A atrofia muscular espinal (AME) é uma das doenças de herança autossômica recessiva mais frequentes, com uma incidência estimada de 1 em cada 10.000 nascidos vivos. A AME se caracteriza por degeneração de neurônios motores na medula espinal, causando fraqueza progressiva de membros e tronco, seguida de atrofia muscular. Os pacientes são classificados em AME tipo I, AME tipo II e AME tipo III, baseado na idade de início dos sintomas e na evolução clínica. As três formas clínicas são causadas por alterações no gene de sobrevivência do neurônio motor (SMN1), que apresenta uma cópia homóloga (SMN2). Em torno de 95% dos pacientes com AME são homozigotos para ausência do exon 7 do gene SMN1, devido a uma deleção desse gene ou à uma conversão para SMN2. A ausência de SMN2 não tem consequências clínicas e é encontrada em aproximadamente 5% dos indivíduos normais, mas o número de cópias de SMN2 modula o fenótipo de pacientes com AME. Devido a este espectro uniforme de mutação, a análise molecular realizada mais frequentemente é a detecção de deleções e conversões dos éxons 7 e/ou 8 dos genes SMN1 e SMN2 nos pacientes com suspeita clínica de AME. Neste trabalho, um protocolo baseado no sistema TaqMan® foi desenvolvido e comparado com a metodologia de PCR-RFLP (restriction fragment length polymorfism) utilizada no laboratório, avaliando o potencial de aplicação no diagnóstico molecular de pacientes com AME. Amostras de DNA de 100 indivíduos com suspeita clínica de AME foram analisadas pelos dois métodos. Amostras suspeitas de apresentar conversão foram analisadas por sequenciamento direto de DNA. Homozigotos para a ausência do exon 7 do gene SMN1 foram identificados em 58 casos (58%), sendo a maioria devido à deleção desse gene. Destes pacientes, 56 foram classificados, de acordo com os critérios diagnósticos revisados para AME, e distribuídos da seguinte forma: 26 (46,4%) do tipo I, 16 (28,6%) tipo II e 14 (25,0%) tipo III. Oito casos de conversão do gene SMN1 para SMN2 foram encontradas entre os pacientes e a distribuição desses casos entre as três formas clínicas foi a seguinte: 4 pacientes do tipo III, 3 do tipo II e 1 do tipo I. Cinco casos de homozigotos para ausência do gene SMN2 foram identificados entre os demais indivíduos. A comparação do método PCR-RFLP com o método baseado no sistema TaqMan® descrito neste estudo mostrou que ambos foram específicos e precisos para essas análises. No entanto, o ensaio TaqMan® foi mais sensível e mais rápido e parece ser um método adequado para o diagnóstico de AME. / Spinal muscular atrophy (SMA) is one of the most frequent autosomal recessive disorder with an estimated incidence of 1 case in each 10,000 live-births. SMA is characterized by degeneration of motor neurons in the spinal cord, causing progressive weakness of the limbs and trunk, followed by muscle atrophy. Patients have been classified in type I–III SMA based on age at onset and clinical course. All three types of SMA are caused by alterations in the survival motor neuron gene (SMN1) that also have a homologous copy named SMN2. About 95% of SMA patients show homozygous absence of SMN1 exon 7 due a deletion of this gene or a conversion into SMN2. The absence of SMN2 is found in about 5% of individuals with no clinical phenotype, but number of SMN2 copies modulates the phenotype of SMA patients. Considering this uniform mutation spectrum, direct molecular genetic testing consists basically of detecting deletions and conversions of exons 7 and 8 of these genes in SMA patients. In this work, we develop a real time PCR TaqMan® method and compared with the most commonly used PCR restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) assay, evaluating the potential application of molecular diagnosis of SMA patients. DNA samples from 100 individuals with clinical features of SMA were analyzed by both methods. Besides, patients DNA samples carrying a conversion event were analysed by direct DNA sequencing. Homozygous for SMN1 exon 7 absence were identified in 58 cases (58%) being the majority due to gene deletion and eight cases of gene conversion. From those, 56 were classified, according to the revised diagnostic criteria, and distributed as follows: 26 (46.4%) SMA type I, 16 (28.6%) SMA type II and 14 (25.0%) SMA type III. In addition, gene conversion was observed in 4 SMA type I patients, 3 SMA type II and 1 SMA type III patient. Among the remaining individuals five samples were found to be homozygous for absence of SMN2 gene. Comparing PCR-RFLP method and the method based on the TaqMan® system describe in this study, we verify that both were precise and specific for these analyses. However, the TaqMan® assay was faster and more sensitive than PCR-RFLP and was shown to be a suitable method for the diagnosis of SMA.

