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The CCCTC-binding factor (CTCF) is a versatile, multifunctional zinc-finger protein involved in a broad spectrum of cellular functions. In mammalian cells, CTCF functions together with the Cohesin complex, an essential regulator of sister chromatid cohesion. Together, CTCF and Cohesin have been shown to regulate gene expression at a genome-wide level in mammalian cells. In the yeast Saccharomyces pombe, Cohesin has been implicated in transcription termination of convergently transcribed genes, in a cell cycle dependent manner. The aim of this thesis was to investigate the possibility of direct transcriptional involvement of CTCF and Cohesin in human cells. The first model system applied for this experimental purpose was the β-globin gene with introduced canonical CTCF-binding sites replacing the endogenous Co- Transcriptional Cleavage (CoTC) element downstream of β-globin. The results obtained indicate that recruitment of CTCF to the β-globin 3` flanking region does not prevent read-through transcription. However, CTCF-binding does mediate RNA Polymerase II (Pol II) pausing at the site of recruited CTCF. This results in more efficient pre-mRNA 3` end processing and therefore rescues β-globin mRNA to wild type levels. Cohesin was not detected at the introduced CTCF-binding sites. These results are a contribution to our understanding of the spatio-temporal requirements for cotranscriptional events like 3` end pre-mRNA processing and Pol II kinetics. The second part of my thesis presents an investigation on the involvement of CTCF and Cohesin in lipopolysaccharide (LPS)-induced Tumor Necrosis Factor α (TNFα) gene expression regulation in human monocytes and differentiated M1- and M2-type macrophages. These studies provide first evidence of Cohesin recruitment to the TNFα gene body and its regulatory NFκB-binding sites. Differences in the recruitment profiles obtained indicate potential regulatory differences of TNFα among the three cell types. Preliminary data provide an insight into the effects on TNFα mRNA levels upon down-regulation of Cohesin subunits.

<p>This thesis reports on the effects of stress management on long-term pain patients and on a healthy sample from IT and media companies; two groups that are commonly exposed to high stress levels. Even if there are important differences between these two groups, there are similarities such as the necessity for effective stress management. Stress-related and musculoskeletal disorders are major public health issues in most industrialized countries and are expected to become increasingly common during the coming decades. The pathogenic plastic changes in the CNS and immune system caused by long-term stress pose severe burdens to individuals, organizations as well as society in general. Thus, stress management may be essential to maintain and improve long-term health and wellbeing and to proactively counteract stress-related ill-health.</p><p>This thesis is based on four papers: Paper I assessed the effects of massage as compared to relaxation tapes in long-term pain patients. Paper II validated some of the Visual Analogue Scale questions that were to be used in paper III and IV. Paper III assessed the effects on mental and physical wellbeing and biological stress markers from a web-based stress management and health promotion tool. Paper IV aimed at mapping out predictors for trends (improvement vs. worsening) in self-rated health (SRH) over a period of one year.</p><p>The overall results indicate that individually focused stress management interventions in long-term pain patients as well as on a healthy, working population may have short-term beneficial effects on psychological and physiological stress, health and wellbeing. On a long-term basis the beneficial changes seem to revert. In paper four, it is indicated that the stress management intervention is not a significant predictor of long-term changes in SRH. Rather, other factors such as health perception, sleep quality and sense of coherence predicted improvement in SRH over time.</p>

This thesis reports on the effects of stress management on long-term pain patients and on a healthy sample from IT and media companies; two groups that are commonly exposed to high stress levels. Even if there are important differences between these two groups, there are similarities such as the necessity for effective stress management. Stress-related and musculoskeletal disorders are major public health issues in most industrialized countries and are expected to become increasingly common during the coming decades. The pathogenic plastic changes in the CNS and immune system caused by long-term stress pose severe burdens to individuals, organizations as well as society in general. Thus, stress management may be essential to maintain and improve long-term health and wellbeing and to proactively counteract stress-related ill-health. This thesis is based on four papers: Paper I assessed the effects of massage as compared to relaxation tapes in long-term pain patients. Paper II validated some of the Visual Analogue Scale questions that were to be used in paper III and IV. Paper III assessed the effects on mental and physical wellbeing and biological stress markers from a web-based stress management and health promotion tool. Paper IV aimed at mapping out predictors for trends (improvement vs. worsening) in self-rated health (SRH) over a period of one year. The overall results indicate that individually focused stress management interventions in long-term pain patients as well as on a healthy, working population may have short-term beneficial effects on psychological and physiological stress, health and wellbeing. On a long-term basis the beneficial changes seem to revert. In paper four, it is indicated that the stress management intervention is not a significant predictor of long-term changes in SRH. Rather, other factors such as health perception, sleep quality and sense of coherence predicted improvement in SRH over time.

