Die Bioinformatik ist eine interdisziplinäre Wissenschaft, welche Probleme aus allen Lebenswissenschaften mit Hilfe computergestützter Methoden bearbeitet. Ihr Ziel ist es, die Verarbeitung und Interpretation großer Datenmengen zu ermöglichen. Zudem unterstützt sie den Designprozess von Experimenten in der Synthetischen Biologie. Die synthetische Biologie beschäftigt sich mit der Generierung neuer Komponenten und deren Eigenschaften, welche durch die Behandlung und Manipulation lebender Organismen oder Teilen daraus entstehen. Ein besonders interessantes Themengebiet hierbei sind Zweikomponenten-Systeme (Two-Component System, TCS). TCS sind wichtige Signalkaskaden in Bakterien, welche in der Lage sind Informationen aus der Umgebung in eine Zelle zu übertragen und darauf zu reagieren. Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Beurteilung, Nutzung und Weiterentwicklung von bioinformatischen Methoden zur Untersuchung von Proteininteraktionen und biologischen Systemen. Der wissenschaftliche Beitrag der vorliegenden Arbeit kann in drei Aspekte unterteilt werden: - Untersuchung und Beurteilung von bioinformatischen Methoden und Weiterführung der Ergebnisse aus der vorhergehenden Diplomarbeit zum Thema Protein-Protein-Interaktionsvorhersagen. - Analyse genereller evolutionärer Modifikationsmöglichkeiten von TCS sowie deren Design und spezifische Unterschiede. - Abstraktion bzw. Transfer der gewonnenen Erkenntnisse auf technische und biologische Zusammenhänge. Mit dem Ziel das Design neuer Experimente in der synthetischen Biologie zu vereinfachen und die Vergleichbarkeit von technischen und biologischen Prozessen sowie zwischen Organismen zu ermöglichen. Das Ergebnis der durchgeführten Studie zeigte, dass Zweikomponenten-Systeme in ihrem Aufbau sehr konserviert sind. Nichtsdestotrotz konnten viele spezifische Eigenschaften und drei generelle Modifikationsmöglichkeiten entdeckt werden. Die Untersuchungen ermöglichten die Identifikation neuer Promotorstellen, erlaubten aber auch die Beschreibung der Beschaffenheit unterschiedlicher Signalbindestellen. Zudem konnten bisher fehlende Komponenten aus TCS entdeckt werden, ebenso wie neue divergierte TCS-Domänen im Organismus Mycoplasma. Eine Kombination aus technischen Ansätzen und synthetischer Biologie vereinfachte die gezielte Manipulation von TCS oder anderen modularen Systemen. Die Etablierung der vorgestellten zweistufigen Modul-Klassifikation ermöglichte eine effizientere Analyse modular aufgebauter Prozesse und erlaubte somit das molekulare Design synthetischer, biologischer Anwendungen. Zur einfachen Nutzung dieses Ansatzes wurde eine frei zugängliche Software GoSynthetic entwickelt. Konkrete Beispiele demonstrierten die praktische Anwendbarkeit dieser Analysesoftware. Die vorgestellte Klassifikation der synthetisch-biologischen und technischen Einheiten soll die Planung zukünftiger Designexperimente vereinfachen und neue Wege für sinnverwandte Bereiche aufzeigen. Es ist nicht die Hauptaufgabe der Bioinformatik, Experimente zu ersetzen, sondern resultierende große Datenmengen sinnvoll und effizient auszuwerten. Daraus sollen neue Ideen für weitere Analysen und alternative Anwendungen gewonnen werden, um fehlerhafte oder falsche Ansätze frühzeitig zu erkennen. Die Bioinformatik bietet moderne, technische Verfahren, um vertraute, aber oft mühsame experimentelle Wege durch neue, vielversprechende Ansätze zur Datenstrukturierung und Auswertung großer Datenmengen zu ergänzen. Neue Sichtweisen werden durch die Erleichterung des Testprozederes gefördert. Die resultierende Zeitersparnis führt zudem zu einer Kostenreduktion. / The field of Bioinformatics is an interdisciplinary science focusing on the application of computer science to solve problems in different areas of life sciences. Its scope is to handle and interpret an immense quantity of data and to support computer-aided design approaches of synthetic biological experiments. Synthetic biology deals with the generation of new components and biological characteristics created by manipulation of living organisms or parts of them. Of particular interest are two-component systems (TCS). TCS describe simple and important signalling cascades in bacteria which transfer information from the environment into the cell as a reaction to changes in the environment. The present thesis is focused on the assessment, applicability and enhancement of bioinformatical methods in order to facilitate analysis of protein interactions and biological systems. The scientific efforts within the thesis can be divided into three aspects: - Analysis and assessment of bioinformatical methods and enhancement of results from the preceding diploma thesis dealing with protein-protein interaction predictions. - Analysis of general evolutionary modification possibilities within TCS as well as specific differences and design for the identification of a common approach. - Abstraction and transfer of the results to technical and biological contexts in order to simplify synthetic biological design experiments. Establishment of comparable vocabulary for both, technical and biological processes as well as different organisms. The outcome of this thesis revealed that TCS structure is very conserved but that it nevertheless contained some very specific characteristics. New promotor sites were discovered whilst additionally allowing the analysis of the signal binding sites. Missing elements from known TCS could be discovered and a completely new diverged TCS domain in the organism Mycoplasma could be identified as well as three general modification possibilities for TCS. The combination between technological approaches and synthetic biology simplifies the systematic manipulation of TCS or other modular systems. The established two-staged module classification simplifies the analysis of modular processes and thereby the molecular design of synthetical-biological questions. Concrete examples showed the functionality and usefulness of the classification. A freely accessible software GoSynthetic provided easy access and application of the developed toolbox. Not only new concrete scientific findings were provided by the given thesis but also a general approach to identify and analyse TCS and even to create similar analytic procedures. The established classification of biological and technical modules will ease the design of future experiments and reveals new pportunities applicable to similar scientific areas. It is not the task of Bioinformatics to replace experiments but to analyse the resulting huge amounts of data meaningfully and efficiently. Hence, new ideas for further analysis and alternative cases need to be generated which may finally help to identify erroneous approaches earlier. Bioinformatics offers modern technical methods to amend familiar and sometimes exhausting experimental procedures with promising new approaches for data structuring and analysis of immense quantities of data. New perceptions are encouraged and speedier progress is possible without increasing the experimental coasts.

