Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-06-06T15:05:41Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3560441 bytes, checksum: 82236d1734bfb37faef9de46c5042ddf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-06T15:05:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3560441 bytes, checksum: 82236d1734bfb37faef9de46c5042ddf (MD5) Previous issue date: 2015-10-08 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A encapsulação de moléculas bioativas é utilizada há décadas pelas industrias de alimentos e representa uma real oportunidade de desenvolvimento de produtos inovadores. Dada a sua versatilidade funcional, as proteínas do leite, em particular as proteínas do soro de leite, tem sido utilizadas para fins de encapsulação por meio de diferentes técnicas. Complementarmente, estudos recentes mostraram a habilidade de proteínas alimentares de carga oposta de se co-associar formando micro-esferas através da coacervação complexa. Compreender as forças que governam o processo de coacervação de hetero-proteínas e o efeito da presença de pequenos ligantes (bioativos) são pré-requisitos para o uso de coacervados complexos de hetero-proteínas como agentes de encapsulação. Neste contexto, o objetivo do meu projeto de tese foi entender o mecanismo de coacervação complexa entre β-lactoglobulina (β-LG) e lactoferrina (LF) na ausência ou na presença de pequenos ligantes. As condições ótimas para a coacervação entre β-LG e LF foram identificadas como sendo entre os pH 5.4 – 6.0 e em presença de um excesso molar de β-LG. Interessantemente, LF demonstrou uma seletividade de coacervação com a β-LG A, a isoforma ligeiramente mais eletronegativa. A nivel molecular, a presença de dois sítios de interação da β-LG com a LF foram evidenciados. Em complemento, hetero-complexos como o pentâmero LF(β-LG 2 ) 2 e outros complexos maiores (LFβ- LG 2 ) n foram identificados como constituintes da fase coacervada. Para avaliar o efeito da presença de pequenos ligantes na coacervação complexa entre β-LG e LF, foram usados modelos de moléculas hidrofóbica (ANS) e hidrofílica (ácido fólico). Embora nas condições experimentais os pequenos ligantes não tenham interagido com a β-LG, ambos interagiram com a LF induzindo sua auto-associação em nano- partículas. Concentrações relativamente elevadas de pequenos ligantes afetaram a interação entre as duas proteínas levando a uma transição entre os regimes de coacervação e agregação. / Le bénéfice de l’encapsulation des molécules bioactives a séduit les industries agroalimentaires depuis plusieurs décennies et constitue toujours un levier de développement pour des produits innovants. Plus récemment des études ont montré la capacité de protéines alimentaires de charge opposée à s’assembler en microsphères par coacervation complexe. La compréhension des forces gouvernant le processus de coacervation complexe entre protéines et l’influence exercée par la présence de petits ligands (bioactifs) demeurent des prérequis pour l’utilisation des coacervats complexes de protéines comme agent d’encapsulation. Dans ce contexte, l’objectif de mon projet de thèse a été de comprendre le mécanisme de coacervation complexe entre une protéine chargée négativement, la β-lactoglobuline (β-LG), et une protéine chargée positivement, la lactoferrine (LF), issues du lactosérum en absence et en présence de petits ligands. Les conditions optimales de coacervation entre la β-LG et la LF ont été définies entre pH 5.4 et 6.0 ainsi qu’en présence d’un excès de β-LG. La LF a présenté une coacervation préférentielle avec le variant A de la β-LG qui se distingue du variant B par la substitution de 2 acides aminés. Au niveau moléculaire, deux sites de fixation de la β-LG sur la LF ont été identifiés. En outre, par la mesure d’une part des coefficients de diffusion rotationnel et d’autre part de la cinétique de diffusion des entités moléculaires constituant les coacervats, il est suggéré que ces derniers sont formés à partir de β-LG libre, de pentamère, LF(β- LG 2 ) 2 , ainsi que des entités plus larges, (LFβ-LG 2 ) n . Afin d’évaluer l’effet de la présence de petits ligands sur la coacervation complexe entre la β-LG et la LF, des ligands modèles, l’un hydrophobe (ANS), l’autre hydrophile (acide folique) ont été utilisés. Dans les conditions expérimentales testées ces deux ligands n’ont pas d’affinité pour la β-LG, mais après interaction avec la LF ils sont capables d’induire son auto-association en nanoparticules. En concentrations élevées de ligands, la coacervation complexe entre la β-LG et la LF est perturbée et une transition vers un régime d’agrégation est observée. / Encapsulation of bioactives has been used by the food industries for decades and represents a great potential for the development of innovative products. Given their versatile functional properties, milk proteins in particular from whey have been used for encapsulation purposes using several encapsulation techniques. In parallel, recent studies showed the ability of oppositely charged food proteins to co-assemble into microspheres through complex coacervation. Understanding the driving forces governing heteroprotein coacervation process and how it is affected by the presence of ligands (bioactives) is a prerequisite to use heteroprotein coacervates as encapsulation device. In this context, the objective of my thesis work was to understand the mechanism of complex coacervation between β-lactoglobulin (β-LG) and lactoferrin (LF) in the absence and presence of small ligands. The conditions of optimal β-LG - LF coacervation were found at pH range 5.4-6 with a molar excess of β-LG. Remarkably, LF showed selective coacervation with β-LG A, the slightly more negative isoform. At molecular level, the presence of two binding sites on LF for β-LG was evidenced. Moreover, the heterocomplexes such as pentamers LF(β-LG 2 ) 2 and quite large complexes (LFβ-LG 2 )n were identified as the constituent molecular species of the coacervate phase. To evaluate the β-LG - LF complex coacervation in the presence of small ligands, models of hydrophobic (ANS) and hydrophilic molecules (folic acid) were used. Although under the experimental conditions tested the small ligands did not interact with β-LG, both interacted with LF inducing its self- association into nanoparticles. High relative concentrations of small ligands affected the interaction between the two proteins leading to a transition from coacervation to aggregation regime.