A doença de Gaucher (DG) é uma doença lisossômica de depósito, de herança autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima glicocerebrosidase (GC). Essa deficiência é causada por mutações no gene (GBA) que codifica esta enzima. Até o momento, mais de 250 mutações já foram identificadas nesse gene. O objetivo deste estudo foi identificar mutações na região codificante do gene GBA de pacientes brasileiros com DG através de PCR longo, seguido de nested PCR e sequenciamento direto. As análises foram realizadas em 54 pacientes não-aparentados com DG, confirmados por apresentar baixa atividade enzimática e com pelo menos um alelo mutante não-identificado após a triagem para 4 mutações comuns (p.N370S, p.L444P, 84insG e IVS2+1G>A). O protocolo introduzido permitiu a identificação de 7 variações de sequência novas (p.S125N, p.F213L, p.P245T, p.W378C, p.D399H, 982-983insTGC e IVS10+1G>T) no gene GBA de pacientes com DG. Todas essas novas variações de sequência são provavelmente alterações responsáveis pela doença, pois alteram resíduos conservados da proteína, inserem um aminoácido ou prejudicam o splicing normal do RNA mensageiro. Consequentemente, estas mutações causam mudanças na estrutura e/ou na função da GC. Além dessas, 24 mutações raras que já foram descritas previamente, também, foram identificadas nesse trabalho, contribuindo na definição do genótipo dos pacientes. A identificação dos alelos mutantes é importante para o conhecimento do espectro de mutações no nosso país e para aumentar o conhecimento das bases moleculares da doença. Além disso, essas informações podem também contribuir para a melhor compreensão de correlações genótipo-fenótipo, assim como, para o aconselhamento genético e/ou para a oferta de análises moleculares individualizadas para famílias em risco. / Gaucher disease (GD) is an autosomal recessive lysosomal storage disorder caused by deficiency of the glucocerebrosidase (GC). This deficiency is caused by mutations in the gene (GBA) coding for this enzyme. To date, more than 250 mutations have been identified associated with GD. The aim of this study was to identify mutations in the coding region of the GBA gene in Brazilian patients with GD through long-range PCR, followed by nested PCR and direct sequencing. Analyses were carried out in 54 unrelated GD patients who presented low enzymatic activity and had at least one unidentified disease-associated allele after screening for 4 common mutations (p.N370S, p.L444P, 84insG, and IVS2+1G>A). Protocol described here allowed the identification of 7 novel sequence variations (p.S125N, p.F213L, p.P245T, p.W378C, p.D399H, 982-983insTGC, and IVS10+1G>T) in the GBA gene of patients with GD. As these new sequence variations change conserved protein residues, insert an amino acid or affect mRNA normal processing, they are likely to be disease causing mutations. Consequently, these mutations cause changes in the GC structure and/or function. Besides, 24 rare mutations that were previously described were also identified in this work leading to the definition of patients´ genotype. The identification of mutant alleles is crucial for improving the knowledge of GBA mutation spectrum in our country and to the better understanding of molecular basis of the disease. Furthermore, such information may also contribute to the establishment of genotype-phenotype correlations as well as for more specific genetic counseling and/or to offer a customized molecular analysis for families at risk.

