Under senare år har en särskilt hög resistensutveckling observerats hos gramnegativa bakterier inom familjen Enterobacteriaceae. Den främsta resistensmekanismen utgör produktion av så kallade "extended-spectrum β-lactamases" (ESBL) och särskilt oroväckande är karbapenemaser (ESBLCARBA) som har förmåga att bryta ner ett flertal olika grupper av β-laktamantibiotika. Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) har utforskats som metod för snabb detektion av karbapenemasaktivitet genom analys av nedbrytning av antibiotika. Syftet med denna studie var att utvärdera om MALDI-TOF MS kan användas som metod för att detektera enzymatisk nedbrytning av Ceftolozan/Tazobaktam samt att undersöka vilka enzymer som uppvisar nedbrytning av antibiotikan. Sju karbapenemasproducerande isolat och en β-laktamasnegativ kontrollstam användes i studien. Isolaten inkuberades 120 min respektive 270 min med antibiotika (1mg/ml) i en buffertlösning (0,08% ammoniumbikarbonat, pH 8). Efter centrifugering analyserades supernatanten med MALDI-TOF MS. Nedbrytning av Ceftolozan detekterades hos samtliga karbapenemasproducerande stammar, utom hos E. coli med NDM-1 produktion. Nedbrytningstoppar av Tazobaktam detekterades emellertid enbart hos stammar med OXA-48 och NDM-7 produktion. Tydligast nedbrytning sågs efter 120 min. För tydligare visualisering av nedbrytningstoppar bör metoden dock optimeras med avseende på matrix, buffert och antibiotikakoncentration. / In recent years, an alarming increase of antibiotic resistance has been observed in Gram-negative bacteria, classified in the family Enterobacteriaceae. The main resistance mechanism is the production of extended-spectrum β-lactamases (ESBL). Particularly worrisome is the production of carbapenemases (ESBLCARBA) due to their ability to hydrolyze a broad range of β-lactams. Recently, Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) has been investigated as a method for rapid detection of carbapenemase activity through observation of antibiotic degradation. The aim of this study was to investigate whether MALDI-TOF MS can be used as a method to detect degradation of Ceftolozane/Tazobactam as well as to examine which enzymes that possess the ability to hydrolyze the antibiotic. A total of seven carbapenemase-producing strains were used in the study. The experiment also included a β-lactamase-negative isolate as a negative control. The strains were incubated with antibiotic (1mg/ml) in a buffered solution (0,08% ammonium bicarbonate, pH 8) for 120 min and 270 min. The supernatant, after centrifugation, was analyzed by MALDI-TOF MS. All the carbapenemase-producing strains demonstrated hydrolysis of Ceftolozane, except for NDM-1 producing E. coli. However, mass peaks corresponding to the degradation of Tazobactam were only detected in strains producing OXA-48 and NDM-7. The degradation of Ceftolozane/Tazobactam was most apparent after 120 minutes. However, to better enable detection of mass peaks, further optimization is needed in regard to appropriate matrix, buffer and antibiotic concentration.