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-01-11T16:00:18Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2026893 bytes, checksum: 7c9a906256e212edfe5980e7d8f3d91b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-11T16:00:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2026893 bytes, checksum: 7c9a906256e212edfe5980e7d8f3d91b (MD5) Previous issue date: 2017-07-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Hidroxiapatita (HA) foi sintetizada em meio aquoso com recipiente imerso em banho ultrassônico e testada para atuar como adsorvente das proteínas do soro de leite α- lactoalbumina (ALA) e β-lactoglobulina (BLG). Inicialmente foram realizadas análises para caracterizar o adsorvente. A relação cálcio/fosfato da HA sintetizada foi de 1,57. A partir da difração de raios X, verificou-se que o material apresentava elevada pureza, baixa cristalinidade (9 %) e cristais com tamanho médio de 27 nm. A espectroscopia de infravermelho revelou: (1) picos característicos de HA para o íon PO 43− nas regiões de 561, 1028 e 603 cm -1 e para o íon OH - nas regiões de 1630 e 3068 cm -1 , bem como (2) picos de baixa intensidade em 880 e 1049 cm -1 referente ao íon CO 32− , associado a impurezas. Análises de espectroscopia Raman revelaram picos característicos para grupos PO 4 nas regiões de 430, 590, 962 e 1047 cm- 1 . Por meio do Potencial Zeta, verificou-se a interação entre as HAs comercial e sintetizada e as proteínas ALA e BLG comerciais. Objetivando compreender melhor o comportamento adsortivo da HA, utilizou-se ALA e BLG comerciais para a realização de experimentos cinéticos, nos valores de pH 3,4; 6,0; 7,0 e 8,0, e isotérmicos, em pH 3,4 e 6,0, nas temperaturas de (5, 15, 25, 35 e 45 °C). Os modelos matemáticos de pseudo- primeira ordem, pseudo-segunda ordem e de difusão de partículas foram ajustados aos dados cinéticos. O modelo de pseudo-segunda ordem foi o que levou ao melhor ajuste para todos os tratamentos. Os modelos isotérmicos de Langmuir e Freundlich ajustaram-se aos dados de equilíbrio obtidos em pH 6,0, no entanto, para o pH 3,4 os modelos não levaram a bons ajustes. A precipitação seletiva utilizando citrato de sódio (20 g∙L -1 ) foi empregada para separar as proteínas ALA e BLG do soro de leite doce. O resultado foi um aumento da relação ALA/BLG de 0,34 no soro para 9,27 no precipitado ressuspendido. Em relação à BLG, ocorreu um aumento de 2,93 no soro para 22,60 da relação BLG/ALA na fase fluida. Em seguida, empregou-se a adsorção em HA para isolar as proteínas ALA e BLG. A recuperação de BLG na fase fluida foi semelhante para a HA comercial e a sintetizada. No entanto, para a dispersão em que o precipitado foi ressuspendido, a adsorção de ALA foi superior para a HA sintetizada comparado à HA comercial. Para a dessorção das proteínas, as melhores condições foram obtidas em tampão fosfato de sódio 0,4 mol∙L -1 em pH 6,8 a 50 °C sob agitação (50 rpm/1 h), em que, obteve-se rendimento superior a 80 % (m/v) para todos os tratamentos. Ao final do processo de separação, recuperou-se 26 e 53 % (m/v) da ALA presente, inicialmente, no soro de leite utilizando as HAs comercial e sintetizada, respectivamente. Em relação à BLG, a recuperação foi 65 e 70 % (m/v) utilizando as HAs comercial e sintetizada, respectivamente. As informações contidas neste trabalho poderão auxiliar no desenvolvimento de processos em que se pretende utilizar a HA como adsorvente para as proteínas ALA e BLG. / Hydroxyapatite (HA) was synthesized in aqueous medium in the presence of ultrasound and tested to act as an adsorbent of whey proteins α-lactoalbumin (ALA) and β-lactoglobulin (BLG). Initially, analyzes were performed to characterize the adsorbent. The calcium/fosfate ratio of synthesized HA was 1.57, below the stoichiometric HA value that is 1.67. From the X-ray diffraction analyzes, it was found that the material had high purity, low crystallinity (9%) and crystals with an average size of 27 nm. Infrared spectroscopy revealed: (1) peaks for the PO 43− ion in the regions of 561, 1028 and 603 cm -1 , for the OH - ion 1630 and 3068 cm -1 and (2) presence of a low-intensity peak at 880 and 1049 cm -1 for the CO 32− ion. Raman spectroscopy analyzes revealed characteristic peaks for PO 4 groups in the 430, 590, 962 and 1047 cm -1 regions. The characterization analyzes showed that the proposed process for HA synthesis produces a material with high purity and low crystallinity. Through the Zeta Potential was verified the interaction between the commercial and synthesized HAs and the ALA and BLG proteins. To understand the adsorptive behavior of HA and the proteins ALA and BLG, experiments were performed at pH 3.4; 6.0; 7.0 and 8.0 for the kinetic experiments; and (5, 15, 25, 35 and 45 °C) at pH 3.4 and 6.0 for the isothermal curves. The kinetic models of pseudo-first order, pseudo-second order and particle diffusion were fitted to the data. The pseudo-second order model obtained the best fit for all treatments, indicating the occurrence of chemisorption. The Langmuir and Freundlich isothermal models adjusted to the equilibrium data obtained at pH 6.0, however, at pH 3.4 the models did not adjust. Selective precipitation was employed to separate the ALA and BLG proteins present in the sweet whey. The result was an increase in the ALA/BLG ratio of 0.34 in serum to 9.27 in the resuspended precipitate. For the BLG, there was an increase from 2.93 to 22.60 in the BLG/ALA ratio in the fluid phase. Then, BLG adsorption was applied to the fluid phase with similar results for commercial and synthesized HA. For the resuspended precipitate, the ALA adsorption was higher for the synthesized compared to the commercial HA. For proteins desorption, 0.4 mol.L -1 of sodium phosphate buffer at pH 6.8 at 50 °C under agitation (50 rpm/1 h) was used, yield greater than 80% (m /v) was obtained for all treatments. At the end of the process, 26 and 53% (m/v) of ALA, present initially in the whey, was recovered using commercial and synthesized HAs, respectively. For BLG, the recovery was 65 and 70% (m/v) using the commercial and synthesized HAs, respectively. The information contained in this work can help in the development of processes in which HA is to be used as an adsorbent for ALA and BLG proteins.