Chimeric antigen receptors (CARs) are able to specifically direct T cells to tumor antigens and therapy with anti-CD19 CARs has already cured cancer patients with B-cell lymphomas who have undergone long-term therapy non-successful. Despite this impressive result, the therapy is currently only approved as a last treatment option for blood cancers due to its life-threatening deficiencies. For patient safety and to enable additional application such as the treatment of solid tumors, CAR-T cells must be controllable, e. g. by chemically programmable CARs (cpCARs) regulated by hapten-like compounds. This thesis reports the synthesis and characterization of such hapten-like compounds. In the first step, seven different warheads with two different spacers were bound to biotin in order to find a suitable warhead for programming the cpCAR. In a second step, synthetic routes for the three pharmacophores folate, c(RGD), and an RGD peptidomimetic were developed. The routes allow the modification of the pharmacophores with one of the warheads from the first step. CuAAC was chosen as a bioorthogonal approach to link pharmacophores and warheads. In total, three different pharmacophores were modified with the 1,3-diketone motif of compound 21 leading to 112, 113 and 128. Activation of the T-cell signaling cascade was tested after binding of these hapten-like compounds to the cpCAR in the presence of suitable target structures. For 112, only a slight, non-significant, activation of the T-cell signaling cascade was observed, whereas for 113 and 128, a significant activation of the T-cell signaling cascade was observed. The poor solubility of the folate compounds led to alternative strategies. Folic acid was exchanged by pteroic acid and the bifunctional, linear compounds were enlarged to trifunctional dendrimers. Besides the reported regioisomer in 112, a second one, which was not reported to date, occurred by the cyclization of the linear RGD pentapeptide leading to 113. After the reported synthesis of an RGD peptidomimetic analogous to 128 could not be reproduced, a new synthetic route was developed. It also consists of 17 steps, but reduces the number of linear steps from 13 to 10. Moreover, the developed route contains an asymmetric hydrogenation step and is, compared to the published one, more flexible by the use of the copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). In addition, an unknown reaction was observed. Instead of the formation of a Schiff base in the reductive amination of 129, an insertion of propargylamine occurred forming 131. The reaction is almost quantitative and in high purity. After requiring no purification, it could be predestined for industrial purposes, such as the synthesis of N-functionalized 1,2-dihydroquinolines or as a building block with various orthogonal functional groups. Besides the sulfonamide 16, the diketone (21, 27, 31) and lactam compounds (39 – 41), experiments on adapter molecules with further warheads were performed. In the synthesis of a proadapter approach, in which the warhead is formed only after the retro-aldol reaction catalyzed by the mAb, 6 of 10 steps were successfully performed. A newly developed synthesis to keto-sulfonyl and keto-sulfoxide compounds could not be completed but was performed on a small scale to the point of keto-sulfonyl and keto-sulfoxide. Furthermore, a universal synthesis route was designed to allow the introduction of the warhead at the end of the synthesis by acylation. Thus, after 5 shared steps, 3 of them in quantitative yield, different warheads may be introduced. Moreover, this also facilitates the purification and the analysis of the compounds by the absence of tautomerism or labile groups. However, the acylation experiments were not successful with either the acid cyanide or the Weinreb amide. In summary, this thesis has proven that the 1,3-diketone motif is a suitable warhead for programming the cpCAR, which was developed by Hudecek et al. (unpublished data). The hapten-like compounds 112, 113 and 128 simultaneously bind to integrin ${\alpha}_v{\beta}_3$ and the cpCAR activating the T-cell signaling cascade. The modular synthesis strategy and the use of the bioorthogonal CuAAC allow straightforward access to these valuable immunotherapeutics but revealed the need for an additional purification step to remove copper ions. / Chimäre Antigen-Rezeptoren (CARs) ermöglichen es T-Zellen spezifisch auf Tumorantigene auszurichten. Die Therapie mit anti-CD19 CARs konnte bereits eindrucksvolle Ergebnisse liefern und austherapierte Krebspatienten mit B-Zell-Lymphomen heilen. Durch zum Teil lebensbedrohliche Nebenwirkungen ist sie aktuell jedoch nur als letzte Therapiemöglichkeit zugelassen. Um Patienten zu schützen und ihr Einsatzgebiet zu erweitern, beispielsweise zur Behandlung von soliden Tumoren, müssen CAR-T-Zellen kontrollierbar sein, z. B. durch chemisch programmierbare CARs (cpCARs), die durch hapten-artigen Verbindungen reguliert werden. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Synthese und Charakterisierung von solchen Verbindungen. Dafür wurden im ersten Schritt sieben verschiedene reaktive Gruppen mit zwei unterschiedlichen Spacern an Biotin gebunden, um eine geeignete reaktive Gruppe für die Programmierung des cpCARs zu finden. Im zweiten Schritt wurden Syntheserouten für die drei Pharmakophore Folat, c(RGD) und ein RGD-Peptidomimetikum entwickelt. Die Routen ermöglichen es das jeweilige Pharmakophor mit einer der reaktiven Gruppe aus dem ersten Schritt zu modifizieren. Zur Verbindung von Pharmakophor und reaktiver Gruppe, wurde die CuAAC als bioorthogonaler Ansatz gewählt. Insgesamt wurden im Rahmen dieser Arbeit drei verschiedene Pharmakophore mit dem 1,3-Diketon-Motiv von Verbindung 21 modifiziert. Mit den resultierenden Verbindungen 112, 113 und 128 wurde die Aktivierung der T-Zell-Signalkaskade bei Anwesenheit geeigneter Zielstrukturen untersucht. Bei 112 konnte nur eine leichte, nicht signifikante Aktivierung der T-Zell-Signalkaskade beobachtet werden, während bei 113 und 128 eine deutliche Aktivierung der T-Zell-Signalkaskade beobachtet wurde. Die schlechte Löslichkeit der Folatverbindungen führte zu Versuchen Folsäure gegen Pteroinsäure zu tauschen und die linearen Verbindungen zu trifunktionalen, dendrimeren Verbindungen mit weiteren Triethylenglycol-Ketten zu vergrößern. Neben dem publizierten Regioisomer in 112 trat bei der Zyklisierung des linearen RGD-Pentapeptides ein zweites Regioisomer auf, das zu 113 führte. Nachdem die veröffentlichte Syntheseroute eines RGD-Peptidomimetikums, das analog zu 128 ist, nicht reproduziert werden konnte, wurde eine neue Syntheseroute entwickelt. Sie besteht ebenfalls aus 17 Schritten, die Anzahl der linearen Schritte konnte jedoch von 13 auf 10 reduziert werden. Zusätzlich enthält die entwickelte Route einen asymmetrischen Hydrierungsschritt und ist durch den Einsatz der Kupfer-katalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) flexibler als die bereits publizierte Synthese. Während der Entwicklung der Syntheseroute wurde eine Reaktion beobachtet, die in der Literatur bisher nicht bekannt ist. Anstatt der Bildung eines Imins bei der reduktiven Aminierung von 129 kam es zu einer Insertion von Propargylamin, was zu 131 führte. Die Reaktion verläuft dabei nahezu quantitativ und in hoher Reinheit, so dass keine Aufreinigung notwendig ist. Sie könnte somit prädestiniert für industrielle Zwecke sein, wie zum Beispiel die Synthese von N-funktionalisieren 1,2-Dihydrochinolinen oder als Baustein mit mehreren funktionellen Gruppen, die orthogonal zu einander sind. Zusätzlich zum Sulfonamid 16, den Diketon- (21, 27, 31) und Lactamverbindungen (39 – 41), wurden Versuche zu Adaptermolekülen mit weiteren reaktiven Gruppen durchgeführt. Bei der Synthese eines Proadapter-Ansatzes, bei dem die reaktive Gruppe erst nach der vom mAb katalysierten Retroaldolreaktion entsteht, konnten 6 von 10 Schritten erfolgreich durchgeführt werden. Eine neu entwickelte Synthese von Keto-Sulfonyl- und Keto-Sulfoxid-Verbindungen konnte nicht abgeschlossen, aber im kleinen Maßstab bis zum Keto-Sulfonyl bzw. Keto-Sulfoxid durchgeführt werden. Des Weiteren wurde eine universelle Syntheseroute entworfen, um die Einführung der reaktiven Gruppe am Ende der Synthese durch Acylierung zu ermöglichen. So können nach den ersten 5 gemeinsamen Schritten, 3 davon in quantitativer Ausbeute, verschiedene reaktive Gruppen eingeführt werden. Darüber hinaus wird durch die Abwesenheit von Tautomerie oder labilen Gruppen sowohl die Aufreinigung als auch die Analytik der Verbindungen erleichtert. Die Acylierungsversuche waren jedoch weder mit dem Säurecyanid noch mit dem Weinreb-Amid erfolgreich. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit bewiesen werden, dass das 1,3-Diketon-Motiv eine geeignete reaktive Gruppe zur Programmierung des cpCARs ist, der von Hudecek et al. (bisher unveröffentlicht) entwickelt wurde. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die hapten-artigen Verbindungen gleichzeitig an Integrin ${\alpha}_v{\beta}_3$ und den cpCAR binden und die T-Zell-Signalkaskade aktivieren. Die modulare Synthesestrategie und der Einsatz der bioorthogonalen CuAAC für die Herstellung der Verbindungen ermöglichen einen unkomplizierten Zugang zu diesen wertvollen Immuntherapeutika, offenbarten jedoch die Notwendigkeit für einen zusätzlichen Reinigungsschritt zur Entfernung der Kupferionen.