Philosophiae Doctor - PhD / Sorghum (Sorghum bicolorï, a drought tolerant cereal crop, is not only an important food source in the semi arid/arid regions but also a potential model for studying and gaining a better understanding of the molecular mechanisms of drought and salt stress tolerance in cereals. This study reports on a proteomic analysis of sorghum proteomes in response to salt and hyperosmotie stresses. Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) in combination with mass spectrometry (MS) was used to separate, visualise and identify sorghum proteins using both sorghum cell suspension cultures and whole plants. The sorghum cell suspension culture system was used as a source of culture filtrate (CF) proteins. Of the 25 visualised CBB stained CF spots, 15 abundant and well-resolved spots were selected for identification using a combination of MALDI- TOF and MALDI- TOFTOF MS, and database searching. Of these spots, 14 were positively identified as peroxidases, germ in proteins, oxalate oxidases and alpha-galactosidases with known functions in signalling processes, defense mechanisms and cell wall metabolism. Following 200 mM NaCl and 400 mM sorbitol stress treatments, the expression/abundance of a protein spot similar to a rice wall-associated protein kinase was upregulated in the sorghum secretome in response to both stresses. Amino acid sequence alignment of the matching peptides between these two proteins showed that the sorghum CF spot possesses a protein kinase domain. Therefore, this protein could possibly participate in cell signalling functions, which link the external environment with the cell's cytoplasm. Using whole plant systems, a comparative study of leaf protein expression between two sorghum varieties, AS6 (salt sensitive) and MN1618 (salt tolerant) was conducted. Forty well resolved spots of varying abundances were picked for MS analysis. Of these, 28 were positively identified, representing proteins with functions in carbohydrate metabolism (60.7%), proton transport (17.9%), protein synthesis (7.1%), hydrolytic functions (7.1%), nucleotide metabolism (3.6%) and detoxification (3.6%). Using PDQuest™ Advanced 2D Analysis Software version 8.0.1 (BIO-RAD), a comparative analysis of leaf proteome expression patterns between the two sorghum varieties was conducted. The results indicated proteins with similar expression patterns as well as qualitative and quantitative differences between the two leaf proteomes. The effect of 100 mM NaCI on leaf proteome expression between the two sorghum varieties was also studied. Western blotting analysis of leaf, sheath and root tissues using Hsp70 antibodies showed that this treatment induced Hsp70 expression, a known stress protein, in both varieties. Thereafter, the partially annotated leaf proteome map was used to landmark other salt responsive proteins. Examples of differential expression patterns included glutathione S transferase and hydroxynitrile lyase proteins whose abundances were upregulated in both varieties, while the large subunit of RuBisCo was downregulated in AS6 but upregulated in MN1618. Qualitative spot expression differences in response to salt stress were also observed between the two sorghum varieties but these remained unidentified after both MALDI-TOF and MALDI-TOF-TOF MS, possibly indicating novel and previously uncharacterised sorghum proteins. The results of this study can be used as reference tools by proteomics researchers worldwide as well as a foundation for future studies.

