A espermatogênese em mamíferos é um processo sustentado pela auto-renovação e diferenciação de células-tronco espermatogoniais (SSCs). O estudo destas células oferece um excelente modelo para o melhor entendimento da biologia das células-tronco adultas e dos mecanismos que controlam as funções das SSCs. Além do potencial biomédico para estudos sobre infertilidade em diferentes espécies, as SSC possuem uma aplicação promissora na biotecnologia para a produção de animais transgênicos. Assim, o objetivo deste trabalho foi responder à pergunta: "SSCs bovinas LacZ+ podem integrar-se aos túbulos seminíferos de bezerros pré-púberes da raça Nelore após transplante autólogo?" Para isso, bezerros Nelore de 5 meses de idade (n=16) foram submetidos a uma orquiectomia unilateral para o isolamento de células espermatogoniais por digestão enzimática. Após o plaqueamento diferencial, as células foram transduzidas com um vetor lentiviral contendo a sequencia do gene marcador LacZ. Para isso, os animais foram aleatoriamente alocados em um dos quatro grupos experimentais: LacZ+/PKH26+, LacZ+/PKH26-, LacZ-/PKH26+, LacZ-/PKH26-. Após 60 h do início do cultivo in vitro, as células espermatogoniais foram transplantadas autologamente para o mediastino do testículo remanescente por injeção guiada por ultrassonografia. O testículo transplantado foi removido cirurgicamente após 45 dias e amostras de tecido foram submetidas a reação com x-gal para verificação da integração de células espermatogoniais transgênicas aos túbulos seminíferos. Células espermatogoniais foram isoladas e cultivadas in vitro com sucesso. Contudo, não foi possível obter uma população pura de SSCs por plaqueamento diferencial. Embora tenha sido eleito o transplante de células espermatogoniais e não de SSCs somente, sabe-se que também foram transplantadas SSCs, pois a caracterização das células isoladas demonstrou a expressão dos marcadores de SSCs ITGA6, GFRa-1, PGP 9.5 e afinidade pela lectina DBA. Crioseções de amostras de tecido testicular coradas com x-gal permitiram a observação de células transgênicas em 8 de 8 animais que receberam células LacZ+. Contudo, todas as células transgênicas observadas estavam situadas no interstício. Concluindo, não foi possível observar a integração das células transgênicas transplantadas aos túbulos seminíferos do testículo receptor após 45 dias do transplante autólogo utilizando a técnica de injeção intratesticular de células espermatogoniais LacZ+ no mediastino de bezerros pré-púberes da raça Nelore. / Mammalian spermatogenesis is sustained by self renewal and differentiation of spermatogonial stem cells (SSCs). The study of these cells provides a model to better understand adult stem cell biology and the mechanisms that control SSC functions. Besides the biomedical potential to perform studies of infertility in many species, SSCs hold a promising biotechnological application at animal transgenesis. In this manner, the goal of this study was to answer the question: "Can LacZ+ bovine SSCs be integrated into seminiferous tubule of prepubertal Nelore bulls subjected to autologous transplantation?" Hence, 5 months old bulls (n=16) were hemicastrated and spermatogonial cells were isolated by a two step enzymatic digestion procedure. After differential plating, cells were transduced with a lentivirus vector carrying the LacZ reporter gene sequence. Animals were randomly allocated in four experimental groups: LacZ+/PKH26+, LacZ+/PKH26-, LacZ-/PKH26+, LacZ-/PKH26-. After 60 h of the onset of in vitro culture, spermatogonial cells were autologously transplanted to the remaining testes by an ultrasound guided needle injection at the testis mediastinum. The transplanted testes were surgically removed after 45 days and testicular tissue samples were subjected to x-gal staining to assess the integration of transgenic spermatogonial cells to seminiferous tubule. Spermatogonial cells were successfully isolated and in vitro cultured. However, it was not possible to obtain a SSC enriched population of cells by differential plating. Although it was decided by the transplant of spermatogonial cells instead of pure SSCs only, it was detected the expression of SSC marker genes ITGA6, PGP9.5, GFR-1 and the affinity for DBA by the isolated cells. Cryosections of x-gal stained testicular tissue samples allowed the observation of transgenic cells in 8 out of 8 animals that received LacZ+ cells. However, all transgenic cells observed were located at the interstitial space. In conclusion, it was not possible to observe the integration of the transplanted transgenic cells into seminiferous tubule of prepubertal Nelore bulls subjected to autologous transplantation using an ultrasound guided needle injection at the testis mediastinum, after 45 days of transplant.