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-11-10T17:53:57Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 857750 bytes, checksum: 5be91164a48525eb79a1b72c200dea7f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-10T17:53:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 857750 bytes, checksum: 5be91164a48525eb79a1b72c200dea7f (MD5) Previous issue date: 2005-02-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A cromatografia de troca iônica é uma técnica que há décadas vem sendo estudada, mas apenas recentemente começou a ser amplamente difundida na purificação de macromoléculas. Para se conhecer os fundamentos e aplicações desta técnica, foi realizada uma revisão sobre o assunto, no formato de artigo, enfocando principalmente a purificação de proteínas. Foram abordados tópicos como a estrutura protéica, o mecanismo de troca iônica, os diversos fatores que influenciam este processo e apresentados exemplos de aplicação da cromatografia de troca iônica na purificação de proteínas. Para que esses processos sejam economicamente viáveis e operacionalmente seguros devem ser otimizados, sendo importante o conhecimento do equilíbrio termodinâmico do processo. Foram determinadas as isotermas de adsorção para as proteínas α-lactoalbumina (α-la) e β-lactoglobulina (β-lg) em uma coluna de troca iônica em sistemas monocomponentes, a quatro temperaturas (283.15 K, 293.15 K, 303.15 K e 313.15 K). Dentre os cinco diferentes tipos de modelos de isotermas ajustados, os modelos de Langmuir, Jovanovic e Toth apresentaram os melhores resultados. A análise termodinâmica baseada na equação não-linear de van t Hoff demonstrou que o processo de troca iônica para as duas proteínas nas condições estudadas é endotérmico, entropicamente dirigido, ocorrendo de maneira espontânea (∆G0ad < 0) com o aumento da temperatura. Por fim, foram estudados sistemas multicomponentes formados por α-la e β-lg em diferentes proporções (1:1, 1:3, 3:1 e 1:2). Foi proposta uma modificação no método de análise frontal empregado para a determinação das isotermas de adsorção competitivas. Ao invés do método proposto por Jacobson et al. (1987) para sistemas multicomponentes, foi utilizado o método proposto por Jacobson et al. (1984) para sistemas monocomponentes, aplicado simultaneamente para os diferentes compostos do sistema. O modelo competitivo de Langmuir se ajustou satisfatoriamente aos dados experimentais, comprovando que a alternativa proposta pode ser aplicada a sistemas multicomponentes formados por macromoléculas. / The ion-exchange chromatography is a technique that has been studied at a long time, but just now began to be diffused to macromolecules purification. To a better understanding of this technique, a review was made, focusing mainly the purification of proteins. It was seen topics as protein structure, the mechanism of ion- exchange, the factors that influence this process and many examples of application of ion-exchange chromatography in the proteins purification. For these processes to be economically viable and operationally safes, they should be optimized, being important the knowledge of the thermodynamic equilibrium of the process. It was obtained the adsorption isotherms of α-lactalbumin (α-la) and β-lactoglobulin (β-lg) presents in single-component systems, in a ion-exchange column at four temperatures (283.15 K, 293.15 K, 303.15 K and 313.15 K). The adjustment of five different isotherm models was verified, and the Langmuir, Jovanovic and Toth models presented the best results. Thermodynamic analysis based on the non-linear van't Hoff equation demonstrated that the process of ion-exchange of both proteins in the studied conditions is endothermic, entropically driven, occurring spontaneously (∆G0ad < 0) with the increase of temperature. Finally, it was studied multicomponent systems formed for α-la and β-lg at different proportions (1:1, 1:3, 3:1 and 1:2). A modification was proposed in the frontal analysis method used for the determination of competitive adsorption isotherms. Instead of the method proposed by Jacobson et al. (1987) for multicomponent systems, the method proposed by Jacobson et al. (1984) for single-component systems was used, applied simultaneously for each compound of the complex system. The competitive Langmuir model was adjusted satisfactorily to the experimental data, showing that this alternative method can be applied to multicomponent systems formed by macromolecules.

O presente trabalho procurou investigar influência da presença de proteínas do soro do leite na atividade antioxidante da vanilina e ácido vanílico frente ao radical DPPH&bull; e a espécie de ferro hipervalente ferrilmioglobina MbFe(IV)=O em meio simulando o trato gastrointestinal. A constante de associação (KA) entre a vanilina e a &beta;-lactoglobulina (BLG) foi determinada utilizando-se as técnicas de espectroscopia de emissão molecular (KA = 400 &plusmn; 12&middot;102 L&middot;mol-1) e microcalorimétria (KA = 5,6&plusmn;0,3&middot;102 L&middot;mol-1) ambas em tampão fosfato com CH+ = 10-7,4 mol&middot;L-1 e força iônica 0,32 (NaCl). Para a interação entre a vanilina e albumina de soro bovino (BSA) encontrou-se o valor de 340 &plusmn; 13&middot;102 L&middot;mol-1 em meio de tampão fosfato com CH+ = 10-6,4 mol&middot;L-1 e força iônica 0,32 (NaCl), obtido por espectroscopia de emissão molecular. Constatou-se pela técnica de microcalorimetria que a complexação possui caráter exotérmico e as contribuições de interações hidrofóbicas para a complexação são fracas. A reatividade da vanilina e ácido vanílico com o radical DPPH&bull; foi investigada em meio de emulsão aquosa Tween-20&reg; com CH+ = 10-2,0 mol&middot;L-1. Os resultados obtidos demonstraram que a vanilina não pode ser considerada um bom antioxidante frente ao DPPH&bull; (k298 = 1,42&plusmn;0,04&middot;10-1 L&middot;mol-1&middot;s-1), no entanto, o ácido vanílico apresentou maior reatividade frente ao radical DPPH&bull; (k298 = 17,1&plusmn;0,3 &middot;10-1 L&middot;mol-1&middot;s-1). A presença das proteínas BLG e BSA nas reações de redução do radical DPPH&bull; pela vanilina e ácido vanílico conduziu a um efeito antagônico na constante de velocidade de reação. Os parâmetros termodinâmicos