La détection infrarouge, autrefois réservée aux applications militaires et spatiales, connait depuis une dizaine d’années une mutation importante et s’ouvre de plus en plus vers des marchés "grand public". Cette démocratisation est principalement liée aux développements rapides que connaissent les technologies utilisant des bolomètres "non refroidis", qui profitent de leurs compatibilités avec les filières de la microélectronique.La technologie utilisée au CEA/LETI repose sur l’utilisation d’un matériau thermomètre à base de silicium amorphe (également noté "a-Si"). Ce dernier comporte de nombreux avantages dont, principalement, son excellente compatibilité avec les outils "classiques" de la microélectronique. Cependant, l’intégration d’un matériau thermomètre plus performant que le a-Si est nécessaire pour répondre aux défis à venir.Conscient de l’importance de cette problématique "matériau" le laboratoire CEA/LETI développe depuis plusieurs années des matériaux à base d’oxydes de métaux de transition déposés en couches minces.Cette étude s’appuie sur l’ensemble des variantes d’oxydes de métaux de transition étudié dans ce cadre. Cette palette de matériaux, qui se sont révélés très différents dans leur structure et, corrélativement, les mesures de transport dans chacun de ces types, nous ont permis de relier structure et mécanismes de conduction spécifiques à chacun. Une attention particulière a été portée aux mesures de TCR, ou « Temperature Coefficient of Resistance », (facteur à maximiser) et de bruit en 1/f (source de bruit à minimiser), les deux paramètres de choix pour le matériau thermistor.Des grandes tendances qui pilotent la performance d’un matériau thermistor pour la bolométrie ont pu être déduites de ces investigations. Les travaux présentés dans cette thèse permettent d’évaluer le potentiel de tel ou tel compétiteur avant d’en entreprendre le développement. / InfraRed detection, formerly reserved to defense and spatial applications, is currently undergoing deep changes which open new opportunities. Uncooled microbolometer technologies, compatible with classical semiconductors processes, are now able to produce low cost thermal imagers and this will open the door to customer markets in a close future.The technology developed in the CEA/LETI laboratory use the amorphous silicon (noted "a-Si") as the thermistor material. This material has many advantages, in particular, its excellent compatibility with the classical tools used in microelectronic industry. However, better performance in the thermistor material is still needed to address future applications.To handle this challenge, CEA/LETI laboratory is currently developing thermistors made of transition metal oxides thin films. The study presented hereby is based on various transition metal oxides samples deposited in the CEA/LETI Laboratory.Characterization of the structure and the electronic transport for each of these samples allowed us to put in evidence correlations between microscopic structure and conduction mechanisms. Two main figures of merit impacting the overall material performance were investigated : the TCR, Temperature Coefficient of Resistance (which must be maximized) and the 1/f noise (which must be minimized).Finally we conclude this work by highlighting majors outlines governing the performance of a thermistor.

La technologie des microbolomètres est à ce jour la plus avancée pour l'imagerie IR non refroidie. Le LETI développe une technologie basée sur l'utilisation du silicium amorphe comme matériau thermistor. L'introduction d'un matériau alternatif doit permettre de poursuivre l'amélioration des performances. Cette étude considère une solution alternative à base de films minces d'oxydes nanocristallins. Deux procédés sont envisagés : le dépôt IBS et le dépôt MOCVD. L'étude des procédés ainsi que la caractérisation des matériaux ont permis la maîtrise et la compréhension des évolutions structurales et fonctionnelles mises en jeux. Des caractérisations électriques (résistivité, TCR, bruit en 1/f) sur dispositifs ont permis de débattre de l'intérêt de ces nouveaux matériaux. Une réflexion a été menée sur les relations microstructure-propriétés. / Microbolometers FPAs are nowadays the most advanced technology for uncooled IR imaging. Developments at CEA-LETI are based on the use of amorphous silicon as thermistor material. Introduction of an alternative material is necessary to keep on improving detectors performances. This study considersnanocrystalline oxides thin films as an alternative material. Two deposition techniques have been studied : IBS and MOCVD. Process studies as well as materials characterizations allowed us to control and understand the involved micro-structural evolutions. Electrical characterizations (resistivity, TCR, 1/f noise) on integrated devices were achievedin order to estimate the potential of these new materials. Microstructure-property relationships are also discussed.