Die Behandlung von Fettleibigkeit mittels Ernährungsumstellung und Änderung des Lebensstils zeigt keinen großen Erfolg bei der Eindämmung der Adipositas-Epidemie. Weitere Untersuchungen von Adipositas und der damit verbundenen Prozesse eröffnen die Möglichkeit, die Pathophysiologie der Fettleibigkeit besser zu verstehen und so neue therapeutische Ansätze und neue metabolische Regulatoren entwickeln zu können. Da Adipositas eine metabolische Erkrankung ist, wurde in dieser Arbeit untersucht, ob und wie sich die Veränderungen, die mit Adipositas assoziiert sind und während dieser Erkrankung nicht nur im Fettgewebe, sondern in dem gesamten Organismus entstehen, auf den Metabolismus der Monozyten und auf ihre Funktionen auswirken. Mit den beschriebenen Methoden wurden Unterschiede im Metabolismus und in der ROS-Produktion zwischen den Monozyten von normalgewichtigen Kontrollen und Adipositas-Patienten nachgewiesen, während sich die anderen untersuchten Zellfunktionen, wie Phagozytose und Zytokinproduktion (angesehen von IL-8) nicht voneinander unterschieden. Die Resultate zeigten, dass Adipositas und die damit einhergehende chronische Entzündung zu einer Veränderung des Metabolismus der peripheren Monozyten führt. In Monozyten von Adipositas-Patienten konnten ein verändertes Proteinexpressionsmuster, eine erhöhte Glykolyse und ATP-Produktion sowie daraus resultierend eine gesteigerte Bildung von Lipidtropfen festgestellt werden. Abgesehen von Hexokinase I zeigten die Monozyten von Adipositas-Patienten eine niedrige Proteinexpression der glykolytischen Enzyme und der Enzyme des Pentosephosphatweges sowie des Citratzyklus und sie erreichten trotzdem eine hohe Konzentration von intrazellulären Metaboliten des zentralen Kohlenhydratstoffwechsel und eine erhöhte Glykolyse, was sicherlich auf das erhöhte Glukose-Angebot zurückzuführen ist. Der verstärkte Pentosephosphatweg steigert die NADPH-Konzentration, die mit Diabetes assoziiert ist und zur Zunahme der Fettsäuresynthese und der ROS-Produktion führen kann. Die exzessive Lipidakkumulation ist ein mit der Fettleibigkeit assoziiertes Merkmal, welches nicht nur im Fettgewebe, sondern auch in nicht-adipösen Geweben beobachtet wird. Die erhöhte Lipidtropfenanzahl, die in Monozyten von Adipositas-Patienten nachgewiesen wurde, kann zu dem aus einer verstärkten Fettsäuresynthese resultieren, die vor allem dann aktiviert wird, wenn der Zelle genügend Energie und Kohlenhydrate zur Verfügung stehen. Diese Fettsäurereserven werden dann von Zellen unter glukosearmen Bedingungen für die Energiegewinnung verwendet. In aktivierten Monozyten von Adipositas-Patienten konnte unter glukosearmen Bedingungen trotz des verringerten Kohlenhydratstoffwechsels eine erhöhte ATP-Produktion im Vergleich zu den gesunden, normalgewichtigen Kontrollen nachgewiesen werden, was darauf schließen lässt, dass vorhandene Lipidtropfen für die Energiegewinnung verwendet wurden. Die bei Adipositas-Patienten beobachteten metabolischen Veränderungen in den Energiegewinnungsprozessen bzw. Stoffwechselprozessen zeigten keine Wirkung auf die funktionellen Fähigkeiten der Monozyten wie phagozytische Aktivität oder auf die Zellviabilität. Ein funktioneller Unterschied wurde lediglich im oxidativen Burst bzw. in der Produktion von ROS, die als Signalmoleküle wirken, detektiert. Da Adipositas mit erhöhten Entzündungswerten sowie gesteigerter Produktion von proinflammatorischen Zytokinen assoziiert ist, wurde vermutet, dass Monozyten von Adipositas-Patienten eine veränderte Zytokinfreisetzung