Bei der Zellkultivierung wird dem artifiziell hergestellten Grundmedium meist tierisches Serum hinzugefügt, um ein adäquates Wachstum der Zellen zu gewährleisten. So liefert das Serum zusätzliche Nährstoffe, essenzielle Wachstumsfaktoren und eine Vielzahl weiterer Moleküle. Die Seren werden kommerziell aus tierischem Vollblut hergestellt und normalerweise vor ihrer Auslieferung auf bestimmte Parameter, wie zum Beispiel Aminosäure-Gehalt und Albumin-Konzentration, getestet. Trotz dieser Testung seitens der vertreibenden Unternehmen bestehen große Qualitätsunterschiede bei den Zellkulturanwendungen. Somit sind Forschungslabore häufig gezwungen Probeseren anzufordern und diese in eigenen zeitaufwendigen und kostenintensiven Zellkulturversuchen zu testen, bevor ein Serum ausgewählt und in den eigentlichen Versuchen eingesetzt werden kann. Auch die serumvertreibenden Unternehmen müssen demzufolge alle Serumchargen bis zum Abschluss der Testversuche in ausreichenden Mengen bereithalten, was einen bedeutenden Mehraufwand darstellt. Aus diesen Gründen wäre es eine entscheidende Vereinfachung, wenn ein geeigneter Biomarker zur Testung der Serumtauglichkeit gefunden werden könnte, der diese aufwendigen Vorversuche ersetzt. Ein potenzieller Biomarker könnte das Glycerophospholipid Lysophosphatidylcholin (LPC) sein. Seine stressbedingte Bildung, vorrangig aus Phosphatidylcholin (PC), im Rahmen von Entzündungen, oxidativem Stress oder ungünstigen Lagerungsbedingungen könnte als Indikator für qualitätsmindernde Prozesse im Serum dienen. Des Weiteren könnte das vermehrte LPC selbst einen entscheidenden Einfluss auf das Wachstum von Zellen haben und somit die Qualität der Seren widerspiegeln. Die Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) eignet sich aufgrund ihrer Robustheit gegenüber Verunreinigungen und der hohen Messgeschwindigkeit für die Detektion beider Moleküle in biologischen Materialen. Zur weiteren Vereinfachung der Bestimmung der LPC-Konzentration mittels MALDI-TOF MS wird oft auf den Zusatz eines internen Standards verzichtet, um zusätzliche Fehlerquellen zu vermeiden. Hierbei wird LPC ausschließlich relativ zur PC-Konzentration ermittelt (PC/LPC-Verhältnis). Da es sich bei Serum um eine komplexe, biologische Probe handelt, könnten Molekülinteraktionen wie beispielsweise Protein-Lipid-Interaktionen Grund für unterschiedliche PC/LPC-Verhältnisse sein. Albumin als ubiquitär im Serum vorhandenes Protein kann eine Vielzahl von Molekülen binden, darunter auch bestimmte Lysophospholipide. Somit ist es wichtig zu klären, inwieweit Albumin eine adäquate Detektion von Lysophosphatidylcholin verhindern beziehungsweise beeinflussen kann. Die hier publizierte Arbeit konnte zeigen, dass Albumin-Zusatz (von Pferd und Rind) zu einem Anstieg des detektierten PC/LPC-Verhältnisses im „intakten“ Serum führt. Umgekehrt sinkt das PC/LPC-Verhältnis beim enzymatischen Verdau des Albumins wieder, weil nun mehr LPC detektiert werden kann. Der Einfluss von Pepsin und Trypsin, die durch den enzymatischen Verdau des Albumins zu einer verbesserten LPC-Detektion führen, wurde unter verschiedenen Bedingungen (Konzentration, Inkubationszeit, Temperatur) verglichen. Abschließend wurde ein verbessertes Protokoll für die MALDI-TOF MS-Messungen des PC/LPC-Verhältnisses im „intakten“ Serum durch einen vorausgehenden Pepsin-Verdau vorgeschlagen. Dabei muss vor allem darauf geachtet werden, möglichst niedrige Temperaturen zu verwenden, um die temperaturbedingte Konversion von PC zu LPC zu minimieren. Sowohl das ursprüngliche als auch das erweiterte Messprotokoll fand im zweiten Teil der Arbeit Anwendung. Hier wurde die aufwendige konventionelle Qualitätstestung von Pferdeseren mittels Zellkultur mit der massenspektrometrischen Messung von LPC als Biomarker verglichen, um eine etwaige Vereinfachung der Serumselektion zu evaluieren. Die verwendeten FDCPmix-Zellen sind murine hämatopoetische Vorläuferzellen, die beispielsweise zur Untersuchung der hämatopoetischen Stammzellnische verwendet werden. Ähnlich wie die hämatopoetischen Stammzellen selbst, stellen die FDCPmix-Zellen hohe Anforderungen an die Zellkulturbedingungen. Wird inadäquates Medium bzw. Serum verwendet, können Wachstum und Differenzierungspotential negativ beeinflusst werden, wodurch die Zellen nicht