Dispepsia funcional e hipolactasia primária do tipo adulto (HPTA) são duas condições altamente prevalentes na prática clínica. Ambas podem coexistir ou até mesmo serem confundidas devido à sobreposição de alguns dos seus sintomas, principalmente a sensação de distensão abdominal. No entanto, a literatura é escassa em relação a estudos que tenham avaliado a associação entre a dispepsia funcional e a HPTA. O presente trabalho tem o objetivo investigar a associação entre a HPTA e a dispepsia funcional, através da análise molecular da HPTA em pacientes dispépticos funcionais e controles assintomáticos. Pacientes dispépticos funcionais (conforme os critérios de Roma III) e voluntários assintomáticos foram convidados para participar do estudo. Indivíduos com genótipo CC do polimorfismo de nucleotídeo único -13910C/T eram considerados portadores de HPTA. Os sintomas dispépticos (dor em abdômen superior, náuseas, vômitos, sensação de distensão abdominal e saciedade precoce) foram avaliados através de um questionário validado (Porto Alegre Dyspeptic Symptoms Questionnaire). Foram incluídos 408 indivíduos no estudo (197 dispépticos funcionais e 211 controles). HPTA foi identificada em 88 (44,7%) dispépticos funcionais e 107 controles (50,7%) (P=0,468). No grupo dos dispépticos funcionais, os escores dos sintomas dispépticos foram comparados entre os pacientes classificados como portadores de HPTA e aqueles classificados como “não portadores de HPTA”. Foi observado maior escore da sensação de distensão abdominal em dispépticos funcionais com HPTA do que em dispépticos sem HPTA (P=0,014). Não foram observadas diferenças entre os grupos em relação aos escores dos demais sintomas. Em conclusão, a ausência de diferença na frequência de HPTA entre todos os dispépticos funcionais e o grupo de indivíduos assintomáticos indica que não há uma associação entre a HPTA e a dispepsia funcional como um todo. No entanto, o maior escore da sensação de distensão abdominal entre os dispépticos funcionais com HPTA sugere um papel da HPTA em uma parcela dos pacientes com dispepsia funcional. / Functional dyspepsia and Adult Type Hypolactasia (ATH) are frequent conditions that may coexist or even be confounded. There may be some overlap between their symptoms, especially abdominal bloating. Studies on this association are scarce. The aim of the study is to investigate the association between functional dyspepsia and ATH, through molecular analysis of ATH in functional dyspeptics and asymptomatic individuals. Patients with functional dyspepsia according to Rome III criteria and volunteers for blood donation were invited to participate in the study. A CC genotype por -13910C/T SNP was diagnostic of ATH. Five symptoms of functional dyspepsia (upper abdominal pain, nausea, vomiting, abdominal bloating and early satiety) were evaluated using a validated questionnaire (Porto Alegre Dyspeptic Symptoms Questionnaire). A total of 408 subjects were included in the study (197 functional dyspeptics and 211 controls). Eighty-eight dyspeptic patients (44.7%) had ATH, compared to 107 individuals (50.7%) in the control group (P=0.468). In the group of dyspeptic patients, mean scores of symptoms were compared between those classified as ATH and non-ATH. Dyspeptic patients with ATH had higher scores for abdominal bloating, compared to non-ATH patients (P=0.014). The scores of the other dyspeptic symptoms were not statistically different between those two groups. In conclusion, the similar frequency of ATH in patients with functional dyspepsia and asymptomatic individuals indicate an absence of association between functional dyspepsia and ATH. However, our data of higher bloating scores among functional dyspeptics with ATH suggest a possible role of ATH in a subset of patients with functional dyspepsia.

A atrofia muscular espinal (AME) é uma das doenças de herança autossômica recessiva mais frequentes, com uma incidência estimada de 1 em cada 10.000 nascidos vivos. A AME se caracteriza por degeneração de neurônios motores na medula espinal, causando fraqueza progressiva de membros e tronco, seguida de atrofia muscular. Os pacientes são classificados em AME tipo I, AME tipo II e AME tipo III, baseado na idade de início dos sintomas e na evolução clínica. As três formas clínicas são causadas por alterações no gene de sobrevivência do neurônio motor (SMN1), que apresenta uma cópia homóloga (SMN2). Em torno de 95% dos pacientes com AME são homozigotos para ausência do exon 7 do gene SMN1, devido a uma deleção desse gene ou à uma conversão para SMN2. A ausência de SMN2 não tem consequências clínicas e é encontrada em aproximadamente 5% dos indivíduos normais, mas o número de cópias de SMN2 modula