A transferência gênica mediada por espermatozóide (TGME) por ser um método teoricamente simples e barato tem sido usada na produção de animais transgênicos. Entretanto, os resultados são variáveis e inconstantes. Para otimizar a TGME é necessário estabelecer o tempo, a quantidade e o tipo de DNA exógeno que será incubado com os espermatozóides. O estudo dos efeitos destes parâmetros na TGME foi o objetivo deste trabalho. Para avaliar o efeito da adição do DNA exógeno durante 0, 1, 2, 3 e 4 horas de incubação na viabilidade espermática foram utilizadas as sondas fluorescentes Hoechst 33342, Iodeto de propídeo, JC-1 e FITC-PSA. Na avaliação do efeito do tempo de incubação (60, 90 e 120 minutos) nos índices de apoptose e necrose, os espermatozóides foram corados com as sondas fluorescentes Yo-pro e Iodetoto de propídeo e avaliados pelo citômetro de fluxo, e os índices de transfecção avaliados pela PCR em tempo real. Para avaliar o efeito da quantidade e da seqüência de DNA exógeno foram construídas seqüências de tamanhos e estruturas diferentes. Para as seqüências de tamanhos diferentes, foram utilizadas seqüências de 2,2; 5,5 e 8,5kb nas concentrações de 500ng ou 130ng da seqüência de 2,2kb, 323ng da seqüência 5,5kb e 500ng da seqüência de 8,5kb. Para as seqüências de diferentes estruturas foram utilizadas seqüências ricas em oligonucleotideos AT, GC ou intermediária (IN). Foram avaliados o efeito das seqüências de diferentes tamanhos, estruturas e concentrações na indução de apoptose dos espermatozóides pelo citômetro de fluxo e os índices de transfecção por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que não houve efeito da adição do DNA exógeno sobre a viabilidade espermática. Entretanto, houve efeito do tempo de incubação onde foi observado maior viabilidade espermática com 1 hora de incubação (35,7%). O tempo de incubação não teve efeito na indução de apoptose, mas foi observado efeito no índice de transfecção apresentando maior quantidade de DNA exógeno associado aos espermatozóides às 2 horas de incubação. A quantidade, o tamanho e a estrutura de DNA exógeno não influenciaram o índice de apoptose, assim como a quantidade de DNA não teve efeito nos índice de transfecção. Entretanto, foi observado efeito do tamanho e da estrutura do DNA, no qual a seqüência de 5,5kb apresentou melhores resultados de transfecção tanto na quantidade de 500ng e 323ng. A seqüência rica em AT também apresentou melhor resultado de transfecção em relação à seqüência rica em GC e a intermediária. Em conclusão, o tempo de incubação reduziu a viabilidade espermática, porém, aumentou os índices de transfecção. A transfecção dos espermatozóides não foi influenciada pela quantidade da seqüência, mas foi influenciada pelo tamanho e estrutura da seqüência. A apoptose e necrose das células espermáticas não foram influenciadas pela quantidade, tamanho e estrutura do DNA exógeno / Sperm-mediated gene transfer (SMGT) has been used for transgenic animal production because it is a theoretically simple and low cost method. However, results are various and without repetibility. In order to optimize SMGT it is necessary to determine the time, amount and sequence of exogenous DNA for incubation with spermatozoa. The objective of this study was to verify the effect of these three parameters on SMGT. To assess the effect of exogenous DNA addition on sperm viability after 0, 1, 2, 3 and 4 hours of incubation, fluorescent probes Hoechst 33342, propidium iodide, JC-1 and FITC-PSA were used. To evaluate effects of incubation time (60, 90 and 120 minutes) on apoptosis and necrosis rates, spermatozoa were stained with fluorescent probes Yo-pro and propidium iodide and analyzed by flow cytometry; transfection rates were evaluated by real-time PCR. To assess the effect of exogenous DNA amount and sequence, different sized and structured sequences were made. Different sized sequences of 2.2, 5.5 and 8.5kb were used, with concentration of 500ng or 130ng of 2.2 sequence, 500 or 323ng of 5.5 sequence and 500ng of 8.5 sequence. Different structured sequences were rich in AT, GC or intermediate (IN). The effect of different size, structure and concentration on spermatozoa apoptosis induction were analyzed by flow cytometer and transfection rates by real-time PCR. Results show that no effects occurred on spermatozoa viability after exogenous DNA addition. However, time effect occurred: higher spermatozoa viability was observed after 1 hour of incubation (35.7%). Incubation time had no effect on apoptosis induction; otherwise, transfection rates presented higher amounts of exogenous DNA associated to spermatozoa after 2 hours of incubation. Amount, size and structure of DNA did not influence apoptosis and necrosis rates and DNA amount had no effect on transfection rates. However, size and structure effect were observed: 5.5kb sequence presented better transfection results using 500ng or 323ng. AT- rich sequence also presented better transfection rates than GC-rich and IN sequences. In conclusion, incubation time reduced spermatozoa viability, although enhanced the transfection levels. Spermatozoa transfection was not influenced by DNA sequence amount, but was influenced by the size and structure of the sequence. Apoptosis and necrosis of sperm cells were not influenced by amount, size and structure of exogenous DNA

A transferência gênica mediada por espermatozóide (TGME) por ser um método teoricamente simples e barato tem sido usada na produção de animais transgênicos. Entretanto, os resultados são variáveis e inconstantes. Para otimizar a TGME é necessário estabelecer o tempo, a quantidade e o tipo de DNA exógeno que será incubado com os espermatozóides. O estudo dos efeitos destes parâmetros na TGME foi o objetivo deste trabalho. Para avaliar o efeito da adição do DNA exógeno durante 0, 1, 2, 3 e 4 horas de incubação na viabilidade espermática foram utilizadas as sondas fluorescentes Hoechst 33342, Iodeto de propídeo, JC-1 e FITC-PSA. Na avaliação do efeito do tempo de incubação (60, 90 e 120 minutos) nos índices de apoptose e necrose, os espermatozóides foram corados com as sondas fluorescentes Yo-pro e Iodetoto de propídeo e avaliados pelo citômetro de fluxo, e os índices de transfecção avaliados pela PCR em tempo real. Para avaliar o efeito da quantidade e da seqüência de DNA exógeno foram construídas seqüências de tamanhos e estruturas diferentes. Para as seqüências de tamanhos diferentes, foram utilizadas seqüências de 2,2; 5,5 e 8,5kb nas concentrações de 500ng ou 130ng da seqüência de 2,2kb, 323ng da seqüência 5,5kb e 500ng da seqüência de 8,5kb. Para as seqüências de diferentes estruturas foram utilizadas seqüências ricas em oligonucleotideos AT, GC ou intermediária (IN). Foram avaliados o efeito das seqüências de diferentes tamanhos, estruturas e concentrações na indução de apoptose dos espermatozóides pelo citômetro de fluxo e os índices de transfecção por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que não houve efeito da adição do DNA exógeno sobre a viabilidade espermática. Entretanto, houve efeito do tempo de incubação onde foi observado maior viabilidade espermática com 1 hora de incubação (35,7%). O tempo de incubação não teve efeito na indução de apoptose, mas foi observado efeito no índice de transfecção apresentando maior quantidade de DNA exógeno associado aos espermatozóides às 2 horas