mehr für weitere Versuche geeignet sind. Folglich ist die achtsame Auswahl des Pferdeserums essenziell. Acht Pferdeseren von verschiedenen Anbietern wurden zur Kultivierung nach derzeitigem Goldstandard eingesetzt. Als Evaluationsparameter für die Qualität des jeweiligen Serums wurden Zellwachstum, Differenzierungspotenzial nach Kultivierung und die Fähigkeit Zellkolonien im semifesten Medium (colony forming units - CFUs) zu bilden, verwendet. Hierbei zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Seren. Insbesondere in der Fähigkeit CFUs auszubilden und im Wachstum waren die größten Unterschiede zu erkennen. Diese Zellkultur-Ergebnisse wurden mit MALDI-TOF MS-Messungen des PC/LPC-Verhältnisses vor und nach Pepsinverdau im „intakten“ Serum verglichen. Jedoch korrelierte das PC/LPC-Verhältnis nicht mit den Ergebnissen der Zellkulturexperimente. Dies ist mit den Unterschieden in der PC-Konzentration zwischen den verschiedenen Seren zu erklären. Enthält ein Serum generell viel PC, so kann trotz eines hohen PC/LPC-Verhältnisses die LPC-Konzentration im Serum zu hoch sein und die Zellkultivierung negativ beeinflussen. Deshalb wurde LPC mit Hilfe eines internen Standards quantifiziert. Bei den für die Kultivierung ungeeigneten Seren lag, sowohl vor als auch nach Proteinverdau, eine hohe LPC-Konzentration vor. Umgekehrt konnten die Pferdeseren mit geringen LPC-Konzentrationen mit günstigen Zellkultur-Ergebnissen assoziiert werden. Dieser negative Einfluss einer hohen LPC-Konzentration konnte durch die artifizielle Zugabe von LPC zur Zellkultur weiter bestätigt werden. Im Gegensatz zum nicht manipulierten Kontrollmedium zeigten die Proben mit artifiziell erhöhter LPC-Konzentration vor allem eine deutlich geringere Fähigkeit CFUs auszubilden, welches ein Kernkriterium für die Verwendbarkeit des Serums ist. Insgesamt konnte folglich der negative Einfluss von LPC auf die Zellkultur gezeigt werden, was seine Eignung als Indikator für die Serumqualität bestätigt. Zusätzlich zur LPC-Konzentration wurden weitere Mediator- und Signalmoleküle untersucht, die im Zuge des PC/LPC-Stoffwechsels entstehen können und unter anderem Entzündungsprozesse beeinflussen. Bei der Konversion von PC zu LPC durch die Phospholipase A2 oder durch oxidativen Stress wird die Fettsäure (z.B. Arachidonsäure oder Linolsäure) an der sn-2-Position vom Glycerolrückgrat freigesetzt und steht zur weiteren Metabolisierung durch beispielsweise Cyclooxygenasen oder Lipoxygenasen zur Verfügung. Hierbei können Eikosanoide wie Thromboxane, Prostaglandine oder Leukotriene entstehen. Daher wurden die Pferdeseren weiterhin auf Eikosanoide mittels Flüssigchromatographie (LC)-MS/MS getestet. Hierbei zeigte sich, dass erhöhte Thromboxan B1-, Thromboxan B2- und 12-S-Hydroxy-Heptadecatriensäure-Konzentrationen ebenfalls auf eine ungünstige Serumqualität hinweisen. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Seren mit hohen LPC-Konzentrationen und daher schlechten Zellkultur-Ergebnissen ebenfalls hohe Konzentrationen an Linolsäure aufweisen. Diese Fettsäure wird typischerweise bei der Konversion von im Pferdeserum vorkommenden PC zu LPC aus der sn-2-Position freigesetzt. Somit scheint neben der LPC-Konzentration auch das Eikosanoidprofil qualitative Aussagen über das jeweilige Pferdeserum zu erlauben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sowohl niedrige absolute LPC- als auch niedrige entzündungsfördernde Eikosanoid-Level mit einer günstigen Serumqualität korrelieren. Jedoch benötigt die Bestimmung des Eikosanoidprofils im Gegensatz zur LPC-Bestimmung anspruchsvollere Messmethoden wie LC-MS/MS. Die LPC-Konzentration kann mittels MALDI-TOF MS zuverlässig ermittelt werden. Diese robuste, schnelle und preiswerte Methode ermöglicht die direkte Messung im „intakten“ Serum. Dabei ist die Zugabe eines internen Standards zur Bestimmung der absoluten LPC-Konzentration notwendig, da sich das PC/LPC-Verhältnis als ungeeignet für die Qualitätsevaluation von Zellkulturseren erwiesen hat.