do estado de transição da reação com DPPH&bull; apresentaram valores relativamente altos de entalpia de ativação e moderados valores de entropia de ativação: &Delta;H&Dagger;298 = 34,0 &plusmn; 0,3 kJmol-1 para a vanilina e 46,2 &plusmn; 0,1 kJmol-1 no complexo com BSA e 51,0 &plusmn; 0,6 kJ&middot;mol-1 no complexo com BLG, valores negativos de entropia &Delta;S&Dagger;298 = -147,4 &plusmn; 0,9 J&middot;mol-1&middot;K-1, -105,3 &plusmn; 0,5 J&middot;mol-1&middot;K-1 e -90 &plusmn; 2 J&middot;mol-1&middot;K-1 respectivamente. Os valores de entalpia e entropia de ativação encontrados para o ácido vanílico foram: &Delta;H&Dagger;298= 19,6 &plusmn; 0,2 kJ&middot;mol-1, 10,2 &plusmn; 0,03 kJ&middot;mol-1 e 37,6 &plusmn; 0,3 kJ&middot;mol-1 para os complexos com BSA e BLG respectivamente e valores negativos de entropia &Delta;S&Dagger;298=-174 &plusmn; 0,5 J&middot;mol-1&middot;K-1, -206,0 &plusmn; 0,1 J&middot;mol-1&middot;K-1 e -116 &plusmn; 1 J&middot;mol-1&middot;K-1. A partir destes valores de entalpia e entropia de ativação o mecanismo de redução do radical DPPH&bull; foi atribuído a um processo de abstração de átomo de hidrogênio (HAT/PCET). A reação de desativação da espécie MbFe(IV)=O pela vanilina apresentou constante de velocidade de k298 = 57&plusmn;1 L&middot;mol-1&middot;s-1 sendo superior quando comparada ao ácido vanílico k298 = 15&plusmn;1 L&middot;mol-1&middot;s-1, fato este atribuído as cargas totais, negativa, do redutor e da proteína nas presentes condições experimentais. Observa-se um efeito antagônico da complexão da vanilina pelas proteínas na atividade antioxidante frente à ferrilmioglobina, onde o efeito reduziu, mas não impediu a reação de transferência de elétrons por esfera-externa à longa distância. Em contrapartida, a presença das proteínas BLG e BSA não influenciaram a reatividade do ácido vanílico frente à espécie MbFe(IV)=O. Os parâmetros de ativação encontrados para a reação de redução da MbFe(IV)=O com a vanilina apresentaram valores de &Delta;H&Dagger;298 = 58,8 &plusmn; 0,3 kJmol-1 e &Delta;S&Dagger;298 = -14 &plusmn; 1 J&middot;mol-1&middot;K-1, &Delta;H&Dagger;298 = 45,5 &plusmn; 0,3 kJ&middot;mol-1 e &Delta;S&Dagger;298 = -60 &plusmn; 1 J &middot;mol-1&middot;K-1, &Delta;H&Dagger;298 = 68,6 &plusmn; 0,4 kJ&middot;mol-1 e &Delta;S&Dagger;298 = 17 &plusmn; 1 J &middot;mol-1&middot;K-1 para vanilina \"livre\", complexo com BSA, e complexo com BLG respectivamente. Para a redução com ácido vanílico foram determinados os seguintes valores de entalpia e entropia de ativação: &Delta;H&Dagger;298 = 41,8 &plusmn; 0,2 kJ&middot;mol-1 e &Delta;S&Dagger;298 = -82,4 &plusmn; 0,7 J&middot;mol-1&middot;K-1, &Delta;H&Dagger;298 = 37,7 &plusmn; 0,3 kJ&middot;mol-1 e &Delta;S&Dagger;298 = -96 &plusmn; 1,0 J&middot;mol-1&middot;K-1, &Delta;H&Dagger;298 = 53,5 &plusmn; 0,2 kJ&middot;mol-1 e &Delta;S&Dagger;298 = -44 &plusmn; 1,0 J&middot;mol-1&middot;K-1 para vanilina \"livre\", complexo com BSA, e complexo com BLG respectivamente. / The present study evaluate the influence of the presence of whey proteins in the antioxidant activity of vanillin and vanillic acid towards the DPPH&bull; radical species and the hypervalent iron species ferrylmyoglobin, MbFe(IV)=O under conditions simulating the gastrointestinal tract. The association constant (KA) between vanillin and &beta;- lactoglobulin (BLG) was obtained using molecular emission spectroscopy (KA = 400 &plusmn; 12&middot;102 L&middot;mol-1) and microcalorimetric titration (KA = 5.6&plusmn;0.3&middot;102 L&middot;mol-1) both in phosphate buffer CH + = 10-7.4 mol&middot;L -1 and ionic strength 0.32 (NaCl). For the interaction between vanillin and bovine serum albumin (BSA) it was founded value of 340 &plusmn; 13&middot;102 L&middot;mol-1 in phosphate buffer with CH+ = 10-6,4 mol&middot;L-1 and ionic strength 0.32 (NaCl), as obtained by molecular emission spectroscopy. It was founded by microcalorimetry tritation that the complexation has a exothermic character and the contributions of hydrophobic interactions for complexation are weak. The reactivity of vanillin and vanillic acid toward DPPH&bull; radical was studied in aqueous emulsion using Tween-20&reg; with CH + = 10-2.0 mol&middot;L-1. The results show that vanillin can not be considered a good antioxidant (k298 = 1.42&plusmn;0.04&middot;10-1 L&middot;mol-1&middot;s-1), however vanillic acid show higher reactivity than vanillin towards the radical DPPH&bull; (k298 = 17.1&plusmn;0.3&middot;10-1 L&middot;mol-1&middot;s-1). The presence of the proteins BLG and BSA in the reduction reactions of the DPPH&bull; radical by vanillin and vanillic acid led to an antagonic effect in the reaction rate constant. The thermodynamic parameters for the transition state of the reaction with DPPH&bull; showed relatively high values of enthalpy of activation and moderately negative entropy of activation: &Delta;H&Dagger;298= 34.0 &plusmn; 0.3 kJmol-1 for vanillin and 46.2 &plusmn; 0.1 kJmol-1 for complex with BSA and 51.0 &plusmn; 0.6 kJ&middot;mol-1 for complex with BLG, negatives values of entropy &Delta;S&Dagger;298 = -147.4 &plusmn; 0.9 J&middot;mol-1&middot;K-1, -105.3 &plusmn; 0.5 J&middot;mol-1&middot;K-1 and -90 &plusmn; 2 J&middot;mol-1&middot;K-1 respectively. The values of enthalpy and entropy of activation found for vanillic acid were: &Delta;H&Dagger;298 = 19.6 &plusmn; 0.2 kJ&middot;mol-1, 10.2 &plusmn; 0.03 kJ&middot;mol-1 and 37.6 &plusmn; 0.3 kJ&middot;mol-1 for BSA and BLG respectively and negative values of entropy &Delta;S&Dagger;298 = -174 &plusmn; 0.5 J&middot;mol-1&middot;K-1, -206.0 &plusmn; 0.1 J&middot;mol-1&middot;K-1 and -116 &plusmn; 1 J&middot;mol-1&middot;K-1. From these values of enthalpy and entropy of activation the mechanism of radical DPPH&bull; reduction was assigned to a process of hydrogen atom transfer (HAT/PCET). The deactivation reaction of the MbFe(IV)=O species by vanillin shown rate constant of k298 = 57&plusmn;1 L&middot;mol-1&middot;s-1, which it is higher than vanillic acid k298 = 15&plusmn;1 L&middot;mol-1&middot;s-1. This fact is assigned to the total negative charges of the reductor and the protein under the experimental conditions. It is observed an antagonistic effect of the complexation of vanillin by proteins in the antioxidant activity, in which the effect diminish, but