Biological cell populations, such as in tissues or microbial communities, are constantly subject to different sources of noise and variability. Despite this, multicellular systems are still able to function properly because cells coordinate with each other by communication. Using biological model systems to study this multiscalar process can be challenging because of their innate complexity. In this thesis, we address this challenge by building a synthetic multicellular system using bottom-up in vitro assembly approaches. Using this platform, we aim to study the effect of cell-to-cell communication to population variability in a minimal and simplified context. To achieve this, we require a synthetic cell population with (i) quantifiable gene expression dynamics, (ii) customizable population variability, and (iii) intercellular communication. Having these characteristics will allow us to test different initial configurations of population variability and monitor population gene expression dynamics with and without cell-to-cell communication. To generate these synthetic cell populations, reconstituted cell-free expression systems (CFES) are encapsulated into monodisperse-sized liposomes using double-emulsion microfluidics. Both transcription and translation levels are simultaneously monitored and quantified to develop models of cell-free gene expression dynamics and differentiate between bulk and encapsulated formats. Population variability was then incorporated by combining different batches of cells to create distinct subpopulations or by using a two-inlet double-emulsion microfluidic device to generate single populations with a large dispersion of encapsulated DNA template. Lastly, genetic circuits based on the quorum sensing system of Vibrio fischeri are used to implement diffusion-mediated intercellular signalling. Quorum sensing gene circuits in Escherichia coli extract-based CFES were tested in bulk and phase transfer-generated synthetic cells. Together with these experimental systems, corresponding models of synthetic cell populations that can account for population variability and secrete-and-sensing communication are developed using mixed-effects models and moment dynamics. Overall, this work leverages CFES and microfluidic technologies to reproducibly generate a simplified in vitro model of multicellular systems that can be easily monitored spatiotemporally to study multi-scalar processes.:Preface Chapter 1 Bottom-up multicellular systems Chapter 2 Building blocks: cell-free expression and liposomes Chapter 3 Gene expression dynamics in synthetic cell populations Chapter 4 Variability and communication in synthetic cell populations Chapter 5 Modeling variability & communication in synthetic cell populations Summary and outlook Appendices Bibliography / Biologische Zellpopulationen, z.B. in Geweben oder mikrobiellen Gemeinschaften, sind ständig verschiedenen Quellen von Rauschen und Variabilität ausgesetzt. Trotzdem sind multizelluläre Systeme in der Lage, ordnungsgemäß zu funktionieren, weil sich die Zellen durch Kommunikation miteinander abstimmen. Die Verwendung biologischer Modellsysteme zur Untersuchung dieses multiskalaren Prozesses kann aufgrund ihrer angeborenen Komplexität eine Herausforderung darstellen. In dieser Arbeit gehen wir diese Herausforderung an, indem wir ein synthetisches multizelluläres System mit Hilfe von Bottom-up-in vitro-Assembly-Ansätzen aufbauen. Mit Hilfe dieser Plattform wollen wir die Auswirkungen der Kommunikation von Zelle zu Zelle auf die Populationsvariabilität in einem minimalen und vereinfachten Kontext untersuchen. Um dies zu erreichen, benötigen wir eine synthetische Zellpopulation mit (i) quantifizierbarer Genexpressionsdynamik, (ii) anpassbarer Populationsvariabilität und (iii) interzellulärer Kommunikation. Mit diesen Eigenschaften können wir verschiedene Ausgangskonfigurationen der Populationsvariabilität testen und die Genexpressionsdynamik der Population mit und ohne Zell-zu-Zell-Kommunikation beobachten. Um diese synthetischen Zellpopulationen zu erzeugen, werden rekonstituierte zellfreie Expressionssysteme (CFES) mit Hilfe der Doppelemulsions-Mikrofluidik in monodisperse Liposomen eingekapselt. Sowohl die Transkriptions- als auch die Translationsraten werden gleichzeitig überwacht und quantifiziert, um Modelle für die Dynamik der zellfreien Genexpression zu entwickeln und zwischen Bulk- und verkapselten Formaten zu unterscheiden. Die Variabilität der Populationen wurde dann durch die Kombination verschiedener Zellchargen zur Bildung unterschiedlicher Subpopulationen oder durch die Verwendung einer mikrofluidischen Doppelemulsionsvorrichtung mit zwei Einlässen zur Erzeugung einzelner Populationen mit einer großen Streuung der eingekapselten DNA-Vorlage einbezogen. Schließlich werden genetische Schaltkreise auf der Grundlage des Quorum-Sensing-Systems von Vibrio fischeri verwendet, um diffusionsvermittelte interzelluläre Signalübertragung zu implementieren. Quorum-Sensing-Genkreisläufe in CFES auf der Basis von Escherichia coli-Extrakten wurden in synthetischen Zellen getestet, die durch Bulk- und Phasentransfer erzeugt wurden. Zusammen mit diesen experimentellen Systemen wurden entsprechende Modelle synthetischer Zellpopulationen entwickelt, die die Populationsvariabilität und die Sekretions- und Sensing-Kommunikation mit Hilfe von Mixed-Effects-Modellen und Momentendynamik berücksichtigen können. Insgesamt nutzt diese Arbeit CFES- und Mikrofluidik-Technologien, um reproduzierbar ein vereinfachtes in vitro-Modell multizellulärer Systeme zu erzeugen, das leicht raum-zeitlich überwacht werden kann, um multiskalare Prozesse zu untersuchen.:Preface Chapter 1 Bottom-up multicellular systems Chapter 2 Building blocks: cell-free expression and liposomes Chapter 3 Gene expression dynamics in synthetic cell populations Chapter 4 Variability and communication in synthetic cell populations Chapter 5 Modeling variability & communication in synthetic cell populations Summary and outlook Appendices Bibliography