de incubação. A quantidade, o tamanho e a estrutura de DNA exógeno não influenciaram o índice de apoptose, assim como a quantidade de DNA não teve efeito nos índice de transfecção. Entretanto, foi observado efeito do tamanho e da estrutura do DNA, no qual a seqüência de 5,5kb apresentou melhores resultados de transfecção tanto na quantidade de 500ng e 323ng. A seqüência rica em AT também apresentou melhor resultado de transfecção em relação à seqüência rica em GC e a intermediária. Em conclusão, o tempo de incubação reduziu a viabilidade espermática, porém, aumentou os índices de transfecção. A transfecção dos espermatozóides não foi influenciada pela quantidade da seqüência, mas foi influenciada pelo tamanho e estrutura da seqüência. A apoptose e necrose das células espermáticas não foram influenciadas pela quantidade, tamanho e estrutura do DNA exógeno / Sperm-mediated gene transfer (SMGT) has been used for transgenic animal production because it is a theoretically simple and low cost method. However, results are various and without repetibility. In order to optimize SMGT it is necessary to determine the time, amount and sequence of exogenous DNA for incubation with spermatozoa. The objective of this study was to verify the effect of these three parameters on SMGT. To assess the effect of exogenous DNA addition on sperm viability after 0, 1, 2, 3 and 4 hours of incubation, fluorescent probes Hoechst 33342, propidium iodide, JC-1 and FITC-PSA were used. To evaluate effects of incubation time (60, 90 and 120 minutes) on apoptosis and necrosis rates, spermatozoa were stained with fluorescent probes Yo-pro and propidium iodide and analyzed by flow cytometry; transfection rates were evaluated by real-time PCR. To assess the effect of exogenous DNA amount and sequence, different sized and structured sequences were made. Different sized sequences of 2.2, 5.5 and 8.5kb were used, with concentration of 500ng or 130ng of 2.2 sequence, 500 or 323ng of 5.5 sequence and 500ng of 8.5 sequence. Different structured sequences were rich in AT, GC or intermediate (IN). The effect of different size, structure and concentration on spermatozoa apoptosis induction were analyzed by flow cytometer and transfection rates by real-time PCR. Results show that no effects occurred on spermatozoa viability after exogenous DNA addition. However, time effect occurred: higher spermatozoa viability was observed after 1 hour of incubation (35.7%). Incubation time had no effect on apoptosis induction; otherwise, transfection rates presented higher amounts of exogenous DNA associated to spermatozoa after 2 hours of incubation. Amount, size and structure of DNA did not influence apoptosis and necrosis rates and DNA amount had no effect on transfection rates. However, size and structure effect were observed: 5.5kb sequence presented better transfection results using 500ng or 323ng. AT- rich sequence also presented better transfection rates than GC-rich and IN sequences. In conclusion, incubation time reduced spermatozoa viability, although enhanced the transfection levels. Spermatozoa transfection was not influenced by DNA sequence amount, but was influenced by the size and structure of the sequence. Apoptosis and necrosis of sperm cells were not influenced by amount, size and structure of exogenous DNA

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Augusto Christoffolete / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2014. / Desde o século XV, animais fazem parte da rotina na área da pesquisa, principalmente para estudos de doenças, e hoje em dia o modelo animal mais utilizado para estes estudos é o camundongo, tendo uma participação em mais de 90% das pesquisas em todo o mundo, sendo considerado como uma primeira via para definir funções de genes em mamíferos. Os camundongos são considerados os principais modelos nas técnicas de transgenia animal, porém estas técnicas ainda estão em desenvolvimento, uma vez que as metodologias hoje utilizadas para a geração de animais transgênicos ainda se encontram com uma taxa de sucesso considerada baixa e são dispendiosas, necessitando de muitas etapas. Uma das dificuldades é o contato com a membrana do óvulo devido a zona pelúcida, que é considerada uma barreira física. Vetores virais estão em evidência nas técnicas de transgenia animal, sendo o lentivírus o mais utilizado. Portanto, o objetivo deste projeto é estabelecer um protocolo para a integração de DNA exógeno em óvulos por infecção lentiviral, anteriormente a fertilização in vitro juntamente com a técnica de dissecção parcial da zona pelúcida. Como vetor foi utilizado um lentivírus com GFP em sua construção. Para ocorrer a fertilização in vitro, foram feitas coletas de óvulos em camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6, tratadas com injeções hormonais, e coletas de espermatozoides em machos desta mesma linhagem. Os óvulos obtidos foram divididos em grupos controle e com dissecção parcial da zona pelúcida, e estes foram subdivididos em grupos com e sem infecção lentiviral. Entre os grupos houve variação de 20% a 56,25% de embriões em estágio de duas células, e em alguns grupos foi possível alcançar o estágio de blastocisto eclodido. Porém não foi possível visualizar a emissão de fluorescência para confirmar a infecção lentiviral. Em conclusão as metodologias utilizadas tanto para a fertilização in vitro como para a dissecção parcial da zona pelúcida foram de sucesso. Porém a integração do DNA exógeno mostrou resultados não conclusivos, necessitando de estudos futuros. / Since the XV century, animals are used routinely in research, mainly for diseases studies, and nowadays the most used animal model is the mouse, which one has more than 90% of participation in researches around the world and it is considered the first track to define gene function in mammals. Mouse is the main model in transgenic techniques, however the methods available to generate transgenic animals still have a considerable low rate, and also it is expensive, requiring many degrees. An ordinary issue is the contact with the membrane of oocyte due zona pellucida that is considered a physical barrier. In transgenic animals technique, it is in evidence the utilization of viral vectors, and the most used are the lentiviruses. Therefore, the objective of this project is to establish a protocol for the integration of exogenous DNA by lentiviral infection into oocytes, before the in vitro fertilization, using the technique of partial dissection of the zona pellucida. It was used as a vector a lentivirus with GFP in your construction. For in vitro fertilization, were collected oocytes from C57Bl/6 mice, treated with hormones, and sperm from males of the same strain. The obtained oocytes were divided in control group and partial dissection of the zona pellucida group, and then subdivided in groups with and without lentiviral infection. Between the groups, was achieved 20% to 56,25% of two cells stage embryo, and hatched blastocysts stage were obtained at some groups. Therefore it was not possible to visualize florescence emission to confirm the lentiviral infection. In conclusion we have a practicable protocol for in vitro fertilization and partial dissection of the zona pellucida, reaching blastocysts stages in two groups. However the integration of exogenous DNA results were inconclusive, requiring further studies.