Les lymphocytes T sont caractérisés par l’expression d’un récepteur à l’antigène des cellules T (TCR), soit le preTCR, soit le γδ TCR et le αβ TCR clonotypique, associé à un complexe de transduction formé du CD3 et de la chaîne ζ. La signalisation du complexe TCR:CD3:ζ est cruciale pour le développement des cellules T et pour leur activation spécifique par l'antigène. Ces signaux déclenchent la prolifération, la différentation, les fonctions effectrices et l’apoptose des cellules T. Les évènements proximaux de la signalisation du TCR:CD3:ζ impliquent des protéines tyrosine kinases (PTK) des familles CSK, SRC, SYK et TEC dont les acteurs principaux sont CSK (C-terminal SRC kinase), LCK (lymphocyte-specific protein tyrosine kinase), ZAP-70 (ζ chain-associated protein tyrosine kinase of 70 kDa) et ITK (interleukin-2-inducible T cell kinase). Après stimulation du complexe TCR:CD3:ζ, les PTKs sont activées et déclenchent une cascade de phosphorylation sur tyrosine dont la phosphorylation des motifs activateurs ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) du CD3 et de la chaîne ζ, et la phosphorylation des protéines adaptrices. Celles-ci conduisent à l’assemblage du signalosome LAT:SLP-76, lequel contrôle en grande partie la diversité des signaux associés au complex TCR:CD3:ζ, dont le flux calcique, l’activation de la cascade des MAP kinases, l’activation des facteurs de transcription NF-κB, NFAT et AP-1 ainsi que la réorganisation du cytosquellette d’actine, l’adhésion cellulaire et la motilité. Pendant les cinq dernières décennies, le système immunitaire a été analysé extensivement in vitro et à l’aide de modèles animaux comme la souris. Par ailleurs, l’étude des déficits immunitaires héréditaires chez l’homme a permis aussi des avancées importantes et novatrices dans la compréhension du système immunitaire humain que les modèles animaux ne permettaient pas d’appréhender. Dans ma thèse de doctorat je rapporte le premier cas de déficit humain en LCK de transmission autosomique récessive et l’identification de nouvelles mutations autosomiques récessives provoquant un défaut humain de ZAP-70 et un défaut humain d’ITK. Je rends compte des phénotypes cliniques et immunologiques associés à ces immunodéficiences et je caractérise les défauts biochimiques de la signalisation TCR:CD3:ζ associés à ces déficits. Enfin, je compare mes observations avec les modèles murins déficients Lck-/-, Zap-70-/- et Itk-/- déjà bien établis. / T lymphocytes express either a preTCR, or a clonotypic γδ TCR or αβ TCR together with the CD3-complex and the associated ζ-chain. TCR:CD3:ζ-signalling is crucial for T cell development and antigen-specific activation including proliferation, differentiation, effector functions and apoptosis of mature T cells. Protein tyrosine kinase (PTK) cascades lie at the heart of proximal TCR:CD3:ζ-signalling. The CSK-, SRC-, SYK- and TEC-family members C-terminal SRC kinase (CSK), lymphocyte-specific protein tyrosine kinase (LCK), ζ-chain associated protein tyrosine kinase of 70 kDa (ZAP-70) and interleukin-2-inducible T cell kinase (ITK), respectively, are the major T cell players. After TCR:CD3:ζ-complex triggering, activation of PTKs results in tyrosine phosphorylation signals. These include phosphorylation of immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs) of the CD3 and ζ-chains, and adaptor proteins that nucleate the proximal LAT:SLP-76-signalosome controlling almost all TCR:CD3:ζ-induced signalling events. These events initiate Ca2+-flux, activation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), activation of nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells (NF-κB), activation of nuclear factor of activated T cells (NFAT) and activator protein 1 (AP-1) as well as actin reorganization, cell-adhesion and motility. Throughout the last five decades, the immune system has been extensively investigated in vitro and in animal models such as the murine system. Additionally, studying and taking care of human primary immunodeficiency diseases (PIDs) has been seminal for our understanding of the human immune system as animal models not always recapitulate the subtleties found in men. In my doctoral thesis I report the first case of autosomal recessive human LCK-deficiency, a novel autosomal recessive mutation leading to human ZAP-70-deficiency and a novel autosomal recessive mutation leading to human ITK-deficiency. I provide detailed clinical, immunological and biochemical analyses especially of TCR:CD3:ζ-signalling and compare my findings to the well-established Lck-/-, Zap-70-/- and Itk-/- murine models.

Le corps humain contient plus de 3.72X10^13 cellules qui se distinguent par leur morphologie, fonction et état. Leur catalogage en atlas cellulaires c'est entamé il y a plus de 150 ans, avec l'invention des colorants cellulaires en microscopie. Notre connaissance des types cellulaires et leur phénotypes moléculaires nous permet de connaître et prédire leurs fonctions et patrons d'interactions. Ces connaissances sont à la base de la capacité à poser des diagnostics, créer des médicaments et même faire pousser des organes en biologie synthétique. Surprenamment, notre connaissance est loin d'être complète et c'est pourquoi la caractérisation systématique des cellules et l'assemblage des connaissances en atlas cellulaires est nécessaire. Le développement du séquençage à haut débit a révolutionné la biologie des systèmes et ce type de données est parfait pour la construction d'atlas cellulaires entièrement basés sur les données. Un tel atlas cellulaire contiendra une représentation des cellules par des vecteurs de nombres, où chaque vecteur encode le profil moléculaire capturant des informations biologiques de chaque cellule. Chaque expérience de séquençage d'ARN (RNA-Seq) produit des dizaines de milliers de mesures extrêmement riches en information dont l'analyse demeure non-triviale. Des algorithmes de réduction de dimensionnalité, entre autres, permettent d'extraire des données des patrons importants et encoder les échantillons dans des espaces plus interprétables. De cette manière, les cellules similaires sont groupés sur la base d'une multitude de mesures qu'offre le RNA-Seq. Nous avons donc créé un modèle, le Factorized Embedding (FE), qui permet d'organiser les données de séquençage d'ARN de la sorte. Le modèle apprend simultanément deux espaces d'encodage: un pour les échantillons et l'autre pour les gènes. Nous avons observé qu'une fois entraîné, que ce modèle groupe les échantillons sur la base de leur similarité d'expression génique et permet l'interpolation dans l'espace d'encodage et donc une certaine interprétabilité de l'espace d'encodage. Du côté de l'encodage des gènes, nous avons remarqué que les gènes se regroupaient