Os hormônios peptídicos Angiotensina II (Ang II) e bradicinina (BK) ativam transdução de sinal através da ligação a Receptores Acoplados a Proteínas G (GPCR). Este trabalho propõe o estudo de propriedades conformacionais, através de espectroscopia de fluorescência da Ang II e BK e de seus análogos contendo o marcador de spin ácido 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil-4-amino-4-carboxílico, TOAC (TOAC1-Ang II, TOAC3-Ang II, TOAC0-BK, TOAC3-BK). Os peptídeos foram estudados em solução (efeito do pH) e também na presença de membranas modelo, micelas e bicamadas, formadas por anfifílicos zwitteriônicos ou aniônicos. Foi monitorada a fluorescência intrínseca dos resíduos aromáticos (Tyr4 na Ang II e Phe5 e Phe8 na BK). O efeito de supressão da fluorescência pelo TOAC foi utilizado para obter informação sobre a proximidade desse resíduo aos grupos fluoróforos. Foi observada dependência da fluorescência com o pH e regiões de pKs dos grupamentos ionizáveis. Os espectros evidenciaram também a interação peptídeo-membrana modelo. Interações mais fortes ocorreram entre os peptídeos e membranas com carga superficial negativa, evidenciando a importância de interações eletrostáticas para a ligação. Porém, interações hidrofóbicas também estão envolvidas, como verificado pela ligação dos peptídeos a membranas zwitteriônicas. Estudos com variação de pH também mostraram o papel dessa variável na interação peptídeo-membrana e a alteração de pKs de resíduos ionizáveis decorrentes da interação. A titulação com concentrações crescentes de membranas permitiu o cálculo das constantes de associação. A ligação a membranas é função da conformação dos peptídeos. Em particular, a presença de TOAC na posição 3 parece diminuir a afinidade desses análogos por membranas. Supressão de fluorescência foi efetuada empregando três diferentes abordagens: 1) supressão pela molécula aquossolúvel acrilamida, 2) supressão da fluorescência de fosfolipídeos contendo o fluoróforo NBD em diferentes posições da molécula pelos análogos marcados com TOAC, 3) supressão da fluorescência dos peptídeos por ésteres metílicos do ácido esteárico contendo o grupamento nitróxido em diferentes posições da cadeia. Esses estudos permitiram determinar a localização dos peptídeos na interface água-membrana. Medidas de anisotropia de fluorescência também evidenciaram a ligação dos peptídeos a membranas, revelando maior imobilidade dos mesmos nessas condições. Foi ainda estudado um peptídeo que contém os resíduos 92-100 (fEL1) do receptor AT1 de Ang II humano. Predições baseadas na estrutura cristalina da rodopsina estimam que essa seqüência localiza-se na primeira alça extra-celular do receptor. A seqüência contém a Tyr92, considerada um resíduo importante para a ligação hormônio-receptor. Resultados preliminares sugeriram que fEL1 interage com Ang II e TOAC1-Ang II, mas não com TOAC3-Ang II. Este último resultado provavelmente deve-se à dobra causada por TOAC que restringe a liberdade de movimento do esqueleto peptídico. Essa característica provavelmente determina a falta de atividade biológica de TOAC3-Ang II e TOAC3-BK, enquanto os análogos marcados no N-terminal retém atividade parcial (Nakaie et al., 2002). Tem sido proposto que peptídeos ligantes de GPCR se ligariam à bicamada lipídica e atingiriam seu receptor através da difusão pela bicamada. Em solução aquosa essas moléculas são flexíveis, existindo um equilíbrio dinâmico entre várias conformações. A ligação à bicamada lipídica estabilizaria uma ou algumas conformações, entre elas aquela que o ligante adota ao ligar-se ao receptor. O presente estudo contribui para a compreensão, a nível molecular, do processo de interação entre os hormônios peptídicos e membranas lipídicas. / The peptide hormones Angiotensin II (Ang II) and bradykinin (BK) trigger signal transduction by binding to G Protein Coupled Receptors (GPCR). This work proposes the study of conformational properties of Ang II and BK, as well as their analogues containing the spin label 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl-4-amino-4-carboxylic acid, TOAC (TOAC1-Ang II, TOAC3-Ang II, TOAC0-BK, TOAC3-BK) making use of fluorescence spectroscopy. Studies were performed in solution (effect of pH) and also of the interaction between the peptides and model membranes - micelles and bilayers - formed by amphiphiles, either zwitterionic or negatively charged. The intrinsic fluorescence of aromatic