A espermatogênese em mamíferos é um processo sustentado pela auto-renovação e diferenciação de células-tronco espermatogoniais (SSCs). O estudo destas células oferece um excelente modelo para o melhor entendimento da biologia das células-tronco adultas e dos mecanismos que controlam as funções das SSCs. Além do potencial biomédico para estudos sobre infertilidade em diferentes espécies, as SSC possuem uma aplicação promissora na biotecnologia para a produção de animais transgênicos. Assim, o objetivo deste trabalho foi responder à pergunta: "SSCs bovinas LacZ+ podem integrar-se aos túbulos seminíferos de bezerros pré-púberes da raça Nelore após transplante autólogo?" Para isso, bezerros Nelore de 5 meses de idade (n=16) foram submetidos a uma orquiectomia unilateral para o isolamento de células espermatogoniais por digestão enzimática. Após o plaqueamento diferencial, as células foram transduzidas com um vetor lentiviral contendo a sequencia do gene marcador LacZ. Para isso, os animais foram aleatoriamente alocados em um dos quatro grupos experimentais: LacZ+/PKH26+, LacZ+/PKH26-, LacZ-/PKH26+, LacZ-/PKH26-. Após 60 h do início do cultivo in vitro, as células espermatogoniais foram transplantadas autologamente para o mediastino do testículo remanescente por injeção guiada por ultrassonografia. O testículo transplantado foi removido cirurgicamente após 45 dias e amostras de tecido foram submetidas a reação com x-gal para verificação da integração de células espermatogoniais transgênicas aos túbulos seminíferos. Células espermatogoniais foram isoladas e cultivadas in vitro com sucesso. Contudo, não foi possível obter uma população pura de SSCs por plaqueamento diferencial. Embora tenha sido eleito o transplante de células espermatogoniais e não de SSCs somente, sabe-se que também foram transplantadas SSCs, pois a caracterização das células isoladas demonstrou a expressão dos marcadores de SSCs ITGA6, GFRa-1, PGP 9.5 e afinidade pela lectina DBA. Crioseções de amostras de tecido testicular coradas com x-gal permitiram a observação de células transgênicas em 8 de 8 animais que receberam células LacZ+. Contudo, todas as células transgênicas observadas estavam situadas no interstício. Concluindo, não foi possível observar a integração das células transgênicas transplantadas aos túbulos seminíferos do testículo receptor após 45 dias do transplante autólogo utilizando a técnica de injeção intratesticular de células espermatogoniais LacZ+ no mediastino de bezerros pré-púberes da raça Nelore. / Mammalian spermatogenesis is sustained by self renewal and differentiation of spermatogonial stem cells (SSCs). The study of these cells provides a model to better understand adult stem cell biology and the mechanisms that control SSC functions. Besides the biomedical potential to perform studies of infertility in many species, SSCs hold a promising biotechnological application at animal transgenesis. In this manner, the goal of this study was to answer the question: "Can LacZ+ bovine SSCs be integrated into seminiferous tubule of prepubertal Nelore bulls subjected to autologous transplantation?" Hence, 5 months old bulls (n=16) were hemicastrated and spermatogonial cells were isolated by a two step enzymatic digestion procedure. After differential plating, cells were transduced with a lentivirus vector carrying the LacZ reporter gene sequence. Animals were randomly allocated in four experimental groups: LacZ+/PKH26+, LacZ+/PKH26-, LacZ-/PKH26+, LacZ-/PKH26-. After 60 h of the onset of in vitro culture, spermatogonial cells were autologously transplanted to the remaining testes by an ultrasound guided needle injection at the testis mediastinum. The transplanted testes were surgically removed after 45 days and testicular tissue samples were subjected to x-gal staining to assess the integration of transgenic spermatogonial cells to seminiferous tubule. Spermatogonial cells were successfully isolated and in vitro cultured. However, it was not possible to obtain a SSC enriched population of cells by differential plating. Although it was decided by the transplant of spermatogonial cells instead of pure SSCs only, it was detected the expression of SSC marker genes ITGA6, PGP9.5, GFR-1 and the affinity for DBA by the isolated cells. Cryosections of x-gal stained testicular tissue samples allowed the observation of transgenic cells in 8 out of 8 animals that received LacZ+ cells. However, all transgenic cells observed were located at the interstitial space. In conclusion, it was not possible to observe the integration of the transplanted transgenic cells into seminiferous tubule of prepubertal Nelore bulls subjected to autologous transplantation using an ultrasound guided needle injection at the testis mediastinum, after 45 days of transplant.