selon leurs patrons de co-expression ainsi que selon des similarité de fonctions, trouvées via des ontologies de gènes (Gene Ontology, GO). Nous avons ensuite exploré les propriétés d'une modification du modèle FE, baptisée le Transcriptome Latent (TLT, de l'anglais The Latent Transcriptome), où l'encodage des gènes est remplacé par une fonction d'encodage de k-mers provenant de données brutes de RNA-Seq. Cette modification du modèle capture dans son espace d'encodage des séquence à la fois de l'information sur la similarité et l'abondance des séquences ADN. L'espace d'encodage a ainsi permis de détecter des anormalités génomiques tels les translocations, ainsi que des mutations spécifiques au patient, rendant cet espace de représentation utile autant pour la visualisation que pour l'analyse de données. Finalement, la dernière itération explorée dans cette thèse, du modèle FE, baptisée cette fois-ci le TCRome, encode des séquences TCR (récepteurs de cellules T) plutôt que des k-mers, venant du séquençage de répertoires immuns (TCR-Seq). Une irrégularité dans la performance du modèle a mené à une analyse des séquences plus approfondie et à la détection de deux sous-types de TCR. Nous avons analysé les répertoires TCR de plus de 1000 individus et rapportons que le répertoire TCR est composé de deux types de TCR ontogéniquement et fonctionellement distincts. Nous avons découvert des patrons distincts dans les abondances de l'un ou l'autre type, changeant en fonction du sexe, l'âge et dans le cadre de maladies telles chez les sujets portant des mutations dans le gène AIRE et dans le cadre de la maladie du greffon contre l'hôte (GVHD). Ces résultats pointent vers la nécessité d'utiliser des données de séquençage multi-modales pour la construction d'atlas cellulaires, c'est à dire en plus des séquence TCR, des données sur l'expression génique ainsi que des caractérisation moléculaires seront probablement utiles, mais leur intégration sera non-triviale. Le modèle FE (et ses modifications) est un bon candidat pour ce type d'encodage, vu sa flexibilité d'architecture et sa résilience aux données manquantes. / The human body contains over 3.72 x 10^13 cells, that distinguish themselves by their morphology, function and state. Their cataloguing into cell atlases has started over 150 years ago, with the invention of cellular stains for microscopy. Our knowledge of cell types and molecular phenotypes allows is to better know and predict their functions and interaction patterns. This knowledge is at the basis of the ability to diagnose disease, create drugs and even grow organs in synthetic biology. Surprisingly, our knowledge is far from complete and this is why a systematic characterization of cells and the assembly of cell atlases is important. The development of high throughput sequencing has revolutionized systems biology and this type of data is perfect for the construction of entirely data-driven cell atlases. Such an atlas will contain a representation of cells by vectors of numbers, where each vector encodes a molecular profile, capturing biological data about each cell. Each sequencing experiment yields tens of thousands of measurements, extremely rich in information, but their analysis remains non-trivial. Dimensionnality reduction algorithms allow to extract from the data important patterns and encode samples into interpretable spaces. This way, similar cells are grouped on the basis of a multitude of measurements that comes from high throughput sequencing. We have created a model, the Factorized Embedding (FE), that allows to organize RNA sequencing (RNA-Seq) data in such a way. The FE model learns simultaneously two encoding spaces: one for samples and one for genes. We have found that the model groups samples on the basis of similar gene expression and allows for smooth interpolation in the encoding space and thus some manner of interpretability. As for the gene encoding space, we observed that gene coordinates were grouped according to co-expression patterns as well as similarity in function, found via gene ontology (GO). We then explored a modification of the FE model, names The Latent Transcriptome (TLT), where the gene encoding function is replaced by a function encoding k-mers, calculated from raw RNA-Seq data. This modification of the model captured in the k-mer encoding space both sequence similarity and sequence abundance. The encoding space allowed for the detection of genomic abnormalities such as translocations, as well as patient-specific mutations, making the encoding space useful for both visualisation and data analysis. Finally, the last iteration of the FE model that we explored, called TCRome, encodes amino-acid TCR sequences rather than k-mers. An irregularity in the model's performance led us to discover two TCR subtypes, entirely based on their sequence. We have thus analyzed TCR repertoires of over 1000 individuals and report that the TCR repertoire is composed of two ontogenically and functionally distinct types. We have discovered distinct pattens in the abundances of each of the sub-types, changing with age, sex and in the context of some diseases such as in individuals carrying a mutated AIRE gene and in graft versus host disease (GVHD). Collectively, these results point towards the necessity to use multi-modal sequencing data for the construction of cell atlases, namely gene expression data, TCR sequencing data and possibly various molecular characterizations. The integration of all this data will however be non-trivial. The FE model (and its modifications) is a good candidate for this type of data organisation, namely because of its flexibility in architecture and resilience to missing data.

Les cellules T maturent dans le thymus lors d’un processus très régulé par l’intermédiaire de facteurs intrinsèques, comme des facteurs de transcription, et des facteurs extrinsèques (par exemple des cytokines des cellules stromales). L’acquisition du potentiel T au cours de la thymopoïèse, à partir d’un précurseur médullaire, se réalise grâce à des étapes successives définies par l’expression de molécules de surface et par les différents réarrangements des gènes du TCR qui sont ordonnés : le TCRd étant le premier à se produire, suivi par le TCRg et TCRb, pour finir par le TCRa. Les réarrangements du TCR restent également parfaitement ordonnancés dans les leucémies aigues lymphoblastiques T et ce malgré l’accumulation successive d’évènements oncogéniques. Il est ainsi possible de définir trois sous-groupes immunogénétiques de LAL-T ; (i) les formes immatures n’exprimant pas de TCRb cytoplasmique (ii) les LAL-T matures exprimant un TCR de surface et enfin (iii) les LAL-T intermédiaires, dites pré-ab, exprimant le TCRb en intracytoplasmique sans expression