not avoid the long range electron transfer by out-sphere reaction. On the other hand, the presence of BLG and BSA do not affect the reactivity of vanillic acid towards the MbFe(IV)=O species. The activation parameters found for the reduction of MbFe(IV)=O by vanillin revealed values of &Delta;H&Dagger;298 = 58.8 &plusmn; 0.3 kJmol-1 and &Delta;S&Dagger;298 = -14 &plusmn; 1 J&middot;mol-1&middot;K-1, &Delta;H&Dagger;298 = 45.5 &plusmn; 0.3 kJ&middot;mol-1 e &Delta;S&Dagger;298 = -60 &plusmn; 1 J &middot;mol-1&middot;K-1, &Delta;H&Dagger;298 = 68.6 &plusmn; 0.4 kJ&middot;mol-1 and &Delta;S&Dagger;298 = 17 &plusmn; 1 J &middot;mol-1&middot;K-1 for free vanillin, complex with BSA and complex with BLG respectively. For the reduction by vanillic acid it were with the following values of enthalpy and entropy of activation: &Delta;H&Dagger;298 = 41.8 &plusmn; 0.2 kJ&middot;mol-1 and &Delta;S&Dagger;298 = -82.4 &plusmn; 0.7 J&middot;mol-1&middot;K-1, &Delta;H&Dagger;298 = 37.7 &plusmn; 0.3 kJ&middot;mol-1 and &Delta;S&Dagger;298 = -96 &plusmn; 1.0 J&middot;mol-1&middot;K-1, &Delta;H&Dagger;298 = 53.5 &plusmn; 0.2 kJ&middot;mol-1 and &Delta;S&Dagger;298 = -44 &plusmn; 1.0 J&middot;mol-1&middot;K-1 for free vanillin, complex with BSA and complex with BLG respectively.

O presente estudo teve como objetivo avaliar a associação entre o polimorfismo da &beta;-lactoglobulina e as características físico-químicas (pH, acidez e crioscopia), de composição (gordura, sólidos totais, uréia, proteína bruta, proteína verdadeira, nitrogênio não-protéico e caseína), e de estabilidade do leite. Para tanto, 11 rebanhos leiteiros foram selecionados, 5 da raça Holandesa e 6 da raça Girolanda, dos quais foram coletadas 4 amostras de leite de 164 vacas da raça Holandesa e 74 da raça Girolanda, sendo duas coletas realizadas na estação das secas e 2 na estação das chuvas. Cada amostra foi submetida à análise de composição e de características físico-químicas. Para a identificação do genótipo para &beta;-lactoglobulina, foram coletadas amostras de sangue de cada vaca, as quais foram submetidas à reação de polimerase em cadeia (PCR), determinando-se as freqüências alélicas e genotípicas dos animais. A estabilidade do leite foi avaliada pelo teste de estabilidade ao etanol, nas seguintes concentrações alcoólicas: 70, 76, 80 e 84ºGL. As freqüências genotípicas foram 0,28, 0,30 e 0,41 para os genótipos AA, AB e BB, respectivamente. A freqüência do alelo B foi maior que do alelo A, 0,52 e 0,47, para a raça Holandesa, e 0,58 e 0,41, para a raça Girolanda, respectivamente. Não houve efeito do polimorfismo da &beta;-lactoglobulina (AA, AB e BB), entre os animais das raças, avaliadas sobre as propriedades físico-químicas e a composição do leite. Observou-se efeito de raça (Holandesa e Girolanda, respectivamente) sobre a acidez titulável (16,16 e 17,07°D) e pH (6,78 e 6,75), e de composição do leite quanto as variáveis gordura (3,31 e 3,20%), NUL (16,62 e 14,45mg/dL) e PB (3,13 e 3,04%). Houve efeito da estação (chuvosa e seca, respectivamente) sobre as características físico-químicas de acidez titulável (16,62 e 16,34°D), pH (6,76 e 6,79) e crioscopia (-0,5411 e -0,5376°H), e de composição do leite quanto as variáveis lactose (4,34 e 4,50%), sólidos totais (11,65 e 11,90%), LogCCS (2,44 e 2,34), PB (3,08 e 3,14%), PV (2,84 e 2,91%), caseína (2,01 e 2,13%) e relação caseína:proteína verdadeira (0,70 e 0,72). Verificou-se também efeito da raça e estação do ano sobre a estabilidade do leite, sendo que o leite foi mais instável para raça Girolanda e durante a estação seca, mas não se observou efeito do polimorfismo da &beta;-lactoglobulina sobre esta característica. / The objective of this study was to evaluate the association between beta-lactogobulin polymorphism and physico-chemical characteristics, composition (fat, total solids, urea, crude protein, true protein, non protein nitrogen and casein), and stability of milk. For this aim, 11 dairy herds were selected, six of them composed of crossbred Holstein-Zebu (H-Z) cows and five from Holstein cows. Milk samples were taken four times (twice in dry season and twice in rainy season), from 278 Holstein and 156 crossbred Holstein-Zebu cows. Individual milk samples were analyzed for milk composition and physico-chemical properties. For &beta;-lactoglobulin polymorphism analysis, 10 mL of blood samples were ollected from each cow and then submitted to polymerase chain reaction (PCR). Following &beta;-lactoglobulin protein variants detection, genotype and allele frequencies for the 11 herds were analyzed. Heat stability of milk was determined by the alcohol-induced precipitation test, using the following ethanol concentrations 70, 76, 80 and 84ºGL. The genotype frequencies were 0.28, 0.30 and 0.41 for AA, AB and BB, respectively. Allele B frequency was higher than A, 0.52 and 0.47, for Holstein cows, 0.58 and 0.41, for Holstein-Zebu, respectively. Genetic variants of &beta;-lactoglobulin (AA, AB and BB) had no effect on physico-chemical (acidity, pH and crioscopy), and compositional characteristics (fat, total solids, urea, crude protein, non-protein nitrogen, true protein and casein percentages), either among milk from Holstein cows, or from crossbred Holstein-Zebu. Breed effect for Holstein and H-Z on titrable acidity (16,16 and 17,07°D, respectively), pH (6,78 and 6,75, respectively), fat (3,31e 3,20%, respectively), milk urea nitrogen (16,62 e 14,45mg/dL, respectively) and crude protein (3,13 e 3,04%, respectively) could be observed. Effect of seasonality between rainy and dry seasons was also observed on physico-chemical variables of titrable acidity (16,62 and 16,34°D, respectively), pH (6,76 and 6,79, respectively) and freezing point (-0,5411and -0,5376°H, respectively), and on composition characteristics of lactose (4,34 and 4,50%, respectively), total solids (11,65 and 11,90%, respectively), LogCCS (2,44 and 2,34, respectively), crude protein (3,08 and 3,14%, respectively), true protein (2,84 and 2,91%, respectively), casein content (2,01 and 2,13%, respectively) and casein:true protein ratio (0,70 and 0,72, respectively). Effect of breed and seasonality on milk ethanol stability test was observed. Holstein-Zebu milk was ethanol-unstable on dry season. No effect of &beta;-lactoglobulin on milk stability was observed.