Das stäbchenförmige Bakterium Escherichia coli teilt sich in zwei gleich große Tochterzellen. Dies ist nur möglich, wenn sich die Zelle in der Mitte teilt. Bei E. coli wird die Zellteilung durch den Zusammenschluss der FtsZ-Proteine an der Membran zum Z-Ring eingeleitet. Topologische Regulierung des Z-Ringes erfolgt durch räumlich-zeitliche Oszillationen von Min-Proteinen zwischen den beiden Zellpolen. MinC, MinD und MinE binden an und lösen sich von der Membran unter Hydrolyse von ATP und in antagonistischer Art und Weise, was zu einer alternierenden Ansammlung von MinC und MinD an den Zellpolen führt. Gemittelt über die Zeit ergibt sich somit ein MinD-Verteilungsprofil, das maximale Konzentration an den Zellpolen und ein Minimum in der Zellmitte aufweist. MinC bindet an MinD und folgt somit seiner Verteilung. Der Zusammenschluss von FtsZ-Proteinen wird durch MinC unterbunden, und somit kann sich der Z-ring nur an einer Position herausbilden, die ein Minimum an MinC aufweist - der Zellmitte. Das Min-system wurde in der Vergangenheit auch mit einem in-vitro-Ansatz untersucht, indem Min-Proteine in künstliche, aufliegende Lipiddoppelschichten (supported lipid bilayers, SLB) rekonstitutiert wurden. Dabei bildeten die Min-Proteine kein oszillierendes Muster aus, sondern organisierten sich vielmehr in parallelen und propagierenden Wellen (Loose, 2008, Science, 320). In diesen in-vitro-Experimenten war das Membransubstrat wesentlich größer als die Wellenlänge der Min-Proteinwellen. In vivo hingegen ist die Länge der Zelle in der gleichen Größenordnung wie die charakteristische Länge des Oszillationsmusters der Min-Proteine. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, den Einfluß einer beschränkten Fläche und geometrischer Formgebung der künstlichen Lipiddoppelschichten auf die Wellenpropagation der Min-Protein zu untersuchen. Flächige Beschränkung künstlicher Membranen erfolgte durch Mikrostrukturtechnologie. Deckglässchen wurden mit einer Goldschicht und mikroskopischen Aussparungen unterschiedlicher geometrischer Formen strukturiert. Funktionale SLBs bildeten sich nur auf Glasflächen ohne Goldbeschichtung aus. Nach der Rekonstitution der Min-Proteine, organisierten sich diese auf den Membranstücken in parallele Wellen. Dabei bestimmte die flächige Beschränkung der künstlichen Membranen die Ausbreitungsrichtung der Min-Proteinwellen. Min-Proteinwellen konnten entlang gekrümmter Membranstreifen, in Ring- und sogar in Slalomstrukturen geleitet werden. In geraden, länglichen Strukturen richteten sich die Wellen entlang der längsten Achse aus. Kopplung von Proteinwellen auf räumlich getrennten Membranstücken in Abhängigkeit des Abstandes und des sogenannten Molecular Crowdings in der wässrigen Lösung konnte ebenfalls beobachtet werden. Diese Kopplung ist ein Indiz für inhomogene Proteinverteilungen in der Lösung oberhalb der Membran. Desweiteren konnten Min-Proteinwellen auch in diversen dreidimensionalen künstlichen Membranen rekonstitituiert werden. Im Wildtyp von E. coli ähneln die Min-Proteindynamiken der einer Oszillation mit einer charakteristischen Länge von 5 µm. Auf SLBs, bilden Min-Proteine Wellen mit einer Wellenlänge aus, die ca. zehnmal größer ist als in vivo. Dieser Unterschied zwischen der in-vivo- und der in-vitro-Welt wurde untersucht und diskutiert. In vitro konnte die Wellenlänge um 50 % durch Erhöhung des Molecular Crowding in der Lösung sowie um 33 % durch Temperaturerhöhung verkleinert werden. Das oszillierende Muster könnte dahingegen eine Folge der Kompartimentierung sein. Erste Versuche, das Min-System in geschlossene Membrankompartimente zu rekonstitutieren, wurden getestet. / Escherichia coli, a rod-like bacterium, divides by binary fission. Cell division into two daughter cells of equal size requires that fission takes place at a midcell position. In E. coli, cell division is initiated by assembly of the FtsZ-proteins at the inner membrane to the Z-ring. Topological regulation of the Z-ring is achieved by spatiotemporal pole-to-pole oscillations of Min-proteins. MinC, MinD and MinE bind to and detach from - under hydrolysis of ATP - the membrane in an antagonistic manner leading to an alternating accumulation of MinC and MinD at the cell poles. Averaged over time, the distribution profile of MinD exhibits maximal concentration at the cell poles and a minimum at the cell center. MinC binds to MinD and thus follows its distribution. FtsZ assembly is inhibited by MinC and therefore the Z-ring can only form at a cell position low in MinC - at the cell center. In the past, the Min-system was also investigated in an in vitro approach by reconstitution of Min-proteins into a supported lipid bilayer (SLB). Here, Min-proteins did not self-organize into an oscillatory pattern but into parallel and propagating waves (Loose, 2008, Science, 320). In this in vitro assay, the membrane substrate was infinitely large compared to the wavelength. However, in vivo, the cell length is on the same order of magnitude as the respective length scale of the oscillatory pattern of Min-proteins. Therefore, we wished to investigate the effect of lateral confinement and geometric structuring of artificial lipid bilayers on the Min-protein wave propagation. Lateral confinement of artificial membranes was achieved by microfabrication technology. Glass slides were patterned by a gold coating with microscopic windows of different geometries, and functional SLBs were only formed on uncoated areas. Upon reconstitution, Min-proteins organized into parallel waves on the geometric membrane patches. Confinement of the artificial membranes determined the direction of propagation of Min-protein waves. Min-protein waves could be guided along curved membrane stripes, in rings and even along slalom-geometries. In elongated membrane structures, the protein waves always propagate along the longest axis. Coupling of protein waves across spatially separated membrane patches was observed, dependent on gap size and level of molecular crowding of the aqueous media above the bilayer. This indicates the existence of an inhomogeneous and dynamic protein gradient in the solution above the membrane. Furthermore, reconstitution of Min-protein waves in various three-dimensional artificial membranes was achieved. In wild-type E. coli, Min-protein dynamics resemble that of an oscillation with a characteristic length scale of 5 µm. On supported lipid bilayers, Min-proteins self-organize into waves with a wavelength approximately 10-fold larger than in vivo. These discrepancies between the in vivo and in vitro world were investigated and discussed. In vitro, the wavelength could be decreased by a factor of 50 % by increase of the molecular crowding in solution and by 33 % through temperature increase. The oscillatory pattern is thought to be a consequence of compartmentalization and first attempts to encapsulate the Min-system in closed bilayer compartments are presented.