membranaire d’un hétérodimère ab ou gd. Dans ce dernier sous groupe de LAL-T de phénotype cortical, deux oncogènes à homéodomaines, TLX1 et TLX3, appartenant à la famille des gènes homéotiques orphelins NKL, sont souvent dérégulés. Nous avons précédemment mis en évidence le rôle direct des oncoprotéines TLX dans le processus de l’arrêt de maturation, grâce à leur interaction avec le facteur de transcription ETS1, bloquant l’expression et les réarrangements du TCRa. Néanmoins, une partie des LAL-T corticales ne surexprime ni TLX1 ni TLX3, posant la question de l’implication potentielle d’autres gènes de la famille NKL dans le blocage de maturation. Nous avons donc réalisé une analyse transcriptionnelle de l’ensemble des 46 gènes de la famille NKL dans une large série de LAL-T et comparé les résultats avec ceux obtenus dans des sous populations thymiques humaines triées. Nous avons ainsi identifié 10 gènes dérégulés de manière ectopique dans notre série de LAL-T, incluant 6 gènes dont la dérégulation était inconnue dans ce contexte. Par ailleurs, nous avons mis au point une approche complexe combinant une analyse en CGH-array haute résolution, le dosage allélique du locus TCRa et un système de RT-PCR multiplex afin d’étudier de manière exhaustive le statut du locus TCRa dans cette même série de LAL-T. Nos résultats ont ainsi montré que ces nouveaux gènes NKL aboutissent aussi à une répression du TCRa par un mécanisme similaire à celui observé avec les oncoprotéines TLX. Les lymphomes anaplasiques (ALCL), qui sont caractérisés par une expression aberrante d’ALK, issue de la t(2;5), expriment des marqueurs d’activation T (CD30), cytotoxique (granzyme, perforin, TIA1) et des réarrangements clonaux du TCR, mais sans signalisation du TCR/CD3. Le stade du développement lymphoïde T où est initié la lymphomagenèse est inconnu, il est possible que cette translocation se produise avant l’expulsion thymique. Pour étudier cette hypothèse, nous avons analysé l’ensemble des TCR (d,g,b,a) par PCR et CGH array dans une série d’ALCL humain et utilisé un modèle murin de lymphomagénèse T dans lequel NPM-ALK est exprimé à l’aide du promoteur de CD4. Nous avons croisé ce premier modèle avec des souris transgéniques RAG déficient et/ou en présence d’un transgène TCR (OT1), afin d’étudier le rôle du TCR dans le développement tumoral. Le modèle de lymphomagenèse identifié est basé sur une expression de NPM-ALK dès les stades précoces de la différenciation thymique, lorsque le transcrit de fusion peut remplacer le TCRb, et lors de l’expansion des thymocytes corticaux au niveau de la « b-sélection ». Un TCR est cependant nécessaire pour la sortie du thymus, bien que perdu lors du développement des ALCL en périphérie. En conclusion, nous avons montré l’implication du TCR dans deux modèles d’oncogenèse. (...) / T cells mature in the thymus through a highly regulated process mediated by intrinsic factors (e.g. transcription factors) and extrinsic factors (e.g. cytokines or stromal cells). The acquisition of T lymphoid commitment during thymopoiesis, originating from a bone marrow precursor, is carried out through successive stages defined by the expression of various surface molecules and the precisely ordered TCR gene rearrangements; TCRd being the first to occur, followed by the TCRg and TCRb, and finally TCRa. TCR rearrangements are also highly coordinated in T acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) despite the successive accumulation of oncogenic events. It is thus possible to define three immunogenetic subgroups of T-ALL; (I) the immature forms that do not express cytoplasmic TCRb, (ii) mature T-ALL which express a surface TCR and finally (iii) intermediate T-ALL, termed preab, which express intracytoplasmic TCRb without membrane expression of a TCR ab or gd Complex. In the latter subgroup, classically termed cortical T-ALL, two oncogenic transcription factors belonging to the NKL family of homeobox genes, TLX1 and TLX3, are commonly deregulated. We have previously demonstrated the direct role of TLX oncoproteins in the process of maturation arrest through their interaction with the ETS1 transcription factor, which blocks expression and rearrangements of TCRa. Not all cortical T-ALL cortical overexpress TLX1 nor TLX3, however, suggesting that other NKL family genes might be involved in the maturation arrest. We therefore, conducted a transcriptional analysis of all 46 NKL family genes in a large series of T-ALL and compared the results with those obtained in sorted human thymic subpopulations. We identified 10 ‘ectopic’ deregulated genes in T-ALL, including 6 genes whose deregulation was previously unknown in this leukemia. By combining high resolution CGH array, allelic of TCRa locus dosage and a novel TCRa RT-PCR multiplex, we show that these deregulated NKL genes also lead to inhibition of TCRa rearrangement, similar to that observed with TLX. These date demonstrate that homeobox inhibition of TCRa rearrangement is likely to explain the maturation arrest in the majority of cortical T-ALL, the commonest and most emblematic subgroup in this leukemia. Anaplastic lymphoma (ALCL), which are characterized by t(2;5) driven aberrant expression of ALK, express T activation markers (CD30), cytotoxic (granzyme, perforin, TIA1), and clonal TCR rearrangements in the intriguing absence of TCR/CD3 signaling. It is not clear at what stage of development ALCL lymphomagenesis is initiated, but as the expression of NPM is ubiquitous, it is possible that this translocation occurs before thymic egress. To investigate this, we analyzed all TCR(a,b,g,d) by PCR and CGH array in a series of human ALCL and compared these results with a T lymphomagenesis murine model in which NPM-ALK is regulated by the CD4 promoter. We crossed this first model with RAG deficient transgenic mice in the presence or not of a TCR transgene (OT1), to study the role of the TCR in tumor development. NPM-ALK expression from the earliest stages of thymic differentiation allow the fusion transcript to replace TCRb during the cortical thymic cellular expansion process known as "beta-selection". A TCR is, however, necessary for thymus egress, but is subsequently lost during the development of ALCL in the periphery, suggesting that the coexistence of TCR and NPM-ALK signaling is not compatible with lymphomagenesis and that the TCR may act as a tumor suppressor gene. In conclusion, we have delineated the involvement of TCRa in two models of oncogenesis. In T-ALL, NKL oncoproteins NKL prevent TCRa rearrangements and block cells at the highly proliferative TCRb-selection cortical thymic stage. In ALCL, a functional TCR appears to act as a tumor suppressor gene. Both models pave the way to differentiation therapy via TCR modulation.