O presente trabalho procurou investigar influência da presença de proteínas do soro do leite na atividade antioxidante da vanilina e ácido vanílico frente ao radical DPPH&bull; e a espécie de ferro hipervalente ferrilmioglobina MbFe(IV)=O em meio simulando o trato gastrointestinal. A constante de associação (KA) entre a vanilina e a &beta;-lactoglobulina (BLG) foi determinada utilizando-se as técnicas de espectroscopia de emissão molecular (KA = 400 &plusmn; 12&middot;102 L&middot;mol-1) e microcalorimétria (KA = 5,6&plusmn;0,3&middot;102 L&middot;mol-1) ambas em tampão fosfato com CH+ = 10-7,4 mol&middot;L-1 e força iônica 0,32 (NaCl). Para a interação entre a vanilina e albumina de soro bovino (BSA) encontrou-se o valor de 340 &plusmn; 13&middot;102 L&middot;mol-1 em meio de tampão fosfato com CH+ = 10-6,4 mol&middot;L-1 e força iônica 0,32 (NaCl), obtido por espectroscopia de emissão molecular. Constatou-se pela técnica de microcalorimetria que a complexação possui caráter exotérmico e as contribuições de interações hidrofóbicas para a complexação são fracas. A reatividade da vanilina e ácido vanílico com o radical DPPH&bull; foi investigada em meio de emulsão aquosa Tween-20&reg; com CH+ = 10-2,0 mol&middot;L-1. Os resultados obtidos demonstraram que a vanilina não pode ser considerada um bom antioxidante frente ao DPPH&bull; (k298 = 1,42&plusmn;0,04&middot;10-1 L&middot;mol-1&middot;s-1), no entanto, o ácido vanílico apresentou maior reatividade frente ao radical DPPH&bull; (k298 = 17,1&plusmn;0,3 &middot;10-1 L&middot;mol-1&middot;s-1). A presença das proteínas BLG e BSA nas reações de redução do radical DPPH&bull; pela vanilina e ácido vanílico conduziu a um efeito antagônico na constante de velocidade de reação. Os parâmetros termodinâmicos do estado de transição da reação com DPPH&bull; apresentaram valores relativamente altos de entalpia de ativação e moderados valores de entropia de ativação: &Delta;H&Dagger;298 = 34,0 &plusmn; 0,3 kJmol-1 para a vanilina e 46,2 &plusmn; 0,1 kJmol-1 no complexo com BSA e 51,0 &plusmn; 0,6 kJ&middot;mol-1 no complexo com BLG, valores negativos de entropia &Delta;S&Dagger;298 = -147,4 &plusmn; 0,9 J&middot;mol-1&middot;K-1, -105,3 &plusmn; 0,5 J&middot;mol-1&middot;K-1 e -90 &plusmn; 2 J&middot;mol-1&middot;K-1 respectivamente. Os valores de entalpia e entropia de ativação encontrados para o ácido vanílico foram: &Delta;H&Dagger;298= 19,6 &plusmn; 0,2 kJ&middot;mol-1, 10,2 &plusmn; 0,03 kJ&middot;mol-1 e 37,6 &plusmn; 0,3 kJ&middot;mol-1 para os complexos com BSA e BLG respectivamente e valores negativos de entropia &Delta;S&Dagger;298=-174 &plusmn; 0,5 J&middot;mol-1&middot;K-1, -206,0 &plusmn; 0,1 J&middot;mol-1&middot;K-1 e -116 &plusmn; 1 J&middot;mol-1&middot;K-1. A partir destes valores de entalpia e entropia de ativação o mecanismo de redução do radical DPPH&bull; foi atribuído a um processo de abstração de átomo de hidrogênio (HAT/PCET). A reação de desativação da espécie MbFe(IV)=O pela vanilina apresentou constante de velocidade de k298 = 57&plusmn;1 L&middot;mol-1&middot;s-1 sendo superior quando comparada ao ácido vanílico k298 = 15&plusmn;1 L&middot;mol-1&middot;s-1, fato este atribuído as cargas totais, negativa, do redutor e da proteína nas presentes condições experimentais. Observa-se um efeito antagônico da complexão da vanilina pelas proteínas na atividade antioxidante frente à ferrilmioglobina, onde o efeito reduziu, mas não impediu a reação de transferência de elétrons por esfera-externa à longa distância. Em contrapartida, a presença das proteínas BLG e BSA não influenciaram a reatividade do ácido vanílico frente à espécie MbFe(IV)=O. Os parâmetros de ativação encontrados para a reação de redução da MbFe(IV)=O com a vanilina apresentaram valores de &Delta;H&Dagger;298 = 58,8 &plusmn; 0,3 kJmol-1 e &Delta;S&Dagger;298 = -14 &plusmn; 1 J&middot;mol-1&middot;K-1, &Delta;H&Dagger;298 = 45,5 &plusmn; 0,3 kJ&middot;mol-1 e &Delta;S&Dagger;298 = -60 &plusmn; 1 J &middot;mol-1&middot;K-1, &Delta;H&Dagger;298 = 68,6 &plusmn; 0,4 kJ&middot;mol-1 e &Delta;S&Dagger;298 = 17 &plusmn; 1 J &middot;mol-1&middot;K-1 para vanilina \"livre\", complexo com BSA, e complexo com BLG respectivamente. Para a redução com ácido vanílico foram determinados os seguintes valores de entalpia e entropia de ativação: &Delta;H&Dagger;298 = 41,8 &plusmn; 0,2 kJ&middot;mol-1 e &Delta;S&Dagger;298 = -82,4 &plusmn; 0,7 J&middot;mol-1&middot;K-1, &Delta;H&Dagger;298 = 37,7 &plusmn; 0,3 kJ&middot;mol-1 e &Delta;S&Dagger;298 = -96 &plusmn; 1,0 J&middot;mol-1&middot;K-1, &Delta;H&Dagger;298 = 53,5 &plusmn; 0,2 kJ&middot;mol-1 e &Delta;S&Dagger;298 = -44 &plusmn; 1,0 J&middot;mol-1&middot;K-1 