As an inspiration from nature, polymeric vesicles can be formed from amphiphilic block-copolymers. These vesicles are called polymersomes and have applications in drug delivery and as nanoreactors. Within this thesis, photo cross-linked and pH sensitive polymersomes were synthesized, characterized and applied on cells as well as bionanoreactors. The stability due to the crosslinking yielded polymersomes which show a distinct and reproducible swelling upon repeated pH changes. If the non cross-linked vesicles were exposed to a plasma-cleaned surface, they formed a tethered singly and multiple bilayers. Upon studying these membranes, they turned out to harden upon crosslinking and showed a completely non-fluid behaviour. Additionaly, the polymersome-cell interactions were studied and yielded a high influence of the crosslinking conditions on cellular toxicity. If crosslinked for a long time in a phosphate-free enviroment, the polymersomes proved to be least toxic. Finally, an enzyme was incorporated into the polymersomes to create bionanoreactors. Due to the pH sensitivity and swelling, the vesicles created yielded a pH controlled nanoreactor with enzymatic activity and a swollen, e.g. acidic, state only.

Formation of segments during vertebrate embryogenesis is regulated by a biological clock. Models and experimental data indicate that the core of this clock consists of a cell- autonomous single cell oscillator. This oscillator likely involves a genetic feedback loop of transcriptional repressors belonging to the hairy gene family. In zebrafish, three her genes, her1, hes6 and her7, have been identified as core oscillator components. The main purpose of this project was to study the molecular mechanism of the hairy gene negative feedback oscillator in single cells. To determine whether a single cell oscillator is part of the zebrafish segmentation clock, a cell dissociation protocol was established to track the expression of Her1 ex vivo. Upon dissociation, Her1 expression continued to oscillate for up to three cycles. The period of oscillations was significantly slower than that of the segmentation clock, but appears to speed up in the presence of serum. To test whether the hairy gene interactions are sufficient to generate oscillations in single cells, a protocol was established that uses synthetic biology principles to design, construct and characterize hairy gene networks in yeast. First a library of network parts, containing hairy genes, promoters and Her binding sites was generated and subsequently assembled into simple devices to test their functionality in yeast. The three core oscillator components, Her1, Hes6 and Her7, were characterized and optimized for expression in yeast. In the SWITCH-OFF assay, the Her1 protein, modified with a MigED yeast repressor domain, was found to function as a transcriptional repressor in yeast, while Hes6 with the same modification can not. The dissociation of segmentation clock cells provides the first direct evidence that single cell oscillators exist in zebrafish. In this system, oscillator dynamics can be studied without the interactions of higher level clock components. In parallel, establishing a yeast chassis for hairy gene networks provides a novel technique to directly test predicted oscillator mechanisms by constructing them ’bottom up’.

Formation of segments during vertebrate embryogenesis is regulated by a biological clock. Models and experimental data indicate that the core of this clock consists of a cell- autonomous single cell oscillator. This oscillator likely involves a genetic feedback loop of transcriptional repressors belonging to the hairy gene family. In zebrafish, three her genes, her1, hes6 and her7, have been identified as core oscillator components. The main purpose of this project was to study the molecular mechanism of the hairy gene negative feedback oscillator in single cells. To determine whether a single cell oscillator is part of the zebrafish segmentation clock, a cell dissociation protocol was established to track the expression of Her1 ex vivo. Upon dissociation, Her1 expression continued to oscillate for up to three cycles. The period of oscillations was significantly slower than that of the segmentation clock, but appears to speed up in the presence of serum. To test whether the hairy gene interactions are sufficient to generate oscillations in single cells, a protocol was established that uses synthetic biology principles to design, construct and characterize hairy gene networks in yeast. First a library of network parts, containing hairy genes, promoters and Her binding sites was generated and subsequently assembled into simple devices to test their functionality in yeast. The three core oscillator components, Her1, Hes6 and Her7, were characterized and optimized for expression in yeast. In the SWITCH-OFF assay, the Her1 protein, modified with a MigED yeast repressor domain, was found to function as a transcriptional repressor in yeast, while Hes6 with the same modification can not. The dissociation of segmentation clock cells provides the first direct evidence that single cell oscillators exist in zebrafish. In this system, oscillator dynamics can be studied without the interactions of higher level clock components. In parallel, establishing a yeast chassis for hairy gene networks provides a novel technique to directly test predicted oscillator mechanisms by constructing them ’bottom up’.