Les cellules T maturent dans le thymus lors d’un processus très régulé par l’intermédiaire de facteurs intrinsèques, comme des facteurs de transcription, et des facteurs extrinsèques (par exemple des cytokines des cellules stromales). L’acquisition du potentiel T au cours de la thymopoïèse, à partir d’un précurseur médullaire, se réalise grâce à des étapes successives définies par l’expression de molécules de surface et par les différents réarrangements des gènes du TCR qui sont ordonnés : le TCRd étant le premier à se produire, suivi par le TCRg et TCRb, pour finir par le TCRa. Les réarrangements du TCR restent également parfaitement ordonnancés dans les leucémies aigues lymphoblastiques T et ce malgré l’accumulation successive d’évènements oncogéniques. Il est ainsi possible de définir trois sous-groupes immunogénétiques de LAL-T ; (i) les formes immatures n’exprimant pas de TCRb cytoplasmique (ii) les LAL-T matures exprimant un TCR de surface et enfin (iii) les LAL-T intermédiaires, dites pré-ab, exprimant le TCRb en intracytoplasmique sans expression membranaire d’un hétérodimère ab ou gd. Dans ce dernier sous groupe de LAL-T de phénotype cortical, deux oncogènes à homéodomaines, TLX1 et TLX3, appartenant à la famille des gènes homéotiques orphelins NKL, sont souvent dérégulés. Nous avons précédemment mis en évidence le rôle direct des oncoprotéines TLX dans le processus de l’arrêt de maturation, grâce à leur interaction avec le facteur de transcription ETS1, bloquant l’expression et les réarrangements du TCRa. Néanmoins, une partie des LAL-T corticales ne surexprime ni TLX1 ni TLX3, posant la question de l’implication potentielle d’autres gènes de la famille NKL dans le blocage de maturation. Nous avons donc réalisé une analyse transcriptionnelle de l’ensemble des 46 gènes de la famille NKL dans une large série de LAL-T et comparé les résultats avec ceux obtenus dans des sous populations thymiques humaines triées. Nous avons ainsi identifié 10 gènes dérégulés de manière ectopique dans notre série de LAL-T, incluant 6 gènes dont la dérégulation était inconnue dans ce contexte. Par ailleurs, nous avons mis au point une approche complexe combinant une analyse en CGH-array haute résolution, le dosage allélique du locus TCRa et un système de RT-PCR multiplex afin d’étudier de manière exhaustive le statut du locus TCRa dans cette même série de LAL-T. Nos résultats ont ainsi montré que ces nouveaux gènes NKL aboutissent aussi à une répression du TCRa par un mécanisme similaire à celui observé avec les oncoprotéines TLX. Les lymphomes anaplasiques (ALCL), qui sont caractérisés par une expression aberrante d’ALK, issue de la t(2;5), expriment des marqueurs d’activation T (CD30), cytotoxique (granzyme, perforin, TIA1) et des réarrangements clonaux du TCR, mais sans signalisation du TCR/CD3. Le stade du développement lymphoïde T où est initié la lymphomagenèse est inconnu, il est possible que cette translocation se produise avant l’expulsion thymique. Pour étudier cette hypothèse, nous avons analysé l’ensemble des TCR (d,g,b,a) par PCR et CGH array dans une série d’ALCL humain et utilisé un modèle murin de lymphomagénèse T dans lequel NPM-ALK est exprimé à l’aide du promoteur de CD4. Nous avons croisé ce premier modèle avec des souris transgéniques RAG déficient et/ou en présence d’un transgène TCR (OT1), afin d’étudier le rôle du TCR dans le développement tumoral. Le modèle de lymphomagenèse identifié est basé sur une expression de NPM-ALK dès les stades précoces de la différenciation thymique, lorsque le transcrit de fusion peut remplacer le TCRb, et lors de l’expansion des thymocytes corticaux au niveau de la « b-sélection ». Un TCR est cependant nécessaire pour la sortie du thymus, bien que perdu lors du développement des ALCL en périphérie. En conclusion, nous avons montré l’implication du TCR dans deux modèles d’oncogenèse. (...) / T cells mature in the thymus through a highly regulated process mediated by intrinsic factors (e.g. transcription factors) and extrinsic factors (e.g. cytokines or stromal cells). The acquisition of T lymphoid commitment during thymopoiesis, originating from a bone marrow precursor, is carried out through successive stages defined by the expression of various surface molecules and the precisely ordered TCR gene rearrangements; TCRd being the first to occur, followed by the TCRg and TCRb, and finally TCRa. TCR rearrangements are also highly coordinated in T acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) despite the successive accumulation of oncogenic events. It is thus possible to define three immunogenetic subgroups of T-ALL; (I) the immature forms that do not express cytoplasmic TCRb, (ii) mature T-ALL which express a surface TCR and finally (iii) intermediate T-ALL, termed preab, which express intracytoplasmic TCRb without membrane expression of a TCR ab or gd Complex. In the latter subgroup, classically termed cortical T-ALL, two oncogenic transcription factors belonging to the NKL family of homeobox genes, TLX1 and TLX3, are commonly deregulated. We have previously demonstrated the direct role of TLX oncoproteins in the process of maturation arrest through their interaction with the ETS1 transcription factor, which blocks expression and rearrangements of TCRa. Not all cortical T-ALL cortical overexpress TLX1 nor TLX3, however, suggesting that other NKL family genes might be involved in the maturation arrest. We therefore, conducted a transcriptional analysis of all 46 NKL family genes in a large series of T-ALL and compared the results with those obtained in sorted human thymic subpopulations. We identified 10 ‘ectopic’ deregulated genes in T-ALL, including 6 genes whose deregulation was previously unknown in this leukemia. By combining high resolution CGH array, allelic of TCRa locus dosage and a novel TCRa RT-PCR multiplex, we show that these deregulated NKL genes also lead to inhibition of TCRa rearrangement, similar to that observed with TLX. These date demonstrate that homeobox inhibition of TCRa rearrangement is likely to explain the maturation arrest in the majority of cortical T-ALL, the commonest and most emblematic subgroup in this leukemia. Anaplastic lymphoma (ALCL), which are characterized by t(2;5) driven aberrant expression of ALK, express T activation markers (CD30), cytotoxic (granzyme, perforin, TIA1), and clonal TCR rearrangements in the intriguing absence of TCR/CD3 signaling. It is not clear at what stage of development ALCL lymphomagenesis is initiated, but as the expression of NPM is ubiquitous, it is possible that this translocation occurs before thymic egress. To investigate this, we analyzed all TCR(a,b,g,d) by PCR and CGH array in a series of human ALCL and compared these results with a T lymphomagenesis murine model in which NPM-ALK is regulated by the CD4 promoter. We crossed this first model with RAG deficient transgenic mice in the presence or not of a TCR transgene (OT1), to study the role of the TCR in tumor development. NPM-ALK expression from the earliest stages of thymic differentiation allow the fusion transcript to replace TCRb during the cortical thymic cellular expansion process known as "beta-selection". A TCR is, however, necessary for thymus egress, but is subsequently lost during the development of ALCL in the periphery, suggesting that the coexistence of TCR and NPM-ALK signaling is not compatible with lymphomagenesis and that the TCR may act as a tumor suppressor gene. In conclusion, we have delineated the involvement of TCRa in two models of oncogenesis. In T-ALL, NKL oncoproteins NKL prevent TCRa rearrangements and block cells at the highly proliferative TCRb-selection cortical thymic stage. In ALCL, a functional TCR appears to act as a tumor suppressor gene. Both models pave the way to differentiation therapy via TCR modulation.