para vanilina \"livre\", complexo com BSA, e complexo com BLG respectivamente. / The present study evaluate the influence of the presence of whey proteins in the antioxidant activity of vanillin and vanillic acid towards the DPPH&bull; radical species and the hypervalent iron species ferrylmyoglobin, MbFe(IV)=O under conditions simulating the gastrointestinal tract. The association constant (KA) between vanillin and &beta;- lactoglobulin (BLG) was obtained using molecular emission spectroscopy (KA = 400 &plusmn; 12&middot;102 L&middot;mol-1) and microcalorimetric titration (KA = 5.6&plusmn;0.3&middot;102 L&middot;mol-1) both in phosphate buffer CH + = 10-7.4 mol&middot;L -1 and ionic strength 0.32 (NaCl). For the interaction between vanillin and bovine serum albumin (BSA) it was founded value of 340 &plusmn; 13&middot;102 L&middot;mol-1 in phosphate buffer with CH+ = 10-6,4 mol&middot;L-1 and ionic strength 0.32 (NaCl), as obtained by molecular emission spectroscopy. It was founded by microcalorimetry tritation that the complexation has a exothermic character and the contributions of hydrophobic interactions for complexation are weak. The reactivity of vanillin and vanillic acid toward DPPH&bull; radical was studied in aqueous emulsion using Tween-20&reg; with CH + = 10-2.0 mol&middot;L-1. The results show that vanillin can not be considered a good antioxidant (k298 = 1.42&plusmn;0.04&middot;10-1 L&middot;mol-1&middot;s-1), however vanillic acid show higher reactivity than vanillin towards the radical DPPH&bull; (k298 = 17.1&plusmn;0.3&middot;10-1 L&middot;mol-1&middot;s-1). The presence of the proteins BLG and BSA in the reduction reactions of the DPPH&bull; radical by vanillin and vanillic acid led to an antagonic effect in the reaction rate constant. The thermodynamic parameters for the transition state of the reaction with DPPH&bull; showed relatively high values of enthalpy of activation and moderately negative entropy of activation: &Delta;H&Dagger;298= 34.0 &plusmn; 0.3 kJmol-1 for vanillin and 46.2 &plusmn; 0.1 kJmol-1 for complex with BSA and 51.0 &plusmn; 0.6 kJ&middot;mol-1 for complex with BLG, negatives values of entropy &Delta;S&Dagger;298 = -147.4 &plusmn; 0.9 J&middot;mol-1&middot;K-1, -105.3 &plusmn; 0.5 J&middot;mol-1&middot;K-1 and -90 &plusmn; 2 J&middot;mol-1&middot;K-1 respectively. The values of enthalpy and entropy of activation found for vanillic acid were: &Delta;H&Dagger;298 = 19.6 &plusmn; 0.2 kJ&middot;mol-1, 10.2 &plusmn; 0.03 kJ&middot;mol-1 and 37.6 &plusmn; 0.3 kJ&middot;mol-1 for BSA and BLG respectively and negative values of entropy &Delta;S&Dagger;298 = -174 &plusmn; 0.5 J&middot;mol-1&middot;K-1, -206.0 &plusmn; 0.1 J&middot;mol-1&middot;K-1 and -116 &plusmn; 1 J&middot;mol-1&middot;K-1. From these values of enthalpy and entropy of activation the mechanism of radical DPPH&bull; reduction was assigned to a process of hydrogen atom transfer (HAT/PCET). The deactivation reaction of the MbFe(IV)=O species by vanillin shown rate constant of k298 = 57&plusmn;1 L&middot;mol-1&middot;s-1, which it is higher than vanillic acid k298 = 15&plusmn;1 L&middot;mol-1&middot;s-1. This fact is assigned to the total negative charges of the reductor and the protein under the experimental conditions. It is observed an antagonistic effect of the complexation of vanillin by proteins in the antioxidant activity, in which the effect diminish, but not avoid the long range electron transfer by out-sphere reaction. On the other hand, the presence of BLG and BSA do not affect the reactivity of vanillic acid towards the MbFe(IV)=O species. The activation parameters found for the reduction of MbFe(IV)=O by vanillin revealed values of &Delta;H&Dagger;298 = 58.8 &plusmn; 0.3 kJmol-1 and &Delta;S&Dagger;298 = -14 &plusmn; 1 J&middot;mol-1&middot;K-1, &Delta;H&Dagger;298 = 45.5 &plusmn; 0.3 kJ&middot;mol-1 e &Delta;S&Dagger;298 = -60 &plusmn; 1 J &middot;mol-1&middot;K-1, &Delta;H&Dagger;298 = 68.6 &plusmn; 0.4 kJ&middot;mol-1 and &Delta;S&Dagger;298 = 17 &plusmn; 1 J &middot;mol-1&middot;K-1 for free vanillin, complex with BSA and complex with BLG respectively. For the reduction by vanillic acid it were with the following values of enthalpy and entropy of activation: &Delta;H&Dagger;298 = 41.8 &plusmn; 0.2 kJ&middot;mol-1 and &Delta;S&Dagger;298 = -82.4 &plusmn; 0.7 J&middot;mol-1&middot;K-1, &Delta;H&Dagger;298 = 37.7 &plusmn; 0.3 kJ&middot;mol-1 and &Delta;S&Dagger;298 = -96 &plusmn; 1.0 J&middot;mol-1&middot;K-1, &Delta;H&Dagger;298 = 53.5 &plusmn; 0.2 kJ&middot;mol-1 and &Delta;S&Dagger;298 = -44 &plusmn; 1.0 J&middot;mol-1&middot;K-1 for free vanillin, complex with BSA and complex with BLG respectively.