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis 1 Einführung 1.1 Allgemeine Einleitung 1.2 Factor dependent cells Paterson mixed potential (FDCPmix-Zelllinie) 1.3 Phosphatidylcholin und Lysophosphatidylcholin 1.4 Eikosanoide 1.5 Massenspektrometrie 1.5.1 MALDI-TOF Massenspektrometrie 1.5.2 ESI-IT Massenspektrometrie 1.6 Ziele der Dissertation 2 Publikationsmanuskripte 2.1 Determination of the Phosphatidylcholine/Lysophosphatidylcholine Ratio in Intact Serum by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry with Prior Enzymatic Albumin Digestion 2.2 Phospholipase A2 products predict the hematopoietic support capacity of horse serum 3 Zusammenfassung der Arbeit 4 Literaturverzeichnis 5 Nachweis über Anteile der Co-Autoren 6 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 7 Lebenslauf 8 Publikationen 9 Danksagung

Introduktion: Sepsis är utan behandling ett livshotande tillstånd, en korrekt behandling behöver en snabb och tillförlitlig artidentifiering. Olika prepareringsmetoder av positiva blododlingar inför direkt identifiering med MALDI-TOF finns. MBT Sepsityper® IVD Kit är en CE-märkt metod. För att följa IVDR-direktivet behöver Sepsityper jämföras med den nuvarande in-house-metoden. Dessa två metoder jämfördes utifrån förmåga att ge ett tillförlitligt, snabbt resultat där även den praktiska metoden samt ekonomiska aspekten undersöktes Material och metod: Alla positiva blododlingar som undersöktes preparerades med in- house-metoden och Sepsityper innan analys med MALDI-TOF MS. Med in-house-metoden användes saponin för att lysera de humana cellerna medans Sepsityper använde lyseringsbuffert. Resultatets tillförlitlighet presenteras som scorevärde där >2 är tillförlitligt till speciesnivå, 1,7–1,99 till genusnivå och <1,7 är ej tillförlitligt. Resultat: 135 positiva blododlingar undersöktes där in-house-metoden gav 115 med ett scorevärde över 1,7 medans Sepsityper® gav 100 prover med ett scorevärde över 1,7. Bland dessa prover var det 62 gramnegativa bakterier och 53 grampositiva. Slutsats: En skillnad mellan antalet identifieringar med scorevärde över 1,7 sågs men var ej signifikant enligt CHI2 test där antalet var högre för house metoden. Den data som samlats ger ej inte tillräckligt med stöd för att inte avvika från IVDR och fortsätta med in-house- metoden. / Background: Sepsis without treatment is a life-threatening condition, a rapid as well as reliable identification of the bacteria is needed. Different preparation methods of positive blood cultures for rapid identification are available. MBT Sepsityper® IVD Kit is one of them and is a CE-marked method. To comply with the IVDR directive, Sepsityper® needs to be tested and compared with the current in-house method. These two methods were compared based on the ability to provide fast and reliable results. Material and method: All the positive blood samples that were examined were prepared by the two methods then analysed with MALDI-TOF MS. The in-house-method used saponin to lyse the blood cells, Sepsityper used a lysisbuffert. How reliable the results are presented as score value, >2 means that the result is reliable to species identification, between 1.7-1.99 to genus identification and <1.7 is not reliable. Results: 135 positive blood cultures were examined and the in-house-method gave 115 with a score value above 1.7 while Sepsityper® gave 100 bottles a score value over 1.7. Among the bottles there were 62 gram-negative bacteria and 53 gram-positive bacteria. Conclusion: A difference between the number of identifications with a score value above 1.7 were seen where the number was higher for the in-house method, but the difference was not significant according to the Chi2 test. The data collected do not provide sufficient support for not following IVDR and not switch to Sepsityper®.

Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) är en viktig metod för artidentifiering av mikroorganismer på kliniska mikrobiologiska laboratorier. Enligt rekommendationer från Bruker Daltonics skall matrixapplicering ske relativt omedelbart efter att mikroorganismer har applicerats. Syftet med studien var att utvärdera effekter på artidentifiering vid förlängda tidsintervall mellan applicering av mikroorganismer och matrix med MALDI-TOF MS. Målet var att optimera arbetsflödet på mikrobiologilaboratoriet, laboratoriemedicin, Region Jönköping län (RJL). I studien undersöktes hur identifieringen av mikroorganismer påverkades av applicering avbakterie- och jästsvampstammar (n = 267) och α-Cyano-4-hydroxycinnaminsyra (HCCA)-matrix på en MALDI-provplatta vid varierande tidsintervall upp till tre timmar. Analys med MALDI-TOF MS genomfördes med masspektrometrarna MALDI Biotyper Sirius IVD System och Bruker MicroFlex LT. Resultaten visade att förlängda tidsintervall mellan applicering av mikroorganismer och matrix upp till tre timmar inte hade någon signifikant effekt på scorevärden vid artidentifiering, vilket innebar att tidsintervallen är acceptabla för artidentifiering med MALDI-TOF MS. Detta ger värdefull information för att optimera arbetsflödet och öka effektiviteten på mikrobiologilaboratoriet. / Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is an important method for species level identification in clinical microbiology laboratories. According to recommendations from Bruker Daltonics matrix application should occur relatively immediately after microorganisms have been applied. The aim of the study was to evaluate the effects on microbial identification at extended time intervals between microbial and matrix application using MALDI-TOF MS. The objective was to optimize the workflow at the microbiology laboratory, laboratory medicine, Region Jönköping län (RJL). The study investigated the impact on identification of microorganisms between the application of bacterial and yeast strains (n = 267) and α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) matrix on a MALDI target plate of various time intervals up to three hours. MALDI-TOF MS was performed using MALDI Biotyper Sirius IVD System and Bruker MicroFlex LT mass spectrometers.The results showed that a delay of matrix application up to three hours had no significant effect on score values, indicating that time did not affect the accuracy of microbial identification using MALDI-TOF MS. Consequently, the study provided valuable information for optimizing the workflow and increasing the efficiency of the microbiology laboratory.

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This diploma thesis is focused on species identification of sand flies belonging to two genera of the subfamily Phlebotominae, genus Phlebotomus and Sergentomyia. Genus Phlebotomus together with the genus Lutzomyia of New World include the only proven vectors of Leishmania parasites and they are also carriers of viral and bacterial infections. Species of the genus Sergentomyia are proven vectors of sister genus Sauroleishmania that infects reptiles, but for several decades there have been speculations about their possible involvement in the transmission of mammalian Leishmania species. These suspicions arise mainly from repeated findings of mammalian Leishmania parasites in their digestive system. Correct species determination of medically significant hematophagous arthropods is very important especially for purposes of epidemiological studies so that efficient vector control may be correctly set. Routine identification of sand flies is based on morphological characters located mainly on their heads and genitalia. However, these characters may be variable within a species, they require certain expertise and in the field samples they may be damaged, making proper species identification impossible. This thesis therefore presents two alternatives of sand fly identification based on molecular...

En contrôlant le passage para- et transcellulaire des composés du sang vers le cerveau (et inversement), la barrière hémato-encéphalique (BHE) constitue la « gardienne » du compartiment cérébral. Bien que relativement connu dans son aspect physiologique, le phénotype BHE des cellules endothéliales des capillaires cérébraux (BCECs) reste mal compris au regard des mécanismes moléculaires qui gouvernent son établissement et son maintien. Dans cette optique, à l’aide du modèle in vitro de BHE développé au laboratoire (co-culture de BCECs bovines et de cellules gliales de rats), nous avons réalisé deux études protéomiques comparatives afin d’identifier les protéines cytoplasmiques potentiellement impliquées dans l’induction et le maintien de ce phénotype: d’une part une approche qualitative sans marquage (label free) et d’autre part une approche quantitative grâce à un marquage isotopique préalable des protéines (isotope-coded protein label, ICPL). Les deux approches, label free et ICPL se sont révélées complémentaires et ont permis, respectivement, l’identification de 447 et de 412 protéines (dont 290 quantifiées). Quatre protéines d’un intérêt particulier dans le domaine de la BHE (phosphatase alcaline tissu-non spécifique, TNAP ; protéine 1 possédant un domaine d’homologie à Eps15, EHD1 ; superoxyde dismutase, SODC et homologue 7 de la protéine de la maladie de Parkinson PARK7, DJ-1) ont fait l’objet de caractérisations biochimiques approfondies et ouvrent des pistes d’investigation sur des potentielles voies cellulaires induites par les cellules gliales et impliquées dans le phénotype BHE. / The blood-brain barrier (BBB) controls the para- and transcellular crossing of compounds from blood to brain (and inversely) and establishes the “gatekeepers” of the brain. The major part of therapeutic drugs developed to fight the brain diseases is deemed inefficient in vivo due to the presence of the BBB that they are unable to cross. Although relatively well known in its physiological aspect, the BBB phenotype of brain capillary endothelial cells (BCECs) remains largely under known and misunderstood in regards of the molecular mechanisms that govern its establishment and its maintenance. To this goal, using the in vitro BBB model developed in the laboratory (co-culture of bovine BCECs with rat glial cells), we performed two differential proteomic studies to identify the main cytoplasmic proteins involved in the establishment and maintenance of this phenotype: a qualitative label free approach and a quantitative isotope-coded protein labeling (ICPL) approach.The two different approaches, label free and ICPL, are complementary and led to the identification of 447 and 412 proteins, respectively. Four proteins of particular interest for BBB (tissue-non specific alkaline phosphatase, TNAP; Eps15 homology domain containing protein 1, EHD1; superoxide dismutase, SODC and Parkinson disease protein 7 homolog PARK7, DJ-1) have been more deeply studied and they open new discovery prospects related to cellular pathways induced by glial cells and involved in the BBB phenotype.