Les cellules T maturent dans le thymus lors d’un processus très régulé par l’intermédiaire de facteurs intrinsèques, comme des facteurs de transcription, et des facteurs extrinsèques (par exemple des cytokines des cellules stromales). L’acquisition du potentiel T au cours de la thymopoïèse, à partir d’un précurseur médullaire, se réalise grâce à des étapes successives définies par l’expression de molécules de surface et par les différents réarrangements des gènes du TCR qui sont ordonnés : le TCRd étant le premier à se produire, suivi par le TCRg et TCRb, pour finir par le TCRa. Les réarrangements du TCR restent également parfaitement ordonnancés dans les leucémies aigues lymphoblastiques T et ce malgré l’accumulation successive d’évènements oncogéniques. Il est ainsi possible de définir trois sous-groupes immunogénétiques de LAL-T ; (i) les formes immatures n’exprimant pas de TCRb cytoplasmique (ii) les LAL-T matures exprimant un TCR de surface et enfin (iii) les LAL-T intermédiaires, dites pré-ab, exprimant le TCRb en intracytoplasmique sans expression membranaire d’un hétérodimère ab ou gd. Dans ce dernier sous groupe de LAL-T de phénotype cortical, deux oncogènes à homéodomaines, TLX1 et TLX3, appartenant à la famille des gènes homéotiques orphelins NKL, sont souvent dérégulés. Nous avons précédemment mis en évidence le rôle direct des oncoprotéines TLX dans le processus de l’arrêt de maturation, grâce à leur interaction avec le facteur de transcription ETS1, bloquant l’expression et les réarrangements du TCRa. Néanmoins, une partie des LAL-T corticales ne surexprime ni TLX1 ni TLX3, posant la question de l’implication potentielle d’autres gènes de la famille NKL dans le blocage de maturation. Nous avons donc réalisé une analyse transcriptionnelle de l’ensemble des 46 gènes de la famille NKL dans une large série de LAL-T et comparé les résultats avec ceux obtenus dans des sous populations thymiques humaines triées. Nous avons ainsi identifié 10 gènes dérégulés de manière ectopique dans notre série de LAL-T, incluant 6 gènes dont la dérégulation était inconnue dans ce contexte. Par ailleurs, nous avons mis au point une approche complexe combinant une analyse en CGH-array haute résolution, le dosage allélique du locus TCRa et un système de RT-PCR multiplex afin d’étudier de manière exhaustive le statut du locus TCRa dans cette même série de LAL-T. Nos résultats ont ainsi montré que ces nouveaux gènes NKL aboutissent aussi à une répression du TCRa par un mécanisme similaire à celui observé avec les oncoprotéines TLX. Les lymphomes anaplasiques (ALCL), qui sont caractérisés par une expression aberrante d’ALK, issue de la t(2;5), expriment des marqueurs d’activation T (CD30), cytotoxique (granzyme, perforin, TIA1) et des réarrangements clonaux du TCR, mais sans signalisation du TCR/CD3. Le stade du développement lymphoïde T où est initié la lymphomagenèse est inconnu, il est possible que cette translocation se produise avant l’expulsion thymique. Pour étudier cette hypothèse, nous avons analysé l’ensemble des TCR (d,g,b,a) par PCR et CGH array dans une série d’ALCL humain et utilisé un modèle murin de lymphomagénèse T dans lequel NPM-ALK est exprimé à l’aide du promoteur de CD4. Nous avons croisé ce premier modèle avec des souris transgéniques RAG déficient et/ou en présence d’un transgène TCR (OT1), afin d’étudier le rôle du TCR dans le développement tumoral. Le modèle de lymphomagenèse identifié est basé sur une expression de NPM-ALK dès les stades précoces de la différenciation thymique, lorsque le transcrit de fusion peut remplacer le TCRb, et lors de l’expansion des thymocytes corticaux au niveau de la « b-sélection ». Un TCR est cependant nécessaire pour la sortie du thymus, bien que perdu lors du développement des ALCL en périphérie. En conclusion, nous avons montré l’implication du TCR dans deux modèles d’oncogenèse. (...) / T cells mature in the thymus through a highly regulated process mediated by intrinsic factors (e.g. transcription factors) and extrinsic factors (e.g. cytokines or stromal cells). The acquisition of T lymphoid commitment during thymopoiesis, originating from a bone marrow precursor, is carried out through successive stages defined by the expression of various surface molecules and the precisely ordered TCR gene rearrangements; TCRd being the first to occur, followed by the TCRg and TCRb, and finally TCRa. TCR rearrangements are also highly coordinated in T acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) despite the successive accumulation of oncogenic events. It is thus possible to define three immunogenetic subgroups of T-ALL; (I) the immature forms that do not express cytoplasmic TCRb, (ii) mature T-ALL which express a surface TCR and finally (iii) intermediate T-ALL, termed preab, which express intracytoplasmic TCRb without membrane expression of a TCR ab or gd Complex. In the latter subgroup, classically termed cortical T-ALL, two oncogenic transcription factors belonging to the NKL family of homeobox genes, TLX1 and TLX3, are commonly deregulated. We have previously demonstrated the direct role of TLX oncoproteins in the process of maturation arrest through their interaction with the ETS1 transcription factor, which blocks expression