im Vergleich zu gesunden, normalgewichtigen Kontrollen aufweisen. Dies konnte in Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht bestätigt werden. Da im adipösen Fettgewebe die meisten proinflammatorischen Zytokinen produziert werden, könnte sich die weitere Forschung auf anderen Immunzellen wie T-Zellen oder M1-Makrophagen, die einen großen Anteil aller Immunzellen des Fettgewebes ausmachen, fokussieren, um den Effekt von Immunzellen auf den Verlauf der Fettleibigkeit sowie die immunmetabolischen und funktionellen Veränderungen dieser Zellen infolge der chronischen Entzündung gezielter zu untersuchen. Dazu könnten Monozyten vor ihrer Differenzierung zu Makrophagen oder dendritischen Zellen aus dem Fettgewebe isoliert und näher untersucht werden, um immunmetabolische Veränderungen im Vergleich zu primären Monozyten aufzudecken. Die durch diese Arbeit gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass die metabolische sowie chronische Erkrankung Adipositas beträchtliche Auswirkungen auf Immunzellen und eine Bedeutung für ihren Immunmetabolismus sowie für die angeborene und adaptive Immunität hat. Der Immunmetabolismus, der eine aktive Rolle bei der Entwicklung und Funktion der Immunzellen sowie bei der Regulierung der Immunantwort spielt, stellt einen wichtigen Aspekt der pathologischen Veränderungen bei dieser Erkrankung dar. Durch therapeutische Regulierung des Immunmetabolismus könnten proinflammatorische Effektormechanismen des Immunsystems, welche zum Pathomechanismus der Adipositas beitragen, besser kontrolliert werden. Ein Beispiel dafür ist die signifikant erhöhte TNF-α-Produktion bei einem reduzierenden Kohlenhydratstoffwechsel unter glukosearmen Bedingungen. Die Resultate zeigen auch, dass die Energiegewinnungs- und Stoffwechselprozesse als therapeutische Targets bei Adipositas darstellen können. Ein Beispiel könnte die Regulierung der erhöhten Glykolyse, ATP-Synthese und ROS-Produktion durch die Inhibierung des zentralen Kohlenhydratstoffwechsels sein, wodurch die Aktivierung der proinflammatorischen M1-Makrophagen und das Fortschreiten des Diabetes bei Adipositas, günstig beeinflusst werden könnten. Außerdem könnten sich zukünftige Experimente auf die Fettsäuresynthese und der Lipidakkumulation in den Lipidtropfen fokussieren, die mit einer erhöhten Lagerung von Entzündungsmediatoren, erhöhten Infektionsrate und somit auch erhöhter Mortalität verbunden sind.:INHALTSVERZEICHNIS Abbildungsverzeichnis………………………………………………………………………. i Tabellenverzeichnis…………………………………………………………………………vii Abkürzungsverzeichnis………………………………………………………………........viii 1. EINLEITUNG 1 1.1. Adipositas – eine chronische Erkrankung 1 1.2. Das adipöse Fettgewebe und das Immunsystem 3 1.3. Monozyten 5 1.3.1. Monozyten – „Schlüsselakteure“ der angeborenen Immunität 5 1.3.2. Aktivierung von Monozyten während Entzündungsprozessen 6 1.4. Das NLRP3-Inflammasom 8 1.5. Immunmetabolismus und metabolische Veränderungen in aktivierten Immunzellen 9 1.6. Zielstellung 12 2. MATERIAL UND METHODEN 14 2.1. Materialien 14 2.2. Methoden 22 2.2.1. Spender und Adipositas-Patienten 22 2.2.2. Isolierung von mononukleären Zellen (PBMCs) aus dem peripheren Blut mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation 22 2.2.3. Bestimmung der Zellzahl 23 2.2.4. Negative Separation von Monozyten über magnetische MACS-Separation 24 2.2.5. Zelllyse 25 2.2.6. Proteinbestimmung 25 2.2.7. Proteomik 26 2.2.9. Seahorse-Analyse der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung 31 2.2.10. Bestimmung intrazellulärer polarer