Recent years have seen the emergence of Mycobacterium abscessus, a highly drug-resistant non-tuberculous mycobacterium, which causes life-threatening infections in people with chronic lung conditions like cystic fibrosis. This opportunistic pathogen is refractory to treatment with standard anti-tuberculosis drugs and most currently available antibiotics, often resulting in accelerated lung function decline. This project aims to use a structure-guided fragment-based drug discovery approach to develop effective drugs to treat M. abscessus infections. During the early stage of the project, three bacterial targets were identified, based on analysis of the structural proteome of M. abscessus and prior knowledge of M. tuberculosis drug targets, followed by gene knockout studies to determine target essentiality for bacterial survival. The three targets from M. abscessus were then cloned, expressed and purified and suitable crystallization conditions were identified leading to the determination of high resolution structures. Further, a large number of starting fragments that hit the three target proteins were determined, using a combination of biophysical screening methods and by defining crystal structures of the complexes. For target 3, PPAT (Phosphopantethiene adenylyl transferase), a chemical linking of two fragments followed by iterative fragment elaboration was carried out to obtain two compounds with low micromolar affinities in vitro. However, these compounds afforded only low inhibitory activity on M. abscessus whole cell. All starting fragments of target 2, PurC (SAICAR synthase), occupied the ATP indole pocket. Efforts were then made to identify further fragment hits by screening diverse libraries. Sub-structure searches of these initial fragment hits and virtual screening helped to identify potential analogues amenable to further medicinal chemistry intervention. While fragment hits of target 1, TrmD (tRNA-(N1G37) methyl transferase), were prioritized, whereby two chemical series were developed using fragment growing and merging approaches. Iterative fragment elaboration cycle, aided by crystallography, biophysical and biochemical assays led to the development of several potential lead candidates having low nano-molar range of in vitro affinities. Two such compounds afforded moderate inhibition of M. abscessus and stronger inhibition of M. tuberculosis and S. aureus cultures. Further chemical modifications of these compounds as well as others are now being done, to optimize cellular and in vivo activities, to be ultimately presented as early stage clinical candidates.

Les cyclodipeptides et leurs dérivés, les dicétopipérazines (DKP), constituent une large classe de métabolites secondaires aux activités biologiques remarquables qui sont essentiellement synthétisés par des microorganismes. Les voies de biosynthèse de certaines DKP contiennent des synthases de cyclodipeptides (CDPS), une famille d’enzymes récemment identifiée. Les CDPS ont la particularité de détourner les ARNt aminoacylés de leur rôle essentiel dans la synthèse protéique ribosomale pour les utiliser comme substrats et ainsi catalyser la formation des deux liaisons peptidiques de différents cyclodipeptides. Le travail de thèse présenté dans ce manuscrit a pour objectif de caractériser la nouvelle famille des CDPS. Dans un premier temps, la caractérisation tant structurale que mécanistique de la première CDPS identifiée, AlbC de Streptomyces noursei, est présentée. Puis, les résultats obtenus avec trois autres CDPS, chacune de ces enzymes ayant des caractéristiques adéquates pour approfondir l’étude de la famille des CDPS, sont décrits. Ainsi, la CDPS Ndas_1148 de Nocardiopsis dassonvillei a permis d’étendre nos connaissances sur les bases moléculaires de la spécificité des CDPS. La CDPS AlbC-IMI de S. sp. IMI 351155 est un bon modèle pour analyser l’interaction de chacun des deux substrats nécessaires à la formation d’un cyclodipeptide. Enfin, la caractérisation de la CDPS Nvec-CDPS2 chez l’animal Nematostella vectensis a permis de fournir le premier exemple d’enzyme d’origine animale impliquée dans la synthèse peptidique non ribosomale. / Cyclodipeptides and their derivatives, the diketopiperazines (DKPs), constitute a large class of secondary metabolites with noteworthy biological activities that are mainly synthesized by microorganisms. The biosynthetic pathways of some DKPs contain cyclodipeptide synthases (CDPSs), a newly defined family of enzymes. CDPSs hijack aminoacyl-tRNAs from their essential role in ribosomal protein synthesis to catalyze the formation of the two peptide bonds of various cyclodipeptides. The aim of the work presented in this thesis manuscript is to characterize the CDPS family. At first, the structural and mechanistic characterization of the first identified CDPS, AlbC of Streptomyces noursei, is presented. Then, the results obtained with three other CDPSs, each of which having suitable properties to increase our understanding of the CDPS family, are described. The CDPS Ndas_1148 of Nocardiopsis dassonvillei extends our knowledge of the molecular bases of the CDPS specificity. The CDPS AlbC-IMI of S. sp. IMI 351155 is a good model to analyze the interaction of each of the two substrates required for the formation of a cyclodipeptide. Finally, the characterization of the CDPS Nvec-CDPS2 from Nematostella vectensis provides the first example of enzymes of animal origin involved in nonribosomal peptide synthesis.