and rearrangements of TCRa. Not all cortical T-ALL cortical overexpress TLX1 nor TLX3, however, suggesting that other NKL family genes might be involved in the maturation arrest. We therefore, conducted a transcriptional analysis of all 46 NKL family genes in a large series of T-ALL and compared the results with those obtained in sorted human thymic subpopulations. We identified 10 ‘ectopic’ deregulated genes in T-ALL, including 6 genes whose deregulation was previously unknown in this leukemia. By combining high resolution CGH array, allelic of TCRa locus dosage and a novel TCRa RT-PCR multiplex, we show that these deregulated NKL genes also lead to inhibition of TCRa rearrangement, similar to that observed with TLX. These date demonstrate that homeobox inhibition of TCRa rearrangement is likely to explain the maturation arrest in the majority of cortical T-ALL, the commonest and most emblematic subgroup in this leukemia. Anaplastic lymphoma (ALCL), which are characterized by t(2;5) driven aberrant expression of ALK, express T activation markers (CD30), cytotoxic (granzyme, perforin, TIA1), and clonal TCR rearrangements in the intriguing absence of TCR/CD3 signaling. It is not clear at what stage of development ALCL lymphomagenesis is initiated, but as the expression of NPM is ubiquitous, it is possible that this translocation occurs before thymic egress. To investigate this, we analyzed all TCR(a,b,g,d) by PCR and CGH array in a series of human ALCL and compared these results with a T lymphomagenesis murine model in which NPM-ALK is regulated by the CD4 promoter. We crossed this first model with RAG deficient transgenic mice in the presence or not of a TCR transgene (OT1), to study the role of the TCR in tumor development. NPM-ALK expression from the earliest stages of thymic differentiation allow the fusion transcript to replace TCRb during the cortical thymic cellular expansion process known as "beta-selection". A TCR is, however, necessary for thymus egress, but is subsequently lost during the development of ALCL in the periphery, suggesting that the coexistence of TCR and NPM-ALK signaling is not compatible with lymphomagenesis and that the TCR may act as a tumor suppressor gene. In conclusion, we have delineated the involvement of TCRa in two models of oncogenesis. In T-ALL, NKL oncoproteins NKL prevent TCRa rearrangements and block cells at the highly proliferative TCRb-selection cortical thymic stage. In ALCL, a functional TCR appears to act as a tumor suppressor gene. Both models pave the way to differentiation therapy via TCR modulation.

La neuropiline-1 (Nrp-1) est une protéine transmembranaire agissant comme récepteur des sémaphorines de classe 3 (Sema3) et du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF). En plus de son rôle crucial dans le développement des systèmes nerveux et cardiovasculaires, Nrp-1 est impliquée dans des processus physiopathologiques impliquant certains de ses ligands classiques (Sema3 et VEGF) ou récemment caractérisés (TGF-β1 et PDGF) dans les tissus adultes. Dans le système immunitaire, Nrp-1 participe aux interactions entre les lymphocytes T et les cellules dendritiques, transmet les effets immunorégulateurs de Sema3A sur les lymphocytes T, et est impliqué dans le mécanisme suppresseur des lymphocytes T régulateurs (Treg) Foxp3+. Cependant, l'expression de Nrp-1 dans les lymphocytes T non-Treg humains et murins n'a été que peu étudiée. L'objectif de ce projet était de caractériser les populations de lymphocytes T Nrp-1+ non-Treg chez la souris, d'analyser leurs fonctions, d'identifier les mécanismes conduisant à l'expression de Nrp-1 dans ces cellules, et de comprendre le rôle joué par Nrp-1 dans les réponses immunitaires T. Mon travail s'est d'une part intéressé à une population de lymphocytes T non-conventionnels appelés lymphocytes « invariant natural killer T » (iNKT). Les lymphocytes iNKT sont des lymphocytes Tαβ dérivés du thymus aux propriétés immunomodulatrices reposant sur la sécrétion rapide de cytokines TH1 et TH2 après engagement de leur TCR semi-invariant par des complexes CD1d/glycolipide. Un sous-type distinct de cellules iNKT, dont l'origine et l'homéostasie sont encore mal connues, produit la cytokine pro-inflammatoire IL-17. Dans ce travail, j'ai montré que les lymphocytes iNKT émigrés thymiques récents sont identifiés spécifiquement par l'expression de Nrp-1. Les lymphocytes iNKT producteurs d'IL-17 expriment Nrp-1 et dépendent de l'export thymique. D'autre part, Nrp-1 est exprimé par les thymocytes immatures en division et certains lymphocytes Tαβ conventionnels mémoires en prolifération homéostatique rapide. In vitro, l'activation des lymphocytes T par le TCR induit l'expression de Nrp-1 de manière dépendante de la voie de signalisation Ca2+/calcineurine/NFAT. L'expression de Nrp-1 dans les lymphocytes T activés les sensibilise aux effets régulateurs de Sema3A et TGF-β1. En conclusion, ces résultats apportent de nouvelles données concernant l'expression et la fonction de Nrp-1 dans le système immunitaire. Plus généralement, cette étude permet d'envisager des stratégies thérapeutiques ciblant les processus dépendants de Nrp-1 dans les pathologies du système immunitaire et du système nerveux ou les cancers.