Ao longo da vida reprodutiva dos machos adultos, espermatozoides são formados pelas células-tronco espermatogoniais (SSCs, do inglês spermatogonial stem cells) por um processo conhecido como espermatogênese. O cultivo in vitro de SSCs abriu novas possibilidades para a transgenia, no entanto os protocolos requerem a adição de fatores de crescimento, o que encarece a manutenção dessas células por um tempo prolongado, fazendo da criopreservação de SSCs uma alternativa para esse problema. O fenótipo molecular de células-tronco espermatogoniais tem sido objeto de estudo nas últimas décadas. Uma das moléculas mais estudadas como marcador na caracterização de espermatogônias é a alfa-6 integrina. Baseado nestas informações, a seguinte hipótese foi proposta: SSCs que apresentam maior expressão de alfa-6 integrina são mais eficientes para modificações genéticas e colonização de túbulos seminíferos. Para testar essa hipótese, as SSCs murinas foram dissociadas de testículos de camundongos com 8 a 11 dias de idade. Essas células foram cultivadas in vitro, caracterizadas quanto sua morfologia, congeladas e incubadas com anticorpo anti-alfa-6 integrina para a purificação das SSCs por separação celular ativada por fluorescência (FACS). Células testiculares foram geneticamente modificadas com a inserção do gene marcador LacZ e o transplante através dos ductos eferentes foi padronizado. As Células germinativas testiculares foram dissociadas e cultivadas in vitro, porém a viabilidade foi aquém da desejada, inviabilizando as etapas de transformação, transplante e posterior avaliação histológica. Usando o marcador molecular alfa-6 integrina foi possível separar populações de células germinativas testiculares por FACS e a expressão gênica de ITGα6, GFRα1, Oct-4 e Thy-1 foi detectada por RT-PCR quantitativo. Em conclusão, não foi possível comprovar a eficiência de transdução e colonização em túbulos seminíferos por células-tronco espermatogoniais selecionadas com alfa-6 integrina. / Throughout the reproductive life of adult males, spermatozoa are formed from spermatogonial stem cells (SSCs) by a process known as spermatogenesis. The in vitro culture of SSCs created new possibilities for transgenesis, however the protocols require addition of growth factors, which increases the maintenance costs of these cells for a prolonged time, making of the cryopreservation of SSCs an alternative for this problem. The molecular phenotype of spermatogonial stem cells have been target of studies in recent decades. One of the most studied marker molecule in the characterization of spermatogonia is integrin alpha-6. Based on these informations, the following hypothesis was proposed: SSCs that show increased expression of integrin alpha-6 are more efficient for genetic modification and colonization of seminiferous tubules. In order to test this hypotesis, murine SSCs were dissociated from testes of 8 to 11 days old mice. These cells were in vitro cultured, characterized based on its morphology, frozen and incubated with anti-integrin alpha-6 antibody for the purification of SSCs by activated cell sorting fluorescence (FACS). Testicular cells were genetically modified with the insertion of the marker gene LacZ and transplantation through the efferent ducts was standardized. The testicular germ cells were dissociated and in vitro cultured, however viability was below expected, precluding the steps of transformation, transplantation and subsequent histological evaluation. Using molecular marker integrin alpha-6 it was possible to separate testicular germ cell populations by FACS and gene expression of ITGα6, GFRα1, Oct-4 and Thy-1was detected by quantitative RT-PCR. In conclusion, it was not possible to prove the efficiency of transduction and colonization in the seminiferous tubules by spermatogonial stem cells selected with alpha 6 integrin.

Ao longo da vida reprodutiva dos machos adultos, espermatozoides são formados pelas células-tronco espermatogoniais (SSCs, do inglês spermatogonial stem cells) por um processo conhecido como espermatogênese. O cultivo in vitro de SSCs abriu novas possibilidades para a transgenia, no entanto os protocolos requerem a adição de fatores de crescimento, o que encarece a manutenção dessas células por um tempo prolongado, fazendo da criopreservação de SSCs uma alternativa para esse problema. O fenótipo molecular de células-tronco espermatogoniais tem sido objeto de estudo nas últimas décadas. Uma das moléculas mais estudadas como marcador na caracterização de espermatogônias é a alfa-6 integrina. Baseado nestas informações, a seguinte hipótese foi proposta: SSCs que apresentam maior expressão de alfa-6 integrina são mais eficientes para modificações genéticas e colonização de túbulos seminíferos. Para testar essa hipótese, as SSCs murinas foram dissociadas de testículos de camundongos com 8 a 11 dias de idade. Essas células foram cultivadas in vitro, caracterizadas quanto sua morfologia, congeladas e incubadas com anticorpo anti-alfa-6 integrina para a purificação das SSCs por separação celular ativada por fluorescência (FACS). Células testiculares foram geneticamente modificadas com a inserção do gene marcador LacZ e o transplante através dos ductos eferentes foi padronizado. As Células germinativas testiculares foram dissociadas e cultivadas in vitro, porém a viabilidade foi aquém da desejada, inviabilizando as etapas de transformação, transplante e posterior avaliação histológica. Usando o marcador molecular alfa-6 integrina foi possível separar populações de células germinativas testiculares por FACS e a expressão gênica de ITGα6, GFRα1, Oct-4 e Thy-1 foi detectada por RT-PCR quantitativo. Em conclusão, não foi possível comprovar a eficiência de transdução e colonização em túbulos seminíferos por células-tronco espermatogoniais selecionadas com alfa-6 integrina. / Throughout the reproductive life of adult males, spermatozoa are formed from spermatogonial stem cells (SSCs) by a process known as spermatogenesis. The in vitro culture of SSCs created new possibilities for transgenesis, however the protocols require addition of growth factors, which increases the maintenance costs of these cells for a prolonged time, making of the cryopreservation of SSCs an alternative for this problem. The molecular phenotype of spermatogonial stem cells have been target of studies in recent decades. One of the most studied marker molecule in the characterization of spermatogonia is integrin alpha-6. Based on these informations, the following hypothesis was proposed: SSCs that show increased expression of integrin alpha-6 are more efficient for genetic modification and colonization of seminiferous tubules. In order to test this hypotesis, murine SSCs were dissociated from testes of 8 to 11 days old mice. These cells were in vitro cultured, characterized based on its morphology, frozen and incubated with anti-integrin alpha-6 antibody for the purification of SSCs by activated cell sorting fluorescence (FACS). Testicular cells were genetically modified with the insertion of the marker gene LacZ and transplantation through the efferent ducts was standardized. The testicular germ cells were dissociated and in vitro cultured, however viability was below expected, precluding the steps of transformation, transplantation and subsequent histological evaluation. Using molecular marker integrin alpha-6 it was possible to separate testicular germ cell populations by FACS and gene expression of ITGα6, GFRα1, Oct-4 and Thy-1was detected by quantitative RT-PCR. In conclusion, it was not possible to prove the efficiency of transduction and colonization in the seminiferous tubules by spermatogonial stem cells selected with alpha 6 integrin.