Perfluoroalkyl substances (PFASs) are anthropogenic compounds that have been classed as persistent organic pollutants (POPs) and are found in both commercial and industrial products. PFASs have been detected in different environmental matrices and have been found to bioaccumulate in all trophic levels. The adverse effects that are associated with PFAS exposure include reduced body weight, increased liver weight, hepatocellular hypertrophy, a decrease in serum cholesterol and triglycerides. This project aims to characterize the metabolic changes in lipid metabolism in the liver after exposure to one of the well-studied PFASs, the perfluorooctane sulfonate (PFOS), during the embryo development using the domestic chicken as a model organism. The characterization of the metabolic changes was done by conducting both quantitative lipidomic analysis and semi-quantitative global profiling on extracted lipids from liver homogenates from a former related project looking at fatty acid profiles. The extracted lipids were analyzed using UHPLC/Q-TOF-MS. In the quantitative analysis, the PFOS-treated groups (0.1 ug/g and 1.0 ug/g)exhibited higher lipid concentrations when compared with the solvent control group (5% DMSO) and the untreated group leading to the conclusion that PFOS exposure disrupts the lipid metabolism. When comparing the lipid concentrations between the two PFOS-treated groups (0.1 ug/g and 1.0 ug/g), the majority of the lipids exhibited higher lipid concentrations in the 1.0 ug/g PFOS-treated groups leading to the conclusion that the effect PFOS has on the lipid metabolism is dose dependent. In the global profiling analysis, 63 lipids showed significant differences when comparing the solvent control group with samples either treated with 0.1 ug/g PFOS or 1.0 ug/g PFOS.

Perfluorooctane sulfonate (PFOS) is widely used in industrial products and is potentially dangerous to the aquatic environment due to not being broken down whether by chemical or biological means, having a half-life of more than 41 years and disrupting hormones. Hexabromocyclododecane (HBCD) is the third most used brominated flame retardant and is of environmental concern as it bioaccumulates and magnifies in the food chain and is highly toxic to aquatic organisms. The purpose of this study was to examine the effect of PFOS and HBCD on the embryos of rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) by analyzing lipid profiles with UHPLC/Q-TOF-MS. The fish embryos were treated with various concentrations of PFOS and HBCD (0.058-58 μg/l and 0.014-14 μg/l respectively) with DMSO as carrier solvent and then extracted after homogenization with 0.9% NaCl-solution followed by addition of ISTD mixture, methanol, methyl tert-butyl ether (MTBE) and MQ-water. The raw data was processed with MZmine-2.32. 153 lipids were identified with the main lipids consisting of glycerophospholipids and triacylglycerols. A two-tailed t-test was used to study the impact of the chemical exposure on the embryos, where p-values below 0.05 were lipids considered as significant change. The HBCD exposure caused significant change in various triacylglycerols, whereas PFOS exposure caused significant change in triacylglycerols as well as in glycerophospholipids such as PC(O-38:5) and LPC(20:4). The results were in alignment with previous studies.