O presente estudo teve como objetivo avaliar a associação entre o polimorfismo da &beta;-lactoglobulina e as características físico-químicas (pH, acidez e crioscopia), de composição (gordura, sólidos totais, uréia, proteína bruta, proteína verdadeira, nitrogênio não-protéico e caseína), e de estabilidade do leite. Para tanto, 11 rebanhos leiteiros foram selecionados, 5 da raça Holandesa e 6 da raça Girolanda, dos quais foram coletadas 4 amostras de leite de 164 vacas da raça Holandesa e 74 da raça Girolanda, sendo duas coletas realizadas na estação das secas e 2 na estação das chuvas. Cada amostra foi submetida à análise de composição e de características físico-químicas. Para a identificação do genótipo para &beta;-lactoglobulina, foram coletadas amostras de sangue de cada vaca, as quais foram submetidas à reação de polimerase em cadeia (PCR), determinando-se as freqüências alélicas e genotípicas dos animais. A estabilidade do leite foi avaliada pelo teste de estabilidade ao etanol, nas seguintes concentrações alcoólicas: 70, 76, 80 e 84ºGL. As freqüências genotípicas foram 0,28, 0,30 e 0,41 para os genótipos AA, AB e BB, respectivamente. A freqüência do alelo B foi maior que do alelo A, 0,52 e 0,47, para a raça Holandesa, e 0,58 e 0,41, para a raça Girolanda, respectivamente. Não houve efeito do polimorfismo da &beta;-lactoglobulina (AA, AB e BB), entre os animais das raças, avaliadas sobre as propriedades físico-químicas e a composição do leite. Observou-se efeito de raça (Holandesa e Girolanda, respectivamente) sobre a acidez titulável (16,16 e 17,07°D) e pH (6,78 e 6,75), e de composição do leite quanto as variáveis gordura (3,31 e 3,20%), NUL (16,62 e 14,45mg/dL) e PB (3,13 e 3,04%). Houve efeito da estação (chuvosa e seca, respectivamente) sobre as características físico-químicas de acidez titulável (16,62 e 16,34°D), pH (6,76 e 6,79) e crioscopia (-0,5411 e -0,5376°H), e de composição do leite quanto as variáveis lactose (4,34 e 4,50%), sólidos totais (11,65 e 11,90%), LogCCS (2,44 e 2,34), PB (3,08 e 3,14%), PV (2,84 e 2,91%), caseína (2,01 e 2,13%) e relação caseína:proteína verdadeira (0,70 e 0,72). Verificou-se também efeito da raça e estação do ano sobre a estabilidade do leite, sendo que o leite foi mais instável para raça Girolanda e durante a estação seca, mas não se observou efeito do polimorfismo da &beta;-lactoglobulina sobre esta característica. / The objective of this study was to evaluate the association between beta-lactogobulin polymorphism and physico-chemical characteristics, composition (fat, total solids, urea, crude protein, true protein, non protein nitrogen and casein), and stability of milk. For this aim, 11 dairy herds were selected, six of them composed of crossbred Holstein-Zebu (H-Z) cows and five from Holstein cows. Milk samples were taken four times (twice in dry season and twice in rainy season), from 278 Holstein and 156 crossbred Holstein-Zebu cows. Individual milk samples were analyzed for milk composition and physico-chemical properties. For &beta;-lactoglobulin polymorphism analysis, 10 mL of blood samples were ollected from each cow and then submitted to polymerase chain reaction (PCR). Following &beta;-lactoglobulin protein variants detection, genotype and allele frequencies for the 11 herds were analyzed. Heat stability of milk was determined by the alcohol-induced precipitation test, using the following ethanol concentrations 70, 76, 80 and 84ºGL. The genotype frequencies were 0.28, 0.30 and 0.41 for AA, AB and BB, respectively. Allele B frequency was higher than A, 0.52 and 0.47, for Holstein cows, 0.58 and 0.41, for Holstein-Zebu, respectively. Genetic variants of &beta;-lactoglobulin (AA, AB and BB) had no effect on physico-chemical (acidity, pH and crioscopy), and compositional characteristics (fat, total solids, urea, crude protein, non-protein nitrogen, true protein and casein percentages), either among milk from Holstein cows, or from crossbred Holstein-Zebu. Breed effect for Holstein and H-Z on titrable acidity (16,16 and 17,07°D, respectively), pH (6,78 and 6,75, respectively), fat (3,31e 3,20%, respectively), milk urea nitrogen (16,62 e 14,45mg/dL, respectively) and crude protein (3,13 e 3,04%, respectively) could be observed. Effect of seasonality between rainy and dry seasons was also observed on physico-chemical variables of titrable acidity (16,62 and 16,34°D, respectively), pH (6,76 and 6,79, respectively) and freezing point (-0,5411and -0,5376°H, respectively), and on composition characteristics of lactose (4,34 and 4,50%, respectively), total solids (11,65 and 11,90%, respectively), LogCCS (2,44 and 2,34, respectively), crude protein (3,08 and 3,14%, respectively), true protein (2,84 and 2,91%, respectively), casein content (2,01 and 2,13%, respectively) and casein:true protein ratio (0,70 and 0,72, respectively). Effect of breed and seasonality on milk ethanol stability test was observed. Holstein-Zebu milk was ethanol-unstable on dry season. No effect of &beta;-lactoglobulin on milk stability was observed.

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