o fenótipo de pacientes com AME. Devido a este espectro uniforme de mutação, a análise molecular realizada mais frequentemente é a detecção de deleções e conversões dos éxons 7 e/ou 8 dos genes SMN1 e SMN2 nos pacientes com suspeita clínica de AME. Neste trabalho, um protocolo baseado no sistema TaqMan® foi desenvolvido e comparado com a metodologia de PCR-RFLP (restriction fragment length polymorfism) utilizada no laboratório, avaliando o potencial de aplicação no diagnóstico molecular de pacientes com AME. Amostras de DNA de 100 indivíduos com suspeita clínica de AME foram analisadas pelos dois métodos. Amostras suspeitas de apresentar conversão foram analisadas por sequenciamento direto de DNA. Homozigotos para a ausência do exon 7 do gene SMN1 foram identificados em 58 casos (58%), sendo a maioria devido à deleção desse gene. Destes pacientes, 56 foram classificados, de acordo com os critérios diagnósticos revisados para AME, e distribuídos da seguinte forma: 26 (46,4%) do tipo I, 16 (28,6%) tipo II e 14 (25,0%) tipo III. Oito casos de conversão do gene SMN1 para SMN2 foram encontradas entre os pacientes e a distribuição desses casos entre as três formas clínicas foi a seguinte: 4 pacientes do tipo III, 3 do tipo II e 1 do tipo I. Cinco casos de homozigotos para ausência do gene SMN2 foram identificados entre os demais indivíduos. A comparação do método PCR-RFLP com o método baseado no sistema TaqMan® descrito neste estudo mostrou que ambos foram específicos e precisos para essas análises. No entanto, o ensaio TaqMan® foi mais sensível e mais rápido e parece ser um método adequado para o diagnóstico de AME. / Spinal muscular atrophy (SMA) is one of the most frequent autosomal recessive disorder with an estimated incidence of 1 case in each 10,000 live-births. SMA is characterized by degeneration of motor neurons in the spinal cord, causing progressive weakness of the limbs and trunk, followed by muscle atrophy. Patients have been classified in type I–III SMA based on age at onset and clinical course. All three types of SMA are caused by alterations in the survival motor neuron gene (SMN1) that also have a homologous copy named SMN2. About 95% of SMA patients show homozygous absence of SMN1 exon 7 due a deletion of this gene or a conversion into SMN2. The absence of SMN2 is found in about 5% of individuals with no clinical phenotype, but number of SMN2 copies modulates the phenotype of SMA patients. Considering this uniform mutation spectrum, direct molecular genetic testing consists basically of detecting deletions and conversions of exons 7 and 8 of these genes in SMA patients. In this work, we develop a real time PCR TaqMan® method and compared with the most commonly used PCR restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) assay, evaluating the potential application of molecular diagnosis of SMA patients. DNA samples from 100 individuals with clinical features of SMA were analyzed by both methods. Besides, patients DNA samples carrying a conversion event were analysed by direct DNA sequencing. Homozygous for SMN1 exon 7 absence were identified in 58 cases (58%) being the majority due to gene deletion and eight cases of gene conversion. From those, 56 were classified, according to the revised diagnostic criteria, and distributed as follows: 26 (46.4%) SMA type I, 16 (28.6%) SMA type II and 14 (25.0%) SMA type III. In addition, gene conversion was observed in 4 SMA type I patients, 3 SMA type II and 1 SMA type III patient. Among the remaining individuals five samples were found to be homozygous for absence of SMN2 gene. Comparing PCR-RFLP method and the method based on the TaqMan® system describe in this study, we verify that both were precise and specific for these analyses. However, the TaqMan® assay was faster and more sensitive than PCR-RFLP and was shown to be a suitable method for the diagnosis of SMA.

A doença de Gaucher (DG) é uma doença lisossômica de depósito, de herança autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima glicocerebrosidase (GC). Essa deficiência é causada por mutações no gene (GBA) que codifica esta enzima. Até o momento, mais de 250 mutações já foram identificadas nesse gene. O objetivo deste estudo foi identificar mutações na região codificante do gene GBA de pacientes brasileiros com DG através de PCR longo, seguido de nested PCR e sequenciamento direto. As análises foram realizadas em 54 pacientes não-aparentados com DG, confirmados por apresentar baixa atividade enzimática e com pelo menos um alelo mutante não-identificado após a triagem para 4 mutações comuns (p.N370S, p.L444P, 84insG e IVS2+1G>A). O protocolo introduzido permitiu a identificação de 7 variações de sequência novas (p.S125N, p.F213L, p.P245T, p.W378C, p.D399H, 982-983insTGC e IVS10+1G>T) no gene GBA de pacientes com DG. Todas essas novas variações de sequência são provavelmente alterações responsáveis pela doença, pois alteram resíduos conservados da proteína, inserem um aminoácido ou prejudicam o splicing normal do RNA mensageiro. Consequentemente, estas mutações causam mudanças na estrutura e/ou na função da GC. Além dessas, 24 mutações raras que já foram descritas previamente, também, foram identificadas nesse trabalho, contribuindo na definição do genótipo dos pacientes. A identificação dos alelos mutantes é importante para o conhecimento do espectro de mutações no nosso país e para aumentar o conhecimento das bases moleculares da doença. Além disso, essas informações podem também contribuir para a melhor compreensão de correlações genótipo-fenótipo, assim como, para o aconselhamento genético e/ou para a oferta de análises moleculares individualizadas para famílias em risco. / Gaucher disease (GD) is an autosomal recessive lysosomal storage disorder caused by deficiency of the glucocerebrosidase (GC). This deficiency is caused by mutations in the gene (GBA) coding for this enzyme. To date, more than 250 mutations have been identified associated with GD. The aim of this study was to identify mutations in the coding region of the GBA gene in Brazilian patients with GD through long-range PCR, followed by nested PCR and direct sequencing. Analyses were carried out in 54 unrelated GD patients who presented low enzymatic activity and had at least one unidentified disease-associated allele after screening for 4 common mutations (p.N370S, p.L444P, 84insG, and IVS2+1G>A). Protocol described here allowed the identification of 7 novel sequence variations (p.S125N, p.F213L, p.P245T, p.W378C, p.D399H, 982-983insTGC, and IVS10+1G>T) in the GBA gene of patients with GD. As these new sequence variations change conserved protein residues, insert an amino acid or affect mRNA normal processing, they are likely to be disease causing mutations. Consequently, these mutations cause changes in the GC structure and/or function. Besides, 24 rare mutations that were previously described were also identified in this work leading to the definition of patients´ genotype. The identification of mutant alleles is crucial for improving the knowledge of GBA mutation spectrum in our country and to the better understanding of molecular basis of the disease. Furthermore, such information may also contribute to the establishment of genotype-phenotype correlations as well as for more specific genetic counseling and/or to offer a customized molecular analysis for families at risk.

Sabe-se que o refluxo crônico pode induzir lesão mucosa, estimular a proliferação de células e promover tumorigênese no esôfago distal. Ainda não é sabido por que apenas uma parcela dos pacientes com refluxo esofágico progrediram para uma metaplasia intestinal (Esôfago de Barrett) e adenocarcinoma. O estresse oxidativo parece exercer um papel importante nessa progressão . Assim sendo, examinamos o padrão de expressão da enzima Heme Oxigenase-1 (HO-1), enzima indutora do estresse oxidativo, em peças de esôfago obtidos de um estudo experimental com ratos que avaliou o papel do refluxo gástrico e duodenoesofágico na carcinogênese esofágica. Métodos: Uma amostra de três (3) peças de esôfago de cada grupo de ratos submetidos a tratamentos diferentes tiveram a expressão da enzima Heme Oxigenase-1 avaliada através de imunohistoquímica. Os ratos foram divididos nos seguintes grupos: (1) cardioplastia para induzir refluxo predominantemente gástrico, (2) anastomose esofagoduodenal para induzir refluxo duodenal, (3) sem tratamento, (4) cardioplastia+dietilnitrosamina (DEN), (5) anastomose esofagoduodenal +DEN, (6) DEN. Resultados: Não houve desenvolvimento de câncer ou metaplasia intestinal nos animais que não foram expostos ao refluxo de conteúdo duodenal. A expressão de HO-1 foi observada apenas em ratos submetidos à anastomose esofagoduodenal (Grupos 2 e 5) e a análise da média de intensidade de fluorescência demonstrou uma diferença significante de expressão de HO-1 (4,8 e 4,6 vezes respectivamente) comparando-se ao controle (Grupo 3) (p<0,05). O alvo principal para expressão da HO-1 foram as células inflamatórias dentro do tumor ou em áreas subepiteleiais. Os ratos expostos ao refluxo gástrico não desenvolveram tumores ou expressaram a HO-1. Conclusões: A esofagite de refluxo induzida por refluxo esofágico com conteúdo duodenal provocou estresse oxidativo considerável e pode desempenhar um papel importante na carcinogênese esofágica. O refluxo gástrico não foi suficiente para induzir estresse oxidativo neste modelo experimental.