A baixa eficiência e a dificuldade de reprodução de resultados da técnica de transferência gênica mediada por espermatozoides (TGME) têm como possível explicação à ativação de endonucleases espermáticas. Assim, a inibição desta enzima poderia evitar a fragmentação de DNA (exógeno e genômico), possibilitando assim, o uso de maiores concentrações de DNA exógeno, aumentando a eficiência e garantindo a reprodutibilidade da técnica. O ácido aurintricarboxílico (ATA) é um inibidor geral de endonucleases (HALLICK et al., 1977), inclusive das endonucleases espermáticas (MAIONE et al., 1997; MAGNANO et al., 1998). Deste modo, o presente estudo objetivou avaliar a inibição das endonucleases espermáticas, pelo ácido aurintricarboxílico (ATA). Para isso, três experimentos foram realizados: 1) avaliar a inibição das endonucleases espermáticas pela adição do ácido aurintricarboxílico, após incubação com DNA exógeno; 2) verificar a eficiência do ATA na inibição de fragmentação de DNA genômico e 3) detectar o aumento nos índices de internalização após o uso de ATA. Para o primeiro experimento, um ensaio de digestão plasmidial com os plasmídeos PCX-EGFP e pmGENIE3 e três concentrações de ATA (10µM, 25µM e 50µM) foram testados. As digestões dos vetores plasmidiais ocorreram pela incubação dos plasmídeos PCX-EGFP e pmGENIE3, com e sem a presença de ATA, com extratos espermáticos. As incubações ocorreram durante 1 hora à 37ºC e os produtos foram analisados por eletroforese (2 horas, 100mV) em gel de agarose 0,7%. Os resultados foram avaliados em escala de cruzes, no qual 1 foi considerado digestão total dos plasmídeos e 3, a não digestão. Os resultados foram analisados em nível de significância de 5%. Os resultados demonstraram diferenças nas digestões dos dois vetores plasmidiais, sendo o pmGENIE3 mais susceptível à degradação pelo extrato espermático, demonstrando ausência de bandas em algumas replicatas (mediana=1). O PCX-EGFP apresentou inibição parcial da degradação já com 10µM de ATA. Já o pmGENIE só apresentou inibição da degradação com 25 ou 50µM de ATA. Assim a concentração utilizada nos experimentos consecutivos foi a de 50µM. Para o experimento 2, espermatozoides de camundongos da linhagem Bl-6/DBA (F1) foram incubados com duas concentrações (500 ou 1000ng) do plasmídeo PCX-EGFP, com ou sem pré-incubação com ATA. As incubações ocorreram durante 5 horas, em ar com 5% de CO2 à 37ºC. Assim, os espermatozoides foram submetidos ao teste de susceptibilidade à denaturação ácida e ao ensaio de cometa alcalino para verificar possível fragilidade da cromatina. Os dados demonstraram que o uso do ATA em espermatozoides murinos leva à fragilidade do genoma, independente de serem incubados com DNA exógeno e a concentração do mesmo. Além disso, foi possível verificar que pode existir um limiar de concentração ótima para que as endonucleases causem fragmentação do DNA cromossomal, o qual foi de 500ng. O uso de concentrações maiores, como 1000ng, pode ter agido como fator protetor ao DNA genômico, podendo este DNA exógeno ter sido o alvo primário das endonucleases, já que quando as amostras foram incubadas com essa concentração de plasmídeo, não houve altos índices de fragmentação no DNA endógeno. No experimento 3, espermatozoides de camundongos foram incubados com 500 ou 1000ng de PCX-EGFP/106 células, sendo ou não pré-incubados com ATA. O DNA genômico das células espermáticas foi extraído pelo método de fenol clorofórmio, diluído para concentração de 1ng/µl e submetidos à quantificação de DNA plasmidial pela técnica de quantificação absoluta em tempo real (qPCR). Os resultados demonstraram que o ATA não melhorou a eficiência de incorporação, já que tanto na concentração de 500 quanto na de 1000ng de DNA exógeno, a porcentagem foi menor (0,001% para os dois grupos) em relação aos grupos nos quais este não foi utilizado. Os grupos em que o ATA não foi utilizado não apresentaram diferença entre si demonstrando que a quantidade de 500ng de DNA exógeno foi suficiente na internalização deste ao espermatozoide, sendo a porcentagem de incorporação maior do que 1000ng (0,20% contra 0,10%). Contudo, o uso do inibidor de endonucleases, ao invés de aumentar os índices de incorporação apresentou resultados opostos, indicando que seu uso não trouxe melhorias para a técnica de TGME. / The low efficiency and low repeatability of sperm-mediated gene transfer (SMGT) could be due to the activation of sperm endonucleases. The inhibition of this enzyme would avoid genomic DNA fragmentation enabling the use of higher concentrations of exogenous DNA, increasing the efficiency and ensuring the reproducibility of this technique. Aurintricarboxilic acid (ATA) is a general inhibitor of endonucleases (HALLICK et al., 1977), including sperm endonucleases (MAIONE et al., 1997; MAGNANO et al., 1998). This study aimed to evaluate the inhibition of sperm endonucleases using the aurintricarboxilic acid (ATA). For that, three experiments were set: 1) evaluate the inhibition of sperm endonucleases by adding aurintricarboxilic acid after incubation with exogenous DNA, 2) study the inhibition efficiency of ATA in genomic DNA fragmentation and 3) detect exogenous DNA internalization after the use of ATA. For the first experiment, a plasmid digestion assay with pmGENIE3 and PCX-EGFP and three concentrations of ATA (10µM, 25µM and 50µM) were tested. The digestion of plasmid vector occurred by