residues (Tyr4 in Ang II and Phe5 and Phe8 in BK) was monitored. Fluorescence quenching by the TOAC-carrying analogues provided information about the proximity between TOAC and the fluorophores. The fluorescence was pH-dependent and evinced regions corresponding to pKs of ionizable groups. Peptide-model membrane interactions were also examined. Stronger interactions were detected between the peptides and membranes formed by negatively charged amphiphiles, pointing to the importance of electrostatic interactions for binding. However, hydrophobic interactions were also involved, as suggested by the fact that the peptides also bound to zwitterionic membranes. Variable pH studies showed the effect of this parameter on peptide-membrane interaction. The peptide-membrane interactions promoted changes in the pKs of ionizable residues. Titrations with increasing membrane concentrations allowed calculation of binding constants. Binding to membranes is a function of peptide conformation. In particular, TOAC at position 3 seems to decrease the affinity of both Ang II and BK for membranes. Fluorescence quenching studies made use of three different approaches: 1) quenching by water soluble acrylamide, 2) quenching of the fluorescence of phospholipids carrying the fluorescent group NBD in different positions by the spin-labeled TOAC-bearing analogues, 3) quenching of the peptides fluorescence by methyl esters of stearic acid containing the nitroxide moiety at different positions in the acyl chain. These studies indicated that the peptides are located at the water-membrane interface. Measurements of fluorescence anisotropy also evinced binding of the peptides to the membranes and showed that the peptides undergo more restricted motion under these conditions. A peptide containing residues 92-100 (fEL1) of the Ang II AT1 human receptor was also studied. Predictions based on rhodopsin crystalline structure estimate that this sequence is located in the receptor´s first extra-cellular loop. Preliminary results suggest that fEL1 interacts with Ang II and TOAC1-Ang II, but not TOAC3-Ang II. This latter result is probably due to the TOAC-induced bend that restricts the freedom of motion of the peptide backbone. This feature is probably the cause of lack of biological activity of TOAC3-Ang II and TOAC3-BK, while the N-terminally labeled analogues retain partial activity (Nakaie et al., 2002). GPCR-binding peptides have been proposed to bind to the lipid bilayer and reach their receptors by diffusion in the bilayer. In aqueous solution these molecules exist as a dynamic equilibrium between various flexible conformations, among them, the receptor-bound conformation. The present study provides contributions for the understanding, at the molecular level, of the interaction between the peptide hormones and lipid membranes.

Os hormônios peptídicos Angiotensina II (Ang II) e bradicinina (BK) ativam transdução de sinal através da ligação a Receptores Acoplados a Proteínas G (GPCR). Este trabalho propõe o estudo de propriedades conformacionais, através de espectroscopia de fluorescência da Ang II e BK e de seus análogos contendo o marcador de spin ácido 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil-4-amino-4-carboxílico, TOAC (TOAC1-Ang II, TOAC3-Ang II, TOAC0-BK, TOAC3-BK). Os peptídeos foram estudados em solução (efeito do pH) e também na presença de membranas modelo, micelas e bicamadas, formadas por anfifílicos zwitteriônicos ou aniônicos. Foi monitorada a fluorescência intrínseca dos resíduos aromáticos (Tyr4 na Ang II e Phe5 e Phe8 na BK). O efeito de supressão da fluorescência pelo TOAC foi utilizado para obter informação sobre a proximidade desse resíduo aos grupos fluoróforos. Foi observada dependência da fluorescência com o pH e regiões de pKs dos grupamentos ionizáveis. Os espectros evidenciaram também a interação peptídeo-membrana modelo. Interações mais fortes ocorreram entre os peptídeos e membranas com carga superficial negativa, evidenciando a importância de interações eletrostáticas para a ligação. Porém, interações hidrofóbicas também estão envolvidas, como verificado pela ligação dos peptídeos a membranas zwitteriônicas. Estudos com variação de pH também mostraram o papel dessa variável na interação peptídeo-membrana e a alteração de pKs de resíduos ionizáveis decorrentes da interação. A titulação com concentrações crescentes de membranas permitiu o cálculo das constantes de