Metaboliten mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) 35 2.2.11. Bestimmung der extrazellulären Glukose- und Laktatkonzentration mittels Blutgasanalysator 37 2.2.12. Bestimmung des intrazellulären ATP- und AMP-Gehalts 38 2.2.13. Bestimmung der intrazellulären NADH- und NADPH-Konzentration 39 2.2.14. Lipidtropfenbestimmung und Untersuchung der Phagozytose mittels ImageStream 40 2.2.15. Durchflusszytometrische Analyse der Latexbeads-Phagozytose und der Zellvitalität 42 2.2.16. Nachweis des oxidativen Bursts mittels Luminol 43 2.2.17. Zytokinbestimmung mittels ELISA 44 2.2.18. Statistische Auswertung und Software zur Datenanalyse 45 3. ERGEBNISSE 46 3.1. Verändertes Proteinexpressionsmuster in Monozyten von adipösen und übergewichtigen Probanden 46 3.1.1. Glykolyse und Pentosephosphatweg 49 3.1.2. Oxidative Phosphorylierung, Citratzyklus, ß-Oxidation 51 3.1.3. Weitere Signalwege und Stoffwechselprozesse 55 3.1.4. Untersuchung des Expressionsmusters von Hexokinase I und Hexokinase II mittels Western Blot 57 3.2. Veränderter Metabolismus der Monozyten von Adipositas-Patienten: Veränderung in den Energiegewinnungsprozessen 60 3.2.1. Erhöhte glykolytische und veränderte mitochondriale Aktivität der Monozyten von Adipositas-Patienten 61 3.2.2. Erhöhung der intrazellulären Metaboliten des zentralen Kohlenhydratstoffmetabolismus in Monozyten von Adipositas-Patienten 67 3.2.3. Keine Unterschiede in der extrazellulären Glukose- und Laktatkonzentration…. 74 3.2.4. Monozyten von Adipositas-Patienten zeigten erhöhten ATP-Gehalt bzw. niedriges AMP/ATP-Verhältnis 76 3.2.5. Veränderter NADH- und NADPH-Gehalt in Monozyten von Adipositas-Patienten 77 3.2.6. Steigende Lipidtropfenbildung in Monozyten von Adipositas-Patienten 80 3.3. Funktionelle Veränderungen der Monozyten von Adipositas-Patienten 84 3.3.1. Unveränderte phagozytische Aktivität der Monozyten von Adipositas-Patienten… 84 3.3.2. Erhöhter oxidativer Burst als Reaktion auf LPS bei Monozyten von Adipositas-Patienten 88 3.3.3. Freisetzung von Zytokinen unter glukosearmen und glukosereichen Bedingungen 90 3.3.4. Kein Unterschied in der Zellvitalität zwischen Monozyten von normalgewichtigen Kontrollen und Adipositas-Patienten 93 4. DISKUSSION 96 4.1. Verändertes Proteinexpressionsmuster in Monozyten von Adipositas-Patienten im Vergleich zu denen von gesunden, normalgewichtigen Kontrollen 97 4.1.1. Glykolytische Enzyme und andere Stoffwechsel-Enzyme 98 4.1.2. Hexokinase I spielt eine zentrale Rolle in Monozyten von Adipositas-Patienten 99 4.1.3. Histonexpression und -modifikation 100 4.1.4. mTOR-Signalweg 101 4.1.5. Immunologisch relevante Proteine 101 4.2. Veränderter Metabolismus in Monozyten von Adipositas-Patienten 102 4.2.1. Monozyten von Adipositas-Patienten weisen eine verstärkte Glykolyse und veränderte oxidative Phosphorylierung auf 103 4.2.2. ATP-Produktion 107 4.2.3. Konzentrationserhöhung der intrazellulären Metaboliten des zentralen Kohlenhydratstoffwechsels in Monozyten von Adipositas-Patienten 108 4.2.4. NADH- und NADPH-Konzentration 111 4.2.5. Lipidtropfen (LD) – ein relevanter Unterschied zwischen Monozyten von Adipositas-Patienten und normalgewichtigen Kontrollen 113 4.3 Funktionelle Veränderungen in Monozyten von Adipositas-Patienten 117 4.3.1. Phagozytose 117 4.3.2. Oxidativer Burst 117 4.3.3. Zytokinproduktion 119 4.3.4. Zellvitalität 121 4.4. Fazit 122 5. ZUSAMMENFASSUNG 125 6. LITERATURVERZEICHNIS 134 7. ANHANG 163 SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG I DANKSAGUNG II