incubation of PCX-EGFP and pmGENIE3 with and without the presence of ATA with sperm extracts. Incubations took place for 1 hour at 37°C and the products were analyzed by electrophoresis (2 hours, 100mV) in 0,7% agarose gel. The results were evaluated on a cross scale whereas 1 was considered a total plasmid digestion and 3 no digestion. The results were analyzed with a significance level of 5%. The results show differences in the digestion of the two plasmid vectors, being pmGENIE3 more susceptible to degradation by sperm extract, demonstrating absence of bands in some replicates (median = 1). The PCX-EGFP showed a parcial inhibition of the degradation using 10µM ATA. PmGENIE3 presented inhibiting of degradation only using 25 or 50µM of ATA. Thus, the concentration used in the consecutives experiments was 50µM. For experiment 2, sperm from Bl-6/DBA (F1) mice strain were incubated with two concentrations (500 or 1000ng) of the PCX-EGFP plasmid, with and without pre-incubation with ATA. Incubation took place for 5 hours, with 5% CO2 in air, at 37°C. Sperm samples were subjected to acid denaturation susceptibility test and alkaline comet assay to check for possible chromatin fragility. The data showed that the use of ATA in murine sperm leads to a fragility of their genome, independently of the incubation with exogenous DNA and its concentration. Result showed that there might be a threshold concentration for chromosomal DNA fragmentation caused by endonucleases, which was 500ng of plasmid. The use of higher concentrations, as 1000ng, may be a protective factor for genomic DNA integrity, since exogenous DNA seems to be the primary target of endonucleases, showed by, lower DNA fragmentation levels. In experiment 3, sperm were incubated with 500 or 1000ng PCX-EGFP/106 cells, pre-incubated or not with ATA. Genomic DNA was extracted by phenol chloroform method, diluted to concentrations of 1ng/µl and subjected to quantification of plasmid DNA insertions by absolute quantification in real-time PCR (qPCR). The results showed that ATA did not improve the efficiency of DNA internalization, whereas both concentration of 500 and 1000ng presented a lower percentage of exogenous DNA integration (0.001% in both groups) compared with the groups in which ATA was not used. The groups without ATA did not differ indicating that the amount of 500ng of DNA was able to integrate exogenous DNA to sperm, and have higher percentage of incorporation compared to 1000ng (0,20% versus 0,10%). Thereby, the use of an endonuclease inhibitor instead of increasing integration indexes showed opposite results, indicating that its use did not bring improvements to the SMGT technique.

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A baixa eficiência e a dificuldade de reprodução de resultados da técnica de transferência gênica mediada por espermatozoides (TGME) têm como possível explicação à ativação de endonucleases espermáticas. Assim, a inibição desta enzima poderia evitar a fragmentação de DNA (exógeno e genômico), possibilitando assim, o uso de maiores concentrações de DNA exógeno, aumentando a eficiência e garantindo a reprodutibilidade da técnica. O ácido aurintricarboxílico (ATA) é um inibidor geral de endonucleases (HALLICK et al., 1977), inclusive das endonucleases espermáticas (MAIONE et al., 1997; MAGNANO et al., 1998). Deste modo, o presente estudo objetivou avaliar a inibição das endonucleases espermáticas, pelo ácido aurintricarboxílico (ATA). Para isso, três experimentos foram realizados: 1) avaliar a inibição das endonucleases espermáticas pela adição do ácido aurintricarboxílico, após incubação com DNA exógeno; 2) verificar a eficiência do ATA na inibição de fragmentação de DNA genômico e 3) detectar o aumento nos índices de internalização após o uso de ATA. Para o primeiro experimento, um ensaio de digestão plasmidial com os plasmídeos PCX-EGFP e pmGENIE3 e três concentrações de ATA (10µM, 25µM e 50µM) foram testados. As digestões dos vetores plasmidiais ocorreram pela incubação dos plasmídeos PCX-EGFP e pmGENIE3, com e sem a presença de ATA, com extratos espermáticos. As incubações ocorreram durante 1 hora à 37ºC e os produtos foram analisados por eletroforese (2 horas, 100mV) em gel de agarose 0,7%. Os resultados foram avaliados em escala de cruzes, no qual 1 foi considerado digestão total dos plasmídeos e 3, a não digestão. Os resultados foram analisados em nível de significância de 5%. Os resultados demonstraram diferenças nas digestões dos dois vetores plasmidiais, sendo o pmGENIE3 mais susceptível à degradação pelo extrato espermático, demonstrando ausência de bandas em algumas replicatas (mediana=1). O PCX-EGFP apresentou inibição parcial da degradação já com 10µM de ATA. Já o pmGENIE só apresentou inibição da degradação com 25 ou 50µM de ATA. Assim a concentração utilizada nos experimentos consecutivos foi a de 50µM. Para o experimento 2, espermatozoides de camundongos da linhagem Bl-6/DBA (F1) foram incubados com duas concentrações (500 ou 1000ng) do plasmídeo PCX-EGFP, com ou sem pré-incubação com ATA. As incubações ocorreram durante 5 horas, em ar com 5% de CO2 à 37ºC. Assim, os espermatozoides foram submetidos ao teste de susceptibilidade à denaturação ácida e ao ensaio de cometa alcalino para verificar possível fragilidade da cromatina. Os dados demonstraram que o uso do ATA em espermatozoides murinos leva à fragilidade do genoma, independente