associação. A ligação a membranas é função da conformação dos peptídeos. Em particular, a presença de TOAC na posição 3 parece diminuir a afinidade desses análogos por membranas. Supressão de fluorescência foi efetuada empregando três diferentes abordagens: 1) supressão pela molécula aquossolúvel acrilamida, 2) supressão da fluorescência de fosfolipídeos contendo o fluoróforo NBD em diferentes posições da molécula pelos análogos marcados com TOAC, 3) supressão da fluorescência dos peptídeos por ésteres metílicos do ácido esteárico contendo o grupamento nitróxido em diferentes posições da cadeia. Esses estudos permitiram determinar a localização dos peptídeos na interface água-membrana. Medidas de anisotropia de fluorescência também evidenciaram a ligação dos peptídeos a membranas, revelando maior imobilidade dos mesmos nessas condições. Foi ainda estudado um peptídeo que contém os resíduos 92-100 (fEL1) do receptor AT1 de Ang II humano. Predições baseadas na estrutura cristalina da rodopsina estimam que essa seqüência localiza-se na primeira alça extra-celular do receptor. A seqüência contém a Tyr92, considerada um resíduo importante para a ligação hormônio-receptor. Resultados preliminares sugeriram que fEL1 interage com Ang II e TOAC1-Ang II, mas não com TOAC3-Ang II. Este último resultado provavelmente deve-se à dobra causada por TOAC que restringe a liberdade de movimento do esqueleto peptídico. Essa característica provavelmente determina a falta de atividade biológica de TOAC3-Ang II e TOAC3-BK, enquanto os análogos marcados no N-terminal retém atividade parcial (Nakaie et al., 2002). Tem sido proposto que peptídeos ligantes de GPCR se ligariam à bicamada lipídica e atingiriam seu receptor através da difusão pela bicamada. Em solução aquosa essas moléculas são flexíveis, existindo um equilíbrio dinâmico entre várias conformações. A ligação à bicamada lipídica estabilizaria uma ou algumas conformações, entre elas aquela que o ligante adota ao ligar-se ao receptor. O presente estudo contribui para a compreensão, a nível molecular, do processo de interação entre os hormônios peptídicos e membranas lipídicas. / The peptide hormones Angiotensin II (Ang II) and bradykinin (BK) trigger signal transduction by binding to G Protein Coupled Receptors (GPCR). This work proposes the study of conformational properties of Ang II and BK, as well as their analogues containing the spin label 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl-4-amino-4-carboxylic acid, TOAC (TOAC1-Ang II, TOAC3-Ang II, TOAC0-BK, TOAC3-BK) making use of fluorescence spectroscopy. Studies were performed in solution (effect of pH) and also of the interaction between the peptides and model membranes - micelles and bilayers - formed by amphiphiles, either zwitterionic or negatively charged. The intrinsic fluorescence of aromatic residues (Tyr4 in Ang II and Phe5 and Phe8 in BK) was monitored. Fluorescence quenching by the TOAC-carrying analogues provided information about the proximity between TOAC and the fluorophores. The fluorescence was pH-dependent and evinced regions corresponding to pKs of ionizable groups. Peptide-model membrane interactions were also examined. Stronger interactions were detected between the peptides and membranes formed by negatively charged amphiphiles, pointing to the importance of electrostatic interactions for binding. However, hydrophobic interactions were also involved, as suggested by the fact that the peptides also bound to zwitterionic membranes. Variable pH studies showed the effect of this parameter on peptide-membrane interaction. The peptide-membrane interactions promoted changes in the pKs of ionizable residues. Titrations with increasing membrane concentrations allowed calculation of binding constants. Binding to membranes is a function of peptide conformation. In particular, TOAC at position 3 seems to decrease the affinity of both Ang II and BK for membranes. Fluorescence quenching studies made use of three different approaches: 1) quenching by water soluble acrylamide, 2) quenching of the fluorescence of phospholipids carrying the fluorescent group NBD in different positions by the spin-labeled TOAC-bearing analogues, 3) quenching of the peptides fluorescence by methyl esters of stearic acid containing the nitroxide moiety at different positions in the acyl chain. These studies indicated that the peptides are located at the water-membrane interface. Measurements of