L’activité RNase P est l'activité essentielle qui élimine les séquences 5' supplémentaires des précurseurs d'ARN de transfert. "PRORP" (PROteinaceous RNase P) définit une nouvelle catégorie de RNase P uniquement protéique. Avant la caractérisation de PRORP, on pensait que les enzymes RNase P étaient universellement conservées sous forme de ribonucléoprotéines (RNP). La caractérisation de PRORP a révélé une enzyme avec deux domaines principaux, un domaine N-terminal contenant plusieurs motifs PPR et un domaine NYN C-terminal portant l’activité catalytique. Nous avons utilisé une combinaison d'approches biochimiques et biophysiques pour caractériser le complexe PRORP / ARNt. La structure du complexe en solution a été déterminée par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) et les Kd des interactions de différents mutants de PRORP avec l’ARNt ont été déterminées par ultracentrifugation analytique. Notre analyse révèle un cas intéressant d'évolution convergente. Il suggère que PRORP a développé un processus de reconnaissance de l'ARN similaire à celui des RNase P RNP. Par ailleurs, nous avons mis en place une approche de co-immunoprécipitation de PRORP avec l’ARN afin de définir le spectre de substrats des RNase P protéiques. / RNase P is the essential activity that removes 5'-leader sequences from transfer RNA precursors. “PRORP” (PROteinaceous RNase P) defines a novel category of protein only RNase P. Before the characterization of PRORP, RNase P enzymes were thought to occur universally as ribonucleoproteins (RNP). The characterization of PRORP revealed an enzyme with two main domains, an N-terminal domain containing multiple PPR motifs and a C-terminal NYN domain holding catalytic activity. We used a combination of biochemical and biophysical approaches to characterize the PRORP / tRNA complex. The structure of the complex in solution was determined by small angle X-ray scattering and Kd values of the PRORP / tRNA interaction were determined by analytical ultracentrifugation. We also analyzed direct interaction of a collection of PPR mutants with tRNA in order to determine the relative importance of individual PPR motifs for RNA binding. This reveals to what extent PRORP target recognition process conforms to the mode of action of PPR proteins interacting with linear RNA. Altogether, our analysis reveals an interesting case of convergent evolution. It suggests that PRORP has evolved an RNA recognition process similar to that of RNP RNase P. Moreover, we also implemented a PRORP-RNA co-immunoprecipitation approach to determine the full extent of PRORP substrates.

Les aminoacyl-ARNt synthétases catalysent la formation des aminoacyl-ARNt, utilisés lors de la synthèse protéique et peuvent également former des complexes multi-synthétasiques (MSC). Chez S. cerevisiae, le complexe AME associe les glutamyl- et méthionyl-ARNt synthétases à la protéine d’ancrage Arc1 et joue un rôle primordial dans la coordination de l’expression des génomes nucléaire et mitochondrial. Tous les composants de ce MSC sont multi-localisés et assurent des fonctions essentielles dans d’autres compartiments. Pour étudier ces localisations multiples, nous avons élaboré un outil, basé sur la Split-GFP, qui nous permet de visualiser spécifiquement la fraction organellaire d’une protéine multi-localisée. Pour cela, la GFP a été séparée en deux fragments : i) β1-10, restreint à un compartiment subcellulaire et ii) β11, fusionné aux protéines d’intérêts. Cet outil nous a permis d’étudier diverses relocalisations, ainsi que de délimiter des signaux d’import. / Aminoacyl-tRNA synthetases catalyze aminoacyl-tRNA formation, required for protein synthesis but can also associate into multi-synthetase complexes (MSC). In S. cerevisiae, the AME complex contains glutamyl- and methionyl-tRNA synthetases bound to the anchor protein Arc1 and is responsible for the coordination of nuclear and mitochondrial genome expression. The three MSC partners are multi-localized and present simultaneously in several compartments. The detection of the organellar pools of these multilocalized proteins in vivo is difficult, since they are mainly cytosolic. Therefore, we engineered a split-GFP based localization tool that allows us to specifically visualize organellar fractions of multi-localized proteins. To do so, GFP was split into two parts: β1-10, restricted to a subcellular compartment and β11, fused to the protein of interest. This tool allowed us to study relocalization of cytosolic proteins and characterize targeting signals.