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Recent studies have shown elevated neuroinflammation in a large subset of individuals diagnosed with schizophrenia. A pro-inflammatory cytokine, tumor necrosis factor-alpha (TNFα), has been directly linked to this neuroinflammation. This study examined the effects of two TNFα modulators (PD2024 and PD340) produced by our collaborators at P2D Bioscience, Inc., to alleviate auditory sensorimotor gating deficits and reduce microglial cell activation present in the polyinosinic:polycytidylic (Poly I:C) rodent model of schizophrenia. Auditory sensorimotor gating was assessed using prepulse inhibition and microglial activation was examined and quantified using immunohistochemistry and confocal microscopy, respectively. Both PD2024 and PD340 alleviated auditory sensorimotor gating deficits and reduced microglia activation and thereby demonstrated the ability to treat both the behavioral and neuroinflammatory aspects of the disorder. These results are significant and suggest that neural TNFα is a potential pharmacological target for the treatment of schizophrenia.

Obesity accounts for $168 billion in annual medical expenses and increases the risk of cardiovascular disease, cancer, and type-2 diabetes, three diseases responsible for over 50% of deaths in the United States. It is well established that the pattern of adiposity is an important factor in the relationship with disease risk and that visceral adiposity, which favors hypertrophy (characterized by enlarged cells) is more dangerous than subcutaneous adiposity, which tends to be hyperplastic (characterized by an increase in cell number). Hypertrophy is associated with inflammation and insulin resistance, and hyperplasia (adipogenesis, i.e., the formation of new adipocytes), is associated with improved insulin sensitivity. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) is a potent pro-inflammatory cytokine that activates a nuclear factor-kappa B (NFKB) intracellular pathway that is an important mediator of obesity-associated insulin resistance and increased risk of type-2 diabetes. Interestingly, obesity has been positively associated with both low vitamin D status and elevated levels of TNF-alpha. Our studies focused on examining the influence of the active vitamin D hormone, 1,25-dihydroxyvitamin D, and TNF-alpha on adipogenesis and inflammation in human primary adipocytes and determining whether the balance of these two factors influences the extent to which adipocytes accumulate lipid or express pro-inflammatory cytokines. We found no effect of 1,25-dihydroxyvitamin D on adipogenesis or pro-adipogenic gene expression despite a clear upregulation of a vitamin D responsive gene, 24-hydroxylase, in response to treatment with 1,25-dihydroxyvitamin D. TNF-alpha clearly inhibited adipogenesis and expression of PPAR-gamma and C/EBP-alpha and enhanced expression of the pro-inflammatory cytokines IL-6 and MCP-1, but not IL-8. There was a trend towards a dose-dependent downregulation of MCP-1 by 1,25-dihydroxyvitamin D in three individuals; however, this effect was not statistically significant. While we found no interaction between TNF-alpha and 1,25-dihydroxyvitamin D on adipogenesis, there is a potential anti-inflammatory action of 1,25-dihydroxyvitamin D in human primary adipocytes. Future studies into this potential are warranted in light of the growing obesity epidemic and the interest in finding nutritionally modifiable treatment or prevention strategies to mitigate the negative consequences of obesity.