fluorescence anisotropy also evinced binding of the peptides to the membranes and showed that the peptides undergo more restricted motion under these conditions. A peptide containing residues 92-100 (fEL1) of the Ang II AT1 human receptor was also studied. Predictions based on rhodopsin crystalline structure estimate that this sequence is located in the receptor´s first extra-cellular loop. Preliminary results suggest that fEL1 interacts with Ang II and TOAC1-Ang II, but not TOAC3-Ang II. This latter result is probably due to the TOAC-induced bend that restricts the freedom of motion of the peptide backbone. This feature is probably the cause of lack of biological activity of TOAC3-Ang II and TOAC3-BK, while the N-terminally labeled analogues retain partial activity (Nakaie et al., 2002). GPCR-binding peptides have been proposed to bind to the lipid bilayer and reach their receptors by diffusion in the bilayer. In aqueous solution these molecules exist as a dynamic equilibrium between various flexible conformations, among them, the receptor-bound conformation. The present study provides contributions for the understanding, at the molecular level, of the interaction between the peptide hormones and lipid membranes.

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O mecanismo de ação da Histatina-5 (Hst-5), um peptídeo antimicrobiano da saliva humana com ação fungicida, não está esclarecido. Dicroísmo circular (CD), fluorescência e ressonância paramagnética eletrônica (RPE) foram empregados para examinar as propriedades conformacionais de Hst-5 e seu análogo contendo o aminoácido paramagnético TOAC N-terminal (TOAC0-Hst-5) em solução aquosa, em função do pH, de TFE, e de íons metálicos, e em presença de membranas modelo de composição. Foi examinada a atividade dos dois peptídeos em membranas lipídicas planas, na permeabilização de membranas modelo e frente o fungo Candida albicans e eritrócitos humanos, com o objetivo de estabelecer correlações entre a atividade e a estrutura dos peptídeos. Estudos de fluorescência mostraram a capacidade de TOAC de suprimir a fluorescência e que o pK dos resíduos de Tyr foram deslocados. Espectros de CD mostraram pequenas flutuações conformacionais, mas foram mantidas estruturas ao acaso. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 mostraram a coexistência de duas populações, protonada e desprotonada, em troca lenta. A partir de medidas de desdobramento hiperfino (aN), foram calculados pKs de TOAC; a relação de altura dos picos de campo central e alto também foi sensível à titulação do peptídeo. Em TFE os peptídeos adotaram conformação α-helicoidal (CD). Espectros de fluorescência de Hst-5 mostraram aumento da fluorescência, e os de TOAC0-Hst-5 mostraram supressão, indicando aproximação de TOAC dos resíduos de Tyr. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 também refletiram as mudanças conformacionais. Estudos de fluorescência mostraram a interação de Hst-5 e TOAC0-Hst-5 com Cu2+, Mn2+ e Zn2+, permitindo o cálculo de constantes de ligação. Espectros de CD refletiram pequenas variações conformacionais, sem aquisição de estrutura secundária. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 na presença dos íons paramagnéticos Cu2+ e Mn2+ indicaram interações spin-spin, permitindo o cálculo das distâncias metal-nitróxido. Curvas de tempo de correlação rotacional em função da concentração dos íons permitiram calcular constantes de ligação da mesma ordem de grandeza daquelas obtidas por fluorescência. Hst-5 e TOAC0-Hst-5 ligaram-se em maior extensão a micelas negativas do que a zwitteriônicas num processo pH-dependente. Estudos de supressão de fluorescência por acrilamida confirmaram esses resultados, indicando a modulação por interações eletrostáticas. Espectros de CD mostraram que os peptídeos adotam conformação em dobra β tipo I. Estudos de RPE da interação de TOAC0-Hst-5 com vesículas de composição lipídica mimetizando membranas de E. coli e C. albicans (carga líquida negativa) e eritrócitos (carga líquida zero) confirmaram essa modulaçao. Na presença das membranas negativamente carregadas os espectros apresentaram extremos externos e internos, indicando que o eixo z do nitróxido orienta-se paralelamente à normal à bicamada. Estudos funcionais utilizando bicamadas lipídicas planas mostraram que TOAC0-Hst-5, mas não Hst-5, forma poros. Também, TOAC0-Hst-5, mas não Hst-5, permeabiliza vesículas carregadas negativamente. Ainda, a