L’intégration de la copie ADN du VIH-1 dans le génome d’une cellule infectée est une étape essentielle du cycle réplicatif de ce rétrovirus. Elle est réalisée par une enzyme virale, l’intégrase, qui constitue une cible privilégiée des stratégies antivirales. Différentes études suggèrent une régulation de la sélectivité d’intégration par la chromatine et la transcription. La protéine cellulaire LEDGF/p75, activateur transcriptionnel, interagissant à la fois avec l’intégrase et la chromatine constitue une parfaite illustration de cette régulation.Mon projet de thèse a été d’étudier les liens entre LEDGF/p75, la chromatine et la transcription au cours de l’intégration du VIH-1.Tout d’abord, mes travaux ont permis de valider in vitro l’interaction entre LEDGF/p75 et son partenaire TOX4, récemment identifié par notre équipe. J’ai également montré que le domaine de TOX4, fixant LEDGF/p75, inhibe in vitro l’intégration sur matrice chromatine en présence de LEDGF/p75, suggérant un rôle inhibiteur de TOX4 à l’étape d’intégration du VIH-1.Ensuite, j’ai mis au point des protocoles in vitro de couplage entre l’intégration et la transcription. L’utilisation d’extraits nucléaires pour transcrire par l’ARN polymérase II n’étant pas compatible avec le processus d’intégration, j’ai utilisé l’ARN polymérase T7 purifiée comme machinerie de transcription et étudié les conséquences sur l’intégration. Bien que l’ARN synthétisé inhibe l’intégration, j’ai pu montrer que le passage d’une ARN polymérase sur la matrice d’intégration n’affecte pas l’efficacité globale d’intégration.Enfin, la transcription modifiant la topologie de l’ADN, mon dernier objectif a été d’étudier in vitro l’effet de ce paramètre sur l’intégration. En utilisant des plasmides de différentes formes topologiques comme substrats accepteurs d’intégration, j’ai montré que l’intégration est favorisée sur les formes surenroulées négativement. J’ai également prouvé que cette sélectivité est indépendante de la présence de LEDGF/p75.Mes travaux constituent une étape dans la connaissance des bases moléculaires et mécanistiques de la sélectivité d’intégration du VIH-1 pouvant déboucher sur l’établissement de nouvelles stratégies antirétrovirales. / The integration of the DNA copy of HIV-1 in an infected cell is an essential step of the replication cycle of the retrovirus. It’s performed by a viral enzyme, called integrase, which constitutes a major target of antiviral strategies. Several studies suggest a regulation of integration selectivity by chromatin and transcription. The cellular protein LEDGF/p75, a transcriptional activator, interacting with both integrase and chromatin perfectly illustrates this regulation. My thesis project was to study the links between LEDGF/p75, chromatin and transcription during HIV-1 integration.First, my work validated in vitro the interaction between LEDGF/p75 and its partner TOX4, recently identified by our team. I have also shown that the TOX4 domain, interacting with LEDGF/p75, inhibits integration in vitro on chromatin templates in the presence of LEDGF/p75, suggesting an inhibitory role of TOX4 during the HIV-1 integration step.Then, I developed several in vitro protocols coupling HIV-1 integration and cellular transcription. As RNA polymerase II transcription machinery from Hela nuclear extracts prevents the integration process, I used purified T7 RNA polymerase to perform transcription and studied its consequences on integration. I could show that the synthetized RNA inhibits integration but that the transcription process per se does not affect global integration efficiency on the transcribed template. Since transcription modifies DNA topology, my last goal was to study the effect of this parameter on integration in vitro. Using plasmids of different topological forms as integration acceptor substrates, I showed that integration is enriched in negative supercoiled plasmids. I also proved that this selectivity is independent of the presence of LEDGF/p75. My work constitutes an initial step in understanding the molecular and mechanistic basis of HIV-1 integration selectivity that can lead to the establishment of new antiretroviral strategies.

La présence de lésions sur l'ADN contribue à déstabiliser sa structure, bloquant certains processus vitaux pour la cellule. Ces altérations peuvent cependant avoir un intérêt thérapeutique, par exemple dans le cas de l'utilisation d'anticancéreux tels que les dérivés du platine. Les adduits volumineux qu'ils génèrent, s'ils ne sont pas réparés, entraînent la cellule vers l'apoptose. La compréhension de la réponse à ces anticancéreux passe par l'étude des protéines qui interagissent directement avec les dommages, et dont l'ensemble constitue l'interactome des lésions de l'ADN. Ce travail de thèse présente le développement d'outils destinés à compléter la liste des protéines associées aux adduits du platine. Dans un premier temps, nous avons utilisé un piège à protéines (ligand fishing) constitué de plasmides lésés fixés sur des billes magnétiques. Trois dérivés du platine ont été sélectionnés pour générer les lésions : le cisplatine (molécule princeps), l'oxaliplatine, et le satraplatine. Ce piège a permis d'obtenir, à partir d'extraits nucléaires issus de cellules cancéreuses HeLa et grâce à une identification par protéomique, une liste de candidats comprenant des protéines déjà connues (HMGB1, hUBF, complexe FACT), mais aussi 29 nouveaux membres de l'interactome. Parmi ceux-ci, nous avons relevé PNUTS, TOX4 et WDR82, qui constituent les sous-unités du complexe PTW/PP, très récemment découvert. La présence de ce complexe a été également validée sur un modèle d'adénocarcinome mammaire MDA MB 231, et les conséquences biologiques de son interaction avec les adduits du platine devront maintenant être précisées. Dans un second temps, nous avons mis au point une biopuce permettant d'étudier les interactions ADN lésé/protéine par SPRi. Les affinités respectives d'HMGB1 et du nouveau candidat TOX4 pour les adduits des trois dérivés du platine ont pu être ainsi confirmées. Dans un dernier temps, nous avons étudié le rôle de DDB2 (acteur de la reconnaissance des photoproduits UV) dans la prise en charge des adduits platinés. Les expérimentations menées sur les cellules MDA MB 231 exprimant DDB2 de façon différentielle nous ont permis de vérifier que cette protéine ne participe pas à la réparation des adduits du cisplatine, contribuant plutôt à potentialiser l'action cytotoxique de cet agent. Dans le futur, nos microsystèmes pourront être adaptés à l'étude de l'interactome d'autres lésions de l'ADN.