Dispepsia funcional e hipolactasia primária do tipo adulto (HPTA) são duas condições altamente prevalentes na prática clínica. Ambas podem coexistir ou até mesmo serem confundidas devido à sobreposição de alguns dos seus sintomas, principalmente a sensação de distensão abdominal. No entanto, a literatura é escassa em relação a estudos que tenham avaliado a associação entre a dispepsia funcional e a HPTA. O presente trabalho tem o objetivo investigar a associação entre a HPTA e a dispepsia funcional, através da análise molecular da HPTA em pacientes dispépticos funcionais e controles assintomáticos. Pacientes dispépticos funcionais (conforme os critérios de Roma III) e voluntários assintomáticos foram convidados para participar do estudo. Indivíduos com genótipo CC do polimorfismo de nucleotídeo único -13910C/T eram considerados portadores de HPTA. Os sintomas dispépticos (dor em abdômen superior, náuseas, vômitos, sensação de distensão abdominal e saciedade precoce) foram avaliados através de um questionário validado (Porto Alegre Dyspeptic Symptoms Questionnaire). Foram incluídos 408 indivíduos no estudo (197 dispépticos funcionais e 211 controles). HPTA foi identificada em 88 (44,7%) dispépticos funcionais e 107 controles (50,7%) (P=0,468). No grupo dos dispépticos funcionais, os escores dos sintomas dispépticos foram comparados entre os pacientes classificados como portadores de HPTA e aqueles classificados como “não portadores de HPTA”. Foi observado maior escore da sensação de distensão abdominal em dispépticos funcionais com HPTA do que em dispépticos sem HPTA (P=0,014). Não foram observadas diferenças entre os grupos em relação aos escores dos demais sintomas. Em conclusão, a ausência de diferença na frequência de HPTA entre todos os dispépticos funcionais e o grupo de indivíduos assintomáticos indica que não há uma associação entre a HPTA e a dispepsia funcional como um todo. No entanto, o maior escore da sensação de distensão abdominal entre os dispépticos funcionais com HPTA sugere um papel da HPTA em uma parcela dos pacientes com dispepsia funcional. / Functional dyspepsia and Adult Type Hypolactasia (ATH) are frequent conditions that may coexist or even be confounded. There may be some overlap between their symptoms, especially abdominal bloating. Studies on this association are scarce. The aim of the study is to investigate the association between functional dyspepsia and ATH, through molecular analysis of ATH in functional dyspeptics and asymptomatic individuals. Patients with functional dyspepsia according to Rome III criteria and volunteers for blood donation were invited to participate in the study. A CC genotype por -13910C/T SNP was diagnostic of ATH. Five symptoms of functional dyspepsia (upper abdominal pain, nausea, vomiting, abdominal bloating and early satiety) were evaluated using a validated questionnaire (Porto Alegre Dyspeptic Symptoms Questionnaire). A total of 408 subjects were included in the study (197 functional dyspeptics and 211 controls). Eighty-eight dyspeptic patients (44.7%) had ATH, compared to 107 individuals (50.7%) in the control group (P=0.468). In the group of dyspeptic patients, mean scores of symptoms were compared between those classified as ATH and non-ATH. Dyspeptic patients with ATH had higher scores for abdominal bloating, compared to non-ATH patients (P=0.014). The scores of the other dyspeptic symptoms were not statistically different between those two groups. In conclusion, the similar frequency of ATH in patients with functional dyspepsia and asymptomatic individuals indicate an absence of association between functional dyspepsia and ATH. However, our data of higher bloating scores among functional dyspeptics with ATH suggest a possible role of ATH in a subset of patients with functional dyspepsia.

