort we looked for possible abnormal control over EBV infection in the blood compartment in primary Sjögren's syndrome, where salivary and lacrimal gland lesions were shown to be associated with the local activation of EBV. We have demonstrated that in primary Sjogren's syndrome EBV reservoir and replication in the systemic compartment are well controlled. The antibody response against EBV early antigen (EA) was not associated with increased DNA EBV.This thesis points out the link between the activation of B cells, chronic inflammation and control over the reservoir of EBV. In the mammary gland disturbed control of EBV infection is linked with subclinical mastitis. In contrast, in primary Sjogren’s syndrome EBV infection remains well controlled in the blood compartment despite the activation of B cells and the increased presence of the virus in glandular lesions.