atividade fungicida de TOAC0-Hst-5 foi maior do que a de Hst-5 na ausência de íons, porém foi a mesma na presença de Mn2+ e Zn2+. Finalmente, TOAC0-Hst-5 mostrou maior atividade hemolítica que Hst-5. Esses resultados sugerem uma possível diferença nos mecanismos de ação de Hst-5 e seu análogo marcado, apesar da semelhança no comportamento conformacional dos peptídeos. / The mechanism of action of histatin-5 (Hst-5), an antifungal antimicrobial peptide from human saliva is not completely clarified. Circular dichroism (CD), fluorescence, and electron paramagnetic resonance (EPR) were used to examine the conformational behavior of Hst-5 and its analogue containing the paramagnetic amino acid TOAC at the N-terminus (TOAC0-Hst-5). Conformational properties were investigated in aqueous solution, as a function of pH, TFE, and addition of metal ions, and in the presence of model membranes of variable lipid composition. The activity of both peptides was examined in planar lipid membranes and with regard to permeabilization of model membranes. Activity was also tested towards the fungus Candida albicans and human erythrocytes, with the scope of establishing structure-function correlations. Fluorescence studies showed that TOAC0-Hst-5 is able to quench the peptide fluorescence and that the pK of the Tyr residues was shifted to lower values. CD spectra indicated that small conformational fluctuations occurred with increasing pH, but the overall unordered structure of the peptides was kept. EPR spectra of TOAC0-Hst-5 showed the coexistence of two populations, one protonated and one unprotonated, in slow exchange. The pK of TOAC was calculated from measurements of the isotropic hyperfine splitting (aN); the ratios of heights of the mid-field line and the high-field line were also sensitive to the peptide titration. In TFE, the peptides acquired -helical conformation (CD). Fluorescence spectra of Hst-5 showed an increase of fluorescence, while those of TOAC0-Hst-5 revealed quenching, indicating that, on the average, the TOAC residue becomes closer to the Tyr residues as a consequence of the peptide acquiring α-helical conformation. EPR spectra also reflected the conformational changes undergone by the peptide. Fluorescence studies indicated that Hst-5 and its spin labeled analogue interacted with Cu2+, Zn2+, and Mn2+ ions, allowing the calculation of binding constants. CD spectra reflected the occurrence of small conformational fluctuations, without acquisition of stable secondary structure. EPR spectra of TOAC0-Hst-5 in the presence of the paramagnetic ions Cu2+ and Mn2+ evinced the occurrence of spin-spin interactions, allowing the calculation of metal-nitroxide distances. Curves of rotational correlation times as a function of ion concentration yielded values for the binding constants of the same order of magnitude as those calculated from fluorescence measurements. Hst-5 and TOAC0-Hst-5 bound to a larger extent to negatively charged than to zwitterionic micelles, in a pH-dependent process. Studies of fluorescence quenching by water soluble acrylamide confirmed these results, pointing to the fact that binding is largely modulated by electrostatic interactions. CD spectra indicated that, upon binding to micelles, the peptides acquire a type I β-turn conformation. EPR studies of the interaction between TOAC0-Hst-5 and lipid vesicles whose composition mimicked those of E. coli and C. albicans (both with net negative surface charge) and erythrocytes (net zero surface charge) confirmed this modulation. In the presence of negatively charged membranes, the spectra presented outer and inner extrema, indicating that the nitroxide z axis is oriented parallel to the bilayer normal. Functional studies with planar lipid bilayers showed that TOAC0-Hst-5, but not the native peptide, forms pores. Also, TOAC0-Hst-5, but not Hst-5, permeabilizes negatively charged vesicles. Moreover, the fungicidal activity of TOAC0-Hst-5 was greater than that of Hst-5 in the absence of metal ions. However, in contrast with the native peptide, whose activity increased in the presence of Zn2+ and Mn2+, that of the analogue was the same in the absence and presence of the ions. Finally, TOAC0-Hst-5 had a more pronounced hemolytic activity than Hst-5. These results suggest a possible difference in the mechanisms of action of Hst-5 and its spin labeled analogue, in spite of the similarity of their conformational behavior.