de serem incubados com DNA exógeno e a concentração do mesmo. Além disso, foi possível verificar que pode existir um limiar de concentração ótima para que as endonucleases causem fragmentação do DNA cromossomal, o qual foi de 500ng. O uso de concentrações maiores, como 1000ng, pode ter agido como fator protetor ao DNA genômico, podendo este DNA exógeno ter sido o alvo primário das endonucleases, já que quando as amostras foram incubadas com essa concentração de plasmídeo, não houve altos índices de fragmentação no DNA endógeno. No experimento 3, espermatozoides de camundongos foram incubados com 500 ou 1000ng de PCX-EGFP/106 células, sendo ou não pré-incubados com ATA. O DNA genômico das células espermáticas foi extraído pelo método de fenol clorofórmio, diluído para concentração de 1ng/µl e submetidos à quantificação de DNA plasmidial pela técnica de quantificação absoluta em tempo real (qPCR). Os resultados demonstraram que o ATA não melhorou a eficiência de incorporação, já que tanto na concentração de 500 quanto na de 1000ng de DNA exógeno, a porcentagem foi menor (0,001% para os dois grupos) em relação aos grupos nos quais este não foi utilizado. Os grupos em que o ATA não foi utilizado não apresentaram diferença entre si demonstrando que a quantidade de 500ng de DNA exógeno foi suficiente na internalização deste ao espermatozoide, sendo a porcentagem de incorporação maior do que 1000ng (0,20% contra 0,10%). Contudo, o uso do inibidor de endonucleases, ao invés de aumentar os índices de incorporação apresentou resultados opostos, indicando que seu uso não trouxe melhorias para a técnica de TGME. / The low efficiency and low repeatability of sperm-mediated gene transfer (SMGT) could be due to the activation of sperm endonucleases. The inhibition of this enzyme would avoid genomic DNA fragmentation enabling the use of higher concentrations of exogenous DNA, increasing the efficiency and ensuring the reproducibility of this technique. Aurintricarboxilic acid (ATA) is a general inhibitor of endonucleases (HALLICK et al., 1977), including sperm endonucleases (MAIONE et al., 1997; MAGNANO et al., 1998). This study aimed to evaluate the inhibition of sperm endonucleases using the aurintricarboxilic acid (ATA). For that, three experiments were set: 1) evaluate the inhibition of sperm endonucleases by adding aurintricarboxilic acid after incubation with exogenous DNA, 2) study the inhibition efficiency of ATA in genomic DNA fragmentation and 3) detect exogenous DNA internalization after the use of ATA. For the first experiment, a plasmid digestion assay with pmGENIE3 and PCX-EGFP and three concentrations of ATA (10µM, 25µM and 50µM) were tested. The digestion of plasmid vector occurred by incubation of PCX-EGFP and pmGENIE3 with and without the presence of ATA with sperm extracts. Incubations took place for 1 hour at 37°C and the products were analyzed by electrophoresis (2 hours, 100mV) in 0,7% agarose gel. The results were evaluated on a cross scale whereas 1 was considered a total plasmid digestion and 3 no digestion. The results were analyzed with a significance level of 5%. The results show differences in the digestion of the two plasmid vectors, being pmGENIE3 more susceptible to degradation by sperm extract, demonstrating absence of bands in some replicates (median = 1). The PCX-EGFP showed a parcial inhibition of the degradation using 10µM ATA. PmGENIE3 presented inhibiting of degradation only using 25 or 50µM of ATA. Thus, the concentration used in the consecutives experiments was 50µM. For experiment 2, sperm from Bl-6/DBA (F1) mice strain were incubated with two concentrations (500 or 1000ng) of the PCX-EGFP plasmid, with and without pre-incubation with ATA. Incubation took place for 5 hours, with 5% CO2 in air, at 37°C. Sperm samples were subjected to acid denaturation susceptibility test and alkaline comet assay to check for possible chromatin fragility. The data showed that the use of ATA in murine sperm leads to a fragility of their genome, independently of the incubation with exogenous DNA and its concentration. Result showed that there might be a threshold concentration for chromosomal DNA fragmentation caused by endonucleases, which was 500ng of plasmid. The use of higher concentrations, as 1000ng, may be a protective factor for genomic DNA integrity, since exogenous DNA seems to be the primary target of endonucleases, showed by, lower DNA fragmentation levels. In experiment 3, sperm were incubated with 500 or 1000ng PCX-EGFP/106 cells, pre-incubated or not with ATA. Genomic DNA was extracted by phenol chloroform method, diluted to concentrations of 1ng/µl and subjected to quantification of plasmid DNA insertions by absolute quantification in real-time PCR (qPCR). The results showed that ATA did not improve the efficiency of DNA internalization, whereas both concentration of 500 and 1000ng presented a lower percentage of exogenous DNA integration (0.001% in both groups) compared with the groups in which ATA was not used. The groups without ATA did not differ indicating that the amount of 500ng of DNA was able to integrate exogenous DNA to sperm, and have higher percentage of incorporation compared to 1000ng (0,20% versus 0,10%). Thereby, the use of an endonuclease inhibitor instead of increasing integration indexes showed opposite results, indicating that its use did not bring improvements to the SMGT technique.