A atrofia muscular espinal (AME) é uma das doenças de herança autossômica recessiva mais frequentes, com uma incidência estimada de 1 em cada 10.000 nascidos vivos. A AME se caracteriza por degeneração de neurônios motores na medula espinal, causando fraqueza progressiva de membros e tronco, seguida de atrofia muscular. Os pacientes são classificados em AME tipo I, AME tipo II e AME tipo III, baseado na idade de início dos sintomas e na evolução clínica. As três formas clínicas são causadas por alterações no gene de sobrevivência do neurônio motor (SMN1), que apresenta uma cópia homóloga (SMN2). Em torno de 95% dos pacientes com AME são homozigotos para ausência do exon 7 do gene SMN1, devido a uma deleção desse gene ou à uma conversão para SMN2. A ausência de SMN2 não tem consequências clínicas e é encontrada em aproximadamente 5% dos indivíduos normais, mas o número de cópias de SMN2 modula o fenótipo de pacientes com AME. Devido a este espectro uniforme de mutação, a análise molecular realizada mais frequentemente é a detecção de deleções e conversões dos éxons 7 e/ou 8 dos genes SMN1 e SMN2 nos pacientes com suspeita clínica de AME. Neste trabalho, um protocolo baseado no sistema TaqMan® foi desenvolvido e comparado com a metodologia de PCR-RFLP (restriction fragment length polymorfism) utilizada no laboratório, avaliando o potencial de aplicação no diagnóstico molecular de pacientes com AME. Amostras de DNA de 100 indivíduos com suspeita clínica de AME foram analisadas pelos dois métodos. Amostras suspeitas de apresentar conversão foram analisadas por sequenciamento direto de DNA. Homozigotos para a ausência do exon 7 do gene SMN1 foram identificados em 58 casos (58%), sendo a maioria devido à deleção desse gene. Destes pacientes, 56 foram classificados, de acordo com os critérios diagnósticos revisados para AME, e distribuídos da seguinte forma: 26 (46,4%) do tipo I, 16 (28,6%) tipo II e 14 (25,0%) tipo III. Oito casos de conversão do gene SMN1 para SMN2 foram encontradas entre os pacientes e a distribuição desses casos entre as três formas clínicas foi a seguinte: 4 pacientes do tipo III, 3 do tipo II e 1 do tipo I. Cinco casos de homozigotos para ausência do gene SMN2 foram identificados entre os demais indivíduos. A comparação do método PCR-RFLP com o método baseado no sistema TaqMan® descrito neste estudo mostrou que ambos foram específicos e precisos para essas análises. No entanto, o ensaio TaqMan® foi mais sensível e mais rápido e parece ser um método adequado para o diagnóstico de AME. / Spinal muscular atrophy (SMA) is one of the most frequent autosomal recessive disorder with an estimated incidence of 1 case in each 10,000 live-births. SMA is characterized by degeneration of motor neurons in the spinal cord, causing progressive weakness of the limbs and trunk, followed by muscle atrophy. Patients have been classified in type I–III SMA based on age at onset and clinical course. All three types of SMA are caused by alterations in the survival motor neuron gene (SMN1) that also have a homologous copy named SMN2. About 95% of SMA patients show homozygous absence of SMN1 exon 7 due a deletion of this gene or a conversion into SMN2. The absence of SMN2 is found in about 5% of individuals with no clinical phenotype, but number of SMN2 copies modulates the phenotype of SMA patients. Considering this uniform mutation spectrum, direct molecular genetic testing consists basically of detecting deletions and conversions of exons 7 and 8 of these genes in SMA patients. In this work, we develop a real time PCR TaqMan® method and compared with the most commonly used PCR restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) assay, evaluating the potential application of molecular diagnosis of SMA patients. DNA samples from 100 individuals with clinical features of SMA were analyzed by both methods. Besides, patients DNA samples carrying a conversion event were analysed by direct DNA sequencing. Homozygous for SMN1 exon 7 absence were identified in 58 cases (58%) being the majority due to gene deletion and eight cases of gene conversion. From those, 56 were classified, according to the revised diagnostic criteria, and distributed as follows: 26 (46.4%) SMA type I, 16 (28.6%) SMA type II and 14 (25.0%) SMA type III. In addition, gene conversion was observed in 4 SMA type I patients, 3 SMA type II and 1 SMA type III patient. Among the remaining individuals five samples were found to be homozygous for absence of SMN2 gene. Comparing PCR-RFLP method and the method based on the TaqMan® system describe in this study, we verify that both were precise and specific for these analyses. However, the TaqMan® assay was faster and more sensitive than PCR-RFLP and was shown to be a suitable method for the diagnosis of SMA.