Le séquençage à haut débit est une technique très utile pour l’étude des ARN. Pendant mon doctorat, nous l’avons utilisé pour la caractérisation des ARN extracellulaire (ARNex) du plasma humain. Les ARNex du plasma sont retrouvés soit à l’état soluble sous forme de complexes ribonucléoprotéiques (RNP) ou encapsulés au sein de vésicules extracellulaires (VE) de diverses origines (exosomes, microvesicles, …). Dans ce projet, j’ai démontré que le plasma contenait principalement des micro ARN, le fragment hY4 et des ARN ribosomiques dégradés. Par ailleurs, après chromatographie à exclusion de tailles ou par traitement consécutif protéinase K/RNase A, des VE hautement purifiées peuvent être obtenus. Nous ne retrouvons plus en majorité les micro ARN et l’ARN hY4 dans ces échantillons mais plutôt des ARN du microbiote humain, montrant une composition différente entre les ARNex solubles et ceux des vésicules purifiées. Par ailleurs, j’ai également effectué une étude comparative de kits commerciaux qui sont supposés purifier les exosomes par précipitation. La composition en ARN de ces fractions est très similaire au plasma humain total, montrant une forte contamination par les RNP solubles. Ainsi, nous sommes en mesure de proposer un protocole pour l’étude des ARNex dans le cadre de biopsies liquides avec des échantillons cliniques afin de découvrir de potentiels biomarqueurs de diagnostic. Au-delà de la caractérisation d’ARN, le séquençage à haut-débit peut être utilisé pour la détection et quantification des modifications post-transcriptionnelles. Pendant ma thèse, j’ai utilisé le séquençage pour l’analyse des 2’O-méthylation des ARN de transfert chez E. coli par RiboMethSeq. Sous plusieurs conditions de stress (manque de nutriments ou des concentrations non létales d’antibiotiques), certaines 2’O-méthylations montrent une réponse adaptative. Alors que plus de la moitié des 2’O-méthylations en position 18 (Gm18) sont augmentées dans toutes les conditions de stress étudiées, les positions Nm34 montrent un effet opposé avec une diminution dans certains stress (chloramphénicol et streptomycine). Chacun de ces deux comportements peut être relié à un phénomène de régulation cellulaire en réponse au stress : un changement au niveau de la wobble base pourrait être un moyen de réguler la traduction en modifiant l’usage des codons. En ce qui concerne Gm18, son rôle dans l’évasion du système immunitaire inné lors de l’invasion d’un hôte est en cours d’élucidation. / For less than a decade, high-throughput sequencing became a very powerful, sensitive and precise technique for the study of ribonucleic acids. During my PhD thesis, I used this technology for in-depth characterization of the extracellular RNA (exRNA) content of human plasma. exRNA in plasma exists either in a “soluble state” as a component of ribonucleoprotein (RNP) complexes or encapsulated into extracellular vesicles (EV) of diverse origins (exosomes, microvesicles, …). In this project, I demonstrated that whole human plasma contains mostly micro RNA and the fragment of RNA hY4, as well as degraded ribosomal RNA. Moreover, using a rigorous strategy via size exclusion chromatography or consecutive proteinase K/RNase A treatments, highly purified EVs can be obtained. miRNAs and RNA hY4 fragments were not present in majority of samples, demonstrating a huge difference between soluble exRNA and exRNA from purified EVs. The RNA content of these EVs mainly reflects RNA composition of human microbiota. In addition, I also performed a comparative analysis of commercially available “exosome-enrichment” kits which are supposed to purify human exosomes by precipitation. Their RNA composition was found to be almost identical to human plasma, showing strong uncontrolled contamination by soluble RNPs. Based on this study, we were able to propose a protocol for studies in exRNA in the field of liquid biopsies with clinical sample in order to discover new diagnostic biomarkers. Apart from the characterization of RNA, high-throughput sequencing can be used for detection and quantification of RNA post-transcriptional modifications. During my PhD thesis I applied deep sequencing for analysis of transfer RNA (tRNA) 2’-O-methylations in model bacteria (E. coli) using RiboMethSeq. Under several stress conditions, such as starvation and non-lethal antibiotics concentrations, some 2’-O-methylated nucleotides show an adaptive response. While over than half of Gm18 show a global increase under all investigated stress conditions, ribomethylated residues at position 34 show an opposite effect for some antibiotic treatments (chloramphenicol and streptomycin). Each of these dynamic profiles can be linked to cell regulation in response to stress. Change at the tRNA wobble base (position 34) could be a way to regulate translation by modifying the codon usage. Concerning Gm18, its role in the escape from the human innate immune system during host invasion is currently elucidated.

Killer strains of the yeast Kluyveromyces lactis secrete a heterotrimeric protein toxin (zymocin) to inhibit the growth of sensitive yeasts. The cytotoxicity of zymocin resides in the γ subunit (γ-toxin), however the mechanism of cytotoxicity caused by γ-toxin was previously unknown. This thesis aimed to unravel the mode of γ-toxin action and characterize the interaction between γ-toxin and its substrates. Previous studies suggested a link between the action of γ-toxin and a distinct set of