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Ungefähr 1% der Bevölkerung der westlichen Welt leidet an rheumatoider Arthritis (RA). In einem T-Zellrezeptor transgenen Mausmodell, dem K/BxN Modell, wird die ubiquitär exprimierte Glukose-6-phosphat Isomerase (G6PI) von autoreaktiven T- und B-Zellen erkannt. Diese Mäuse entwickeln spontan eine antikörpervermittelte Arthritis, die viele Gemeinsamkeiten mit der humanen RA aufweist. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Immunisierung mit G6PI eine Arthritis auch in nicht-transgenen Mäuse induzieren kann. Die Immunisierung mit heterologer humaner G6PI führte zur Entwicklung einer peripheren symmetrischen Polyarthritis in über 95% der DBA/1 Mäuse. Damit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass eine Immunreaktion gegen ein systemisches exprimiertes Antigen zur einer organspezifischen Erkrankung in normalen nicht-transgenen Mäusen führt. Die Tiere entwickeln nach 9 Tagen eine Arthritis, die bis Tag 15 ihr Maximum erreicht hat und dann langsam abnimmt. Histologisch ist die Arthritis durch eine frühe Synovitis charakterisiert, gefolgt von massiven Erosionen des Knorpel und Knochens und anschließenden Reparaturprozessen, inklusive Fibrose. Obwohl die Tiere hohe Antikörpertiter entwickeln, kann die Arthritis nicht durch aufgereinigte Antikörper kranker Mäuse transferiert werden. Trotzdem spielen Antikörper eine große Rolle, da FcR-gamma-Kette defiziente Mäuse eine Arthritis mit geringer Inzidenz und mildem Verlauf entwickeln. Die Depletion der CD4 positiven Zellen verhindert die Entwicklung der Arthritis völlig, und eine Depletion während der Erkrankung führt zur schnellen Heilung. Daneben ist für die Entwicklung der Arthritis auch das Komplementsystem und TNF-alpha entscheidend, was durch Depletion von C5 bzw. durch Blockade von TNF-alpha gezeigt wurde. Zusätzlich wurde die Rolle der G6PI bei der Pathogenese der RA im Menschen untersucht. RA-Patienten zeigten keine erhöhte Frequenz von CD4 positiven T-Zellen, die nach Restimulation mit G6PI TNF-alpha oder IFN-gamma produzierten. Außerdem konnten keine erhöhten anti-G6PI Titer in Patienten mit RA oder anderen rheumatischen Erkrankungen detektiert werden. / About 1% of the of the population of the western world suffers from rheumatoid arthritis (RA). In a T-cell receptor transgenic mouse model, the K/BxN model, the ubiquitously expressed glucose-6-phosphate isomerase (G6PI) is recognized by autoreactive T- and B-cells. These mice do develop an antibody dependent arthritis which show a lot of features of human RA. In this study it was examined whether arthritis could be induced in normal non-transgenic mice by immunization with G6PI. Immunization with heterologous human G6PI induces a symmetric polyarthritis in over 95% of DBA/1 mice. Therewith showing for the first time that an immune reaction against an systemic expressed antigen will lead to the development of an organ specific disease in normal non-transgenic mice. The mice develop arthritis 9d after immunization, reach their maximum at d15 and then arthritis slowly resolve. Histologically, the disease is characterized by early synovitis followed by massive cartilage destruction and erosions of the bones and later repair processes including fibrosis. Although antibody titers in the mice are high, transfer of purified anti-G6PI antibodies of sick mice alone do not transfer disease. Anyway, antibodies seem to play a major role since FcR-gamma-chain deficient mice develop disease with a much lower frequency and reduced severity. Depletion of CD4 positive T cells completely prevents disease and depletion during disease leads to an rapid resolution of arthritis. Aside this, complement and TNF-alpha is critical for the development of arthritis, which could shown by depletion of C5 and blockade of TNF-alpha. In addition, the role of G6PI in the pathogenesis of RA in humans was examined. RA patients do not show a higher frequency of CD4 positive T-cells which produce TNF-alpha and IFN-gamma after restimulation with G6PI. Furthermore, no elevated anti-G6PI titers could be detected in RA patients and in patients with other rheumatic diseases.