O mecanismo de ação da Histatina-5 (Hst-5), um peptídeo antimicrobiano da saliva humana com ação fungicida, não está esclarecido. Dicroísmo circular (CD), fluorescência e ressonância paramagnética eletrônica (RPE) foram empregados para examinar as propriedades conformacionais de Hst-5 e seu análogo contendo o aminoácido paramagnético TOAC N-terminal (TOAC0-Hst-5) em solução aquosa, em função do pH, de TFE, e de íons metálicos, e em presença de membranas modelo de composição. Foi examinada a atividade dos dois peptídeos em membranas lipídicas planas, na permeabilização de membranas modelo e frente o fungo Candida albicans e eritrócitos humanos, com o objetivo de estabelecer correlações entre a atividade e a estrutura dos peptídeos. Estudos de fluorescência mostraram a capacidade de TOAC de suprimir a fluorescência e que o pK dos resíduos de Tyr foram deslocados. Espectros de CD mostraram pequenas flutuações conformacionais, mas foram mantidas estruturas ao acaso. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 mostraram a coexistência de duas populações, protonada e desprotonada, em troca lenta. A partir de medidas de desdobramento hiperfino (aN), foram calculados pKs de TOAC; a relação de altura dos picos de campo central e alto também foi sensível à titulação do peptídeo. Em TFE os peptídeos adotaram conformação α-helicoidal (CD). Espectros de fluorescência de Hst-5 mostraram aumento da fluorescência, e os de TOAC0-Hst-5 mostraram supressão, indicando aproximação de TOAC dos resíduos de Tyr. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 também refletiram as mudanças conformacionais. Estudos de fluorescência mostraram a interação de Hst-5 e TOAC0-Hst-5 com Cu2+, Mn2+ e Zn2+, permitindo o cálculo de constantes de ligação. Espectros de CD refletiram pequenas variações conformacionais, sem aquisição de estrutura secundária. Espectros de RPE de TOAC0-Hst-5 na presença dos íons paramagnéticos Cu2+ e Mn2+ indicaram interações spin-spin, permitindo o cálculo das distâncias metal-nitróxido. Curvas de tempo de correlação rotacional em função da concentração dos íons permitiram calcular constantes de ligação da mesma ordem de grandeza daquelas obtidas por fluorescência. Hst-5 e TOAC0-Hst-5 ligaram-se em maior extensão a micelas negativas do que a zwitteriônicas num processo pH-dependente. Estudos de supressão de fluorescência por acrilamida confirmaram esses resultados, indicando a modulação por interações eletrostáticas. Espectros de CD mostraram que os peptídeos adotam conformação em dobra β tipo I. Estudos de RPE da interação de TOAC0-Hst-5 com vesículas de composição lipídica mimetizando membranas de E. coli e C. albicans (carga líquida negativa) e eritrócitos (carga líquida zero) confirmaram essa modulaçao. Na presença das membranas negativamente carregadas os espectros apresentaram extremos externos e internos, indicando que o eixo z do nitróxido orienta-se paralelamente à normal à bicamada. Estudos funcionais utilizando bicamadas lipídicas planas mostraram que TOAC0-Hst-5, mas não Hst-5, forma poros. Também, TOAC0-Hst-5, mas não Hst-5, permeabiliza vesículas carregadas negativamente. Ainda, a atividade fungicida de TOAC0-Hst-5 foi maior do que a de Hst-5 na ausência de íons, porém foi a mesma na presença de Mn2+ e Zn2+. Finalmente, TOAC0-Hst-5 mostrou maior atividade hemolítica que Hst-5. Esses resultados sugerem uma possível diferença nos mecanismos de ação de Hst-5 e seu análogo marcado, apesar da semelhança no comportamento conformacional dos peptídeos. / The mechanism of action of histatin-5 (Hst-5), an antifungal antimicrobial peptide from human saliva is not completely clarified. Circular dichroism (CD), fluorescence, and electron paramagnetic resonance (EPR) were used to examine the conformational behavior of Hst-5 and