Manfouo Foutsop Germain (2010). Etude de lexpression des gènes cellulaires dérégulés dans des cellules T CD4+ exprimant Tat de HIV-1 : Focalisation sur la voie de signalisation TCR/CD3 (thèse de doctorat). Université de Liège-Gembloux Agro-Bio Tech, 157 pages, 11 tables, 29 figures. Résumé Nos travaux précédents ont suggéré que les gènes nef (negative factor) et tat (transactivateur de la transcription) du virus de limmunodéficience humaine de type 1 (HIV-1) pourraient induire la perte du récepteur des cellules T (TCR)/CD3 à la surface des lymphocytes T CD4+ infectés par le HIV-1, mais la contribution de tat dans cette perte navait pas été prouvée. Dans la première partie de ce travail nous avons utilisé un vecteur lentiviral exprimant les formes natives [1exon (72aa) ou 2exons (101aa)] ou des formes mutées du gène tat de HIV-1 pour transduire les cellules T CD4+. Ceci nous a permis de montrer que la production de la protéine Tat72aa ou Tat101aa entraîne une perte progressive du complexe TCR/CD3 en surface des cellules T CD4+. Nous avons constaté que cette perte de TCR/CD3 serait due à une diminution du taux des transcrits de CD3γ. Par ailleurs, nous avons montré que certains mutants du gène tat ont perdu leur activité transactivatrice et sont incapables dinduire la perte de TCR/CD3. Dans la deuxième partie des travaux, nous avons identifié par microarray, les gènes cellulaires dont les expressions sont communément altérées dans les cellules T CD4+ infectées par le HIV-1 ou transduites avec le gène tat-1exon ou tat-2exons. Plusieurs de ces gènes sont impliqués dans la voie de signalisation TCR/CD3. Nos travaux nous ont donc permis de montrer limplication du gène tat dans la dérégulation de la voie de signalisation TCR/CD3. Par conséquent, Tat pourrait induire une altération de la réponse immunitaire favorisant ainsi la progression de linfection par le HIV-1/SIDA. Manfouo Foutsop Germain (2010). A study of altered cellular gene expression in CD4+ T cells expressing HIV-1 Tat: Focus on the T cell receptor/CD3-directed pathway (PhD thesis). Université de Liège-Gembloux Agro-Bio Tech, 157 pages, 11 tables, 29 figures. Summary Our previous work has suggested that nef (negative factor) and tat (transactivator of transcription) are responsible for T cell receptor (TCR)/CD3 downmodulation on CD4+ T cells after infection with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). However, the contribution of tat to this phenomenon has not been investigated. In the first part of this study we used lentiviral vector expressing the native tat gene [1exon (72aa) or two exon (101aa)] and various mutants to transduce CD4+ T cells. We found that Tat expression alone could provoke the progressive downmodulation of surface TCR/CD3 complexes due to the decrease of CD3γ transcripts. We also demonstrated that the majority of mutants lost their transactivation capability and their ability to downregulate the TCR/CD3 complex. In the second part of this work, we used gene expression arrays to identify cellular genes whose expression was altered in CD4+ T cells infected with HIV-1 or transduced with tat at different stages of receptor downregulation. We found progressive alteration of cellular gene expression in parallel with TCR/CD3 downregulation in the tat-transduced cells, which represented a subset of the changes detected in the HIV-1 infected cells, with significant number genes known to play a role in the TCR/CD3 signaling pathway. Our data demonstrate that tat deregulates the TCR/CD3 expression and signaling leading to altered immune function that likely favor HIV-1/AIDS disease progression. Copyright: Aux termes de la loi belge du 30 juin 1994, sur le droit dauteur et les droits voisins, seul lauteur a le droit de reproduire partiellement ou complètement cet ouvrage de quelque façon que ce soit ou dautoriser la reproduction partielle ou complète de quelque manière et sous quelque forme que ce soit. Toute photocopie ou reproduction sous autre forme est donc faite en violation de ladite loi et des modifications ultérieures.

<p>Linker for activation of T cells (LAT) is a transmembrane adaptor protein that is crucial in linking TCR engagement to downstream signaling events, such as calcium flux and Ras-MAPK pathway. Following TCR engagement, LAT is phosphorylated at its membrane-distal tyrosine residues, which mediates the binding of Grb2/Sos, PLC-&#61543;1, and GADS/SLP-76 complexes. This multi-protein signaling complex initiates signaling cascades eventually leading to the activation of transcription factors that regulate the genes required for T cell proliferation and effector functions. The indispensable role of LAT in thymocyte development has been evidenced as LAT-deficient mice completely lack peripheral T cells. To study the function of LAT in mature T cells, our lab previously generated a conditional knock-in mouse line in which the lat gene can be deleted by Cre recombinase. Deletion of LAT in mature T cells revealed the critical role of LAT in T cell activation. Here, we used this inducible LAT deletion mouse line crossed with the OT-I transgenic mice to study the role of LAT in mature CD8 T cells. </p><p>To analyze the contribution of LAT in CD8 T cells during the course of pathogen infection, we infected mice with Listeria monocytogenes-expressing Ova to elicit activation of antigen-specific CD8 T cells, and then inducibly deleted LAT in these cells at different stages of infection under the control of tamoxifen treatment. We show that LAT is important for maintaining CD8 T cell expansion during the priming phase; however, it is not required for CD8 T cell contraction. In addition, memory CD8 T cell can persist in the absence of LAT, suggesting that LAT-signaling is not necessary for memory maintenance. Nonetheless, these LAT-deficient memory T cells were unable to proliferate or produce cytokines upon secondary infection. Moreover, LAT deficiency accelerates memory differentiation during the effector-to-memory transition, leading to a higher frequency of KLRG1lowIL-7RhighCD62Lhigh memory T cells. Together, these data demonstrate that, while it is dispensable for contraction and memory maintenance, LAT-signaling regulates CD8 T cell memory differentiation and is essential for the memory response against pathogens.</p><p>The fundamental activity of CD8 T cells is to elicit cytotoxicity toward target cells that express foreign antigens, and this is mediated through granule-dependent and Fas ligand-dependent mechanisms. The signaling events that regulate these processes remain unclear. We showed that LAT-deficient cytotoxic T cells (CTLs) failed to upregulate FasL and produce IFN-&#61543; after engagement with target cells. Moreover, they displayed reduced granule-mediated killing. We further dissected the effect of the LAT deletion on each step of granule exocytosis. LAT-deficiency led to altered synapse formation, subsequently causing unstable T cell:APC conjugates. MTOC polarization and granule reorientation were also impaired by LAT-deficiency, leading to reduced granule delivery. Despite these defects, granule release was still observed in LAT-deficient CTLs due to residual calcium flux and PLC activity. This revealed an unexpected finding that CTL function is not entirely dependent on LAT. Collectively, these data indicate that the signaling circuits governing CTLs are programmed to adopt multiple pathways, allowing CTLs to effectively eliminate various pathogens during adaptive immune responses.</p><p>&#8195;</p> / Dissertation