A doença de Gaucher (DG) é uma doença lisossômica de depósito, de herança autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima glicocerebrosidase (GC). Essa deficiência é causada por mutações no gene (GBA) que codifica esta enzima. Até o momento, mais de 250 mutações já foram identificadas nesse gene. O objetivo deste estudo foi identificar mutações na região codificante do gene GBA de pacientes brasileiros com DG através de PCR longo, seguido de nested PCR e sequenciamento direto. As análises foram realizadas em 54 pacientes não-aparentados com DG, confirmados por apresentar baixa atividade enzimática e com pelo menos um alelo mutante não-identificado após a triagem para 4 mutações comuns (p.N370S, p.L444P, 84insG e IVS2+1G>A). O protocolo introduzido permitiu a identificação de 7 variações de sequência novas (p.S125N, p.F213L, p.P245T, p.W378C, p.D399H, 982-983insTGC e IVS10+1G>T) no gene GBA de pacientes com DG. Todas essas novas variações de sequência são provavelmente alterações responsáveis pela doença, pois alteram resíduos conservados da proteína, inserem um aminoácido ou prejudicam o splicing normal do RNA mensageiro. Consequentemente, estas mutações causam mudanças na estrutura e/ou na função da GC. Além dessas, 24 mutações raras que já foram descritas previamente, também, foram identificadas nesse trabalho, contribuindo na definição do genótipo dos pacientes. A identificação dos alelos mutantes é importante para o conhecimento do espectro de mutações no nosso país e para aumentar o conhecimento das bases moleculares da doença. Além disso, essas informações podem também contribuir para a melhor compreensão de correlações genótipo-fenótipo, assim como, para o aconselhamento genético e/ou para a oferta de análises moleculares individualizadas para famílias em risco. / Gaucher disease (GD) is an autosomal recessive lysosomal storage disorder caused by deficiency of the glucocerebrosidase (GC). This deficiency is caused by mutations in the gene (GBA) coding for this enzyme. To date, more than 250 mutations have been identified associated with GD. The aim of this study was to identify mutations in the coding region of the GBA gene in Brazilian patients with GD through long-range PCR, followed by nested PCR and direct sequencing. Analyses were carried out in 54 unrelated GD patients who presented low enzymatic activity and had at least one unidentified disease-associated allele after screening for 4 common mutations (p.N370S, p.L444P, 84insG, and IVS2+1G>A). Protocol described here allowed the identification of 7 novel sequence variations (p.S125N, p.F213L, p.P245T, p.W378C, p.D399H, 982-983insTGC, and IVS10+1G>T) in the GBA gene of patients with GD. As these new sequence variations change conserved protein residues, insert an amino acid or affect mRNA normal processing, they are likely to be disease causing mutations. Consequently, these mutations cause changes in the GC structure and/or function. Besides, 24 rare mutations that were previously described were also identified in this work leading to the definition of patients´ genotype. The identification of mutant alleles is crucial for improving the knowledge of GBA mutation spectrum in our country and to the better understanding of molecular basis of the disease. Furthermore, such information may also contribute to the establishment of genotype-phenotype correlations as well as for more specific genetic counseling and/or to offer a customized molecular analysis for families at risk.

Sabe-se que o refluxo crônico pode induzir lesão mucosa, estimular a proliferação de células e promover tumorigênese no esôfago distal. Ainda não é sabido por que apenas uma parcela dos pacientes com refluxo esofágico progrediram para uma metaplasia intestinal (Esôfago de Barrett) e adenocarcinoma. O estresse oxidativo parece exercer um papel importante nessa progressão . Assim sendo, examinamos o padrão de expressão da enzima Heme Oxigenase-1 (HO-1), enzima indutora do estresse oxidativo, em peças de esôfago obtidos de um estudo experimental com ratos que avaliou o papel do refluxo gástrico e duodenoesofágico na carcinogênese esofágica. Métodos: Uma amostra de três (3) peças de esôfago de cada grupo de ratos submetidos a tratamentos diferentes tiveram a expressão da enzima Heme Oxigenase-1 avaliada através de imunohistoquímica. Os ratos foram divididos nos seguintes grupos: (1) cardioplastia para induzir refluxo predominantemente gástrico, (2) anastomose esofagoduodenal para induzir refluxo duodenal, (3) sem tratamento, (4) cardioplastia+dietilnitrosamina (DEN), (5) anastomose esofagoduodenal +DEN, (6) DEN. Resultados: Não houve desenvolvimento de câncer ou metaplasia intestinal nos animais que não foram expostos ao refluxo de conteúdo duodenal. A expressão de HO-1 foi observada apenas em ratos submetidos à anastomose esofagoduodenal (Grupos 2 e 5) e a análise da média de intensidade de fluorescência demonstrou uma diferença significante de expressão de HO-1 (4,8 e 4,6 vezes respectivamente) comparando-se ao controle (Grupo 3) (p<0,05). O alvo principal para expressão da HO-1 foram as células inflamatórias dentro do tumor ou em áreas subepiteleiais. Os ratos expostos ao refluxo gástrico não desenvolveram tumores ou expressaram a HO-1. Conclusões: A esofagite de refluxo induzida por refluxo esofágico com conteúdo duodenal provocou estresse oxidativo considerável e pode desempenhar um papel importante na carcinogênese esofágica. O refluxo gástrico não foi suficiente para induzir estresse oxidativo neste modelo experimental.