Das stäbchenförmige Bakterium Escherichia coli teilt sich in zwei gleich große Tochterzellen. Dies ist nur möglich, wenn sich die Zelle in der Mitte teilt. Bei E. coli wird die Zellteilung durch den Zusammenschluss der FtsZ-Proteine an der Membran zum Z-Ring eingeleitet. Topologische Regulierung des Z-Ringes erfolgt durch räumlich-zeitliche Oszillationen von Min-Proteinen zwischen den beiden Zellpolen. MinC, MinD und MinE binden an und lösen sich von der Membran unter Hydrolyse von ATP und in antagonistischer Art und Weise, was zu einer alternierenden Ansammlung von MinC und MinD an den Zellpolen führt. Gemittelt über die Zeit ergibt sich somit ein MinD-Verteilungsprofil, das maximale Konzentration an den Zellpolen und ein Minimum in der Zellmitte aufweist. MinC bindet an MinD und folgt somit seiner Verteilung. Der Zusammenschluss von FtsZ-Proteinen wird durch MinC unterbunden, und somit kann sich der Z-ring nur an einer Position herausbilden, die ein Minimum an MinC aufweist - der Zellmitte. Das Min-system wurde in der Vergangenheit auch mit einem in-vitro-Ansatz untersucht, indem Min-Proteine in künstliche, aufliegende Lipiddoppelschichten (supported lipid bilayers, SLB) rekonstitutiert wurden. Dabei bildeten die Min-Proteine kein oszillierendes Muster aus, sondern organisierten sich vielmehr in parallelen und propagierenden Wellen (Loose, 2008, Science, 320). In diesen in-vitro-Experimenten war das Membransubstrat wesentlich größer als die Wellenlänge der Min-Proteinwellen. In vivo hingegen ist die Länge der Zelle in der gleichen Größenordnung wie die charakteristische Länge des Oszillationsmusters der Min-Proteine. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, den Einfluß einer beschränkten Fläche und geometrischer Formgebung der künstlichen Lipiddoppelschichten auf die Wellenpropagation der Min-Protein zu untersuchen. Flächige Beschränkung künstlicher Membranen erfolgte durch Mikrostrukturtechnologie. Deckglässchen wurden mit einer Goldschicht und mikroskopischen Aussparungen unterschiedlicher geometrischer Formen strukturiert. Funktionale SLBs bildeten sich nur auf Glasflächen ohne Goldbeschichtung aus. Nach der Rekonstitution der Min-Proteine, organisierten sich diese auf den Membranstücken in parallele Wellen. Dabei bestimmte die flächige Beschränkung der künstlichen Membranen die Ausbreitungsrichtung der Min-Proteinwellen. Min-Proteinwellen konnten entlang gekrümmter Membranstreifen, in Ring- und sogar in Slalomstrukturen geleitet werden. In geraden, länglichen Strukturen richteten sich die Wellen entlang der längsten Achse aus. Kopplung von Proteinwellen auf räumlich getrennten Membranstücken in Abhängigkeit des Abstandes und des sogenannten Molecular Crowdings in der wässrigen Lösung konnte ebenfalls beobachtet werden. Diese Kopplung ist ein Indiz für inhomogene Proteinverteilungen in der Lösung oberhalb der Membran. Desweiteren konnten Min-Proteinwellen auch in diversen dreidimensionalen künstlichen Membranen rekonstitituiert werden. Im Wildtyp von E. coli ähneln die Min-Proteindynamiken der einer Oszillation mit einer charakteristischen Länge von 5 µm. Auf SLBs, bilden Min-Proteine Wellen mit einer Wellenlänge aus, die ca. zehnmal größer ist als in vivo. Dieser Unterschied zwischen der in-vivo- und der in-vitro-Welt wurde untersucht und diskutiert. In vitro konnte die Wellenlänge um 50 % durch Erhöhung des Molecular Crowding in der Lösung sowie um 33 % durch Temperaturerhöhung verkleinert werden. Das oszillierende Muster könnte dahingegen eine Folge der Kompartimentierung sein. Erste Versuche, das Min-System in geschlossene Membrankompartimente zu rekonstitutieren, wurden getestet. / Escherichia coli, a rod-like bacterium, divides by binary fission. Cell division into two daughter cells of equal size requires that fission takes place at a midcell position. In E. coli, cell division is initiated by assembly of the FtsZ-proteins at the inner membrane to the Z-ring. Topological regulation of the Z-ring is achieved by spatiotemporal pole-to-pole oscillations of Min-proteins. MinC, MinD and MinE bind to and detach from - under hydrolysis of ATP - the membrane in an antagonistic manner leading to an alternating accumulation of MinC and MinD at the cell poles. Averaged over time, the distribution profile of MinD exhibits maximal concentration at the cell poles and a minimum at the cell center. MinC binds to MinD and thus follows its distribution. FtsZ assembly is inhibited by MinC and therefore the Z-ring can only form at a cell position low in MinC - at the cell center. In the past, the Min-system was also investigated in an in vitro approach by reconstitution of Min-proteins into a supported lipid bilayer (SLB). Here, Min-proteins did not self-organize into an oscillatory pattern but into parallel and propagating waves (Loose, 2008, Science, 320). In this in vitro assay, the membrane substrate was infinitely large compared to the wavelength. However, in vivo, the cell length is on the same order of magnitude as the respective length scale of the oscillatory pattern of Min-proteins. Therefore, we wished to investigate the effect of lateral confinement and geometric structuring of artificial lipid bilayers on the Min-protein wave propagation. Lateral confinement of artificial membranes was achieved by microfabrication technology. Glass slides were patterned by a gold coating with microscopic windows of different geometries, and functional SLBs were only formed on uncoated areas. Upon reconstitution, Min-proteins organized into parallel waves on the geometric membrane patches. Confinement of the artificial membranes determined the direction of propagation of Min-protein waves. Min-protein waves could be guided along curved membrane stripes, in rings and even along slalom-geometries. In elongated membrane structures, the protein waves always propagate along the longest axis. Coupling of protein waves across spatially separated membrane patches was observed, dependent on gap size and level of molecular crowding of the aqueous media above the bilayer. This indicates the existence of an inhomogeneous and dynamic protein gradient in the solution above the membrane. Furthermore, reconstitution of Min-protein waves in various three-dimensional artificial membranes was achieved. In wild-type E. coli, Min-protein dynamics resemble that of an oscillation with a characteristic length scale of 5 µm. On supported lipid bilayers, Min-proteins self-organize into waves with a wavelength approximately 10-fold larger than in vivo. These discrepancies between the in vivo and in vitro world were investigated and discussed. In vitro, the wavelength could be decreased by a factor of 50 % by increase of the molecular crowding in solution and by 33 % through temperature increase. The oscillatory pattern is thought to be a consequence of compartmentalization and first attempts to encapsulate the Min-system in closed bilayer compartments are presented.