its analogue containing the paramagnetic amino acid TOAC at the N-terminus (TOAC0-Hst-5). Conformational properties were investigated in aqueous solution, as a function of pH, TFE, and addition of metal ions, and in the presence of model membranes of variable lipid composition. The activity of both peptides was examined in planar lipid membranes and with regard to permeabilization of model membranes. Activity was also tested towards the fungus Candida albicans and human erythrocytes, with the scope of establishing structure-function correlations. Fluorescence studies showed that TOAC0-Hst-5 is able to quench the peptide fluorescence and that the pK of the Tyr residues was shifted to lower values. CD spectra indicated that small conformational fluctuations occurred with increasing pH, but the overall unordered structure of the peptides was kept. EPR spectra of TOAC0-Hst-5 showed the coexistence of two populations, one protonated and one unprotonated, in slow exchange. The pK of TOAC was calculated from measurements of the isotropic hyperfine splitting (aN); the ratios of heights of the mid-field line and the high-field line were also sensitive to the peptide titration. In TFE, the peptides acquired -helical conformation (CD). Fluorescence spectra of Hst-5 showed an increase of fluorescence, while those of TOAC0-Hst-5 revealed quenching, indicating that, on the average, the TOAC residue becomes closer to the Tyr residues as a consequence of the peptide acquiring α-helical conformation. EPR spectra also reflected the conformational changes undergone by the peptide. Fluorescence studies indicated that Hst-5 and its spin labeled analogue interacted with Cu2+, Zn2+, and Mn2+ ions, allowing the calculation of binding constants. CD spectra reflected the occurrence of small conformational fluctuations, without acquisition of stable secondary structure. EPR spectra of TOAC0-Hst-5 in the presence of the paramagnetic ions Cu2+ and Mn2+ evinced the occurrence of spin-spin interactions, allowing the calculation of metal-nitroxide distances. Curves of rotational correlation times as a function of ion concentration yielded values for the binding constants of the same order of magnitude as those calculated from fluorescence measurements. Hst-5 and TOAC0-Hst-5 bound to a larger extent to negatively charged than to zwitterionic micelles, in a pH-dependent process. Studies of fluorescence quenching by water soluble acrylamide confirmed these results, pointing to the fact that binding is largely modulated by electrostatic interactions. CD spectra indicated that, upon binding to micelles, the peptides acquire a type I β-turn conformation. EPR studies of the interaction between TOAC0-Hst-5 and lipid vesicles whose composition mimicked those of E. coli and C. albicans (both with net negative surface charge) and erythrocytes (net zero surface charge) confirmed this modulation. In the presence of negatively charged membranes, the spectra presented outer and inner extrema, indicating that the nitroxide z axis is oriented parallel to the bilayer normal. Functional studies with planar lipid bilayers showed that TOAC0-Hst-5, but not the native peptide, forms pores. Also, TOAC0-Hst-5, but not Hst-5, permeabilizes negatively charged vesicles. Moreover, the fungicidal activity of TOAC0-Hst-5 was greater than that of Hst-5 in the absence of metal ions. However, in contrast with the native peptide, whose activity increased in the presence of Zn2+ and Mn2+, that of the analogue was the same in the absence and presence of the ions. Finally, TOAC0-Hst-5 had a more pronounced hemolytic activity than Hst-5. These results suggest a possible difference in the mechanisms of action of Hst-5 and its spin labeled analogue, in spite of the similarity of their conformational behavior.