As an inspiration from nature, polymeric vesicles can be formed from amphiphilic block-copolymers. These vesicles are called polymersomes and have applications in drug delivery and as nanoreactors. Within this thesis, photo cross-linked and pH sensitive polymersomes were synthesized, characterized and applied on cells as well as bionanoreactors. The stability due to the crosslinking yielded polymersomes which show a distinct and reproducible swelling upon repeated pH changes. If the non cross-linked vesicles were exposed to a plasma-cleaned surface, they formed a tethered singly and multiple bilayers. Upon studying these membranes, they turned out to harden upon crosslinking and showed a completely non-fluid behaviour. Additionaly, the polymersome-cell interactions were studied and yielded a high influence of the crosslinking conditions on cellular toxicity. If crosslinked for a long time in a phosphate-free enviroment, the polymersomes proved to be least toxic. Finally, an enzyme was incorporated into the polymersomes to create bionanoreactors. Due to the pH sensitivity and swelling, the vesicles created yielded a pH controlled nanoreactor with enzymatic activity and a swollen, e.g. acidic, state only.

All cells maintain essential metal nutrients at optimal levels by metal homeostasis. P-type ATPases, a crucial superfamily of integral membrane proteins, are involved in the active transport of metal ions across biological membranes driven by the motive force of ATP- hydrolysis. The PIB-type ATPase subfamily, also called CPx-ATPases, fulfills a key role in heavy metal homoeostasis among the most widespread species from bacteria to human. In humans, the defect in copper transporters is the direct cause of severe neurological and hepatic disorders such as Wilson and Menkes diseases, therefore, understanding the molecular function of these pumps is of paramount importance in human health. Cu+-ATPases have two transmembrane metal binding sites (TM-MBS) and three cytosolic domains, namely the actuator (A-domain) and phosphorylation and nucleotide-binding domain (PN), and regulatory N-terminal heavy metal binding domain (HMBD). Here, we have studied the Legionella pneumophila CopA (LpCopA) and its isolated cytosolic domains to improve our understanding of the functional interaction of the protein domains during metal transport relate this to the known structure of this ATPase. To elucidate how cytosolic ligands (Cu+ and nucleotide) stimulate the interactions among the cytosolic domains and may transmit conformational changes to the TM-MBS, the interactions among recombinant isolated cytosolic domains were first examined biochemically by co-purification and spectroscopically by circular dichroism, time-resolved fluorescence and site-directed fluorescent labeling assays. The Cu+-dependent interaction between the A-domain and HMBD has been postulated as a mechanism for activating the ATPase cycle. This question was addressed here by studying copper-dependent interactions between the isolated expressed domains. Spectroscopic evidence is provided that an HMBD-A complex is formed in the presence of Cu+ which binds with 100-200 nM affinity to the recombinant HMBD. In contrast, the A-domain interacts with the PN domain in a nucleotide-dependent fashion. This molecular recognition is required for the dephosphorylation step in the catalytic cycle. The interaction was investigated in more detail by the use of a decameric peptide derived from the PN-binding interface of the A-domain and carrying the conserved TGE-motif involved in dephosphorylation. Its binding to the isolated PN domain in a weakly nucleotide-dependent manner, is demonstrated here by stopped-flow fluorescence spectroscopy. Several ATPase assays were modified to assess the functionality of the PN-domain and full length LpCopA. The peptide was found to reduce the catalytic turnover of full length LpCopA. This agrees with the expected slowing down of the reformation of the PN-A-domain interaction since the peptide occupies their binding interface. Thus, the synthetic peptide provides a means to study specifically the influence of PN-A-domain interactions on the structure and function of LpCopA. This was done by time-correlated single photon counting (TCSPC) method. The time-dependent Stokes shift of the environmentally sensitive fluorophore BADAN which was covalently attached to the conserved CPC-motif in the TM-MBS was measured. The data indicate that the interior of the ATPase is hydrated and the mobility of the intra-protein water varies from high to low at C382 at the “luminal side” and C384 at the “cytosolic side” of the TM-MBS, respectively. This finding is consistent with the recent MD simulation of LpCopA, bringing the first experimental evidence on a luminal-open conformation of E2~P state. The A-domain-derived decapeptide, although binding to the cytosolic head piece, induces structural changes also at the TM-MBS. The peptide-stabilized state (with a disrupted PN-A interface) renders the C384 environment more hydrophobic as evidenced by TCSPC. Taken together, the data from cytosolic domain interactions, ATPase assays and of time-dependent Stoke shift analyses of BADAN-labeled LpCopA reveal the presence of hydrated intramembraneous sites whose degree of hydration is regulated by the rearrangement of cytosolic domains, particularly during the association and dissociation of the PN-A domains. Copper affects this arrangement by inducing the linkage of the A-domain to the HMBD. The latter appears to play not only an autoinhibitory but also a chaperone-like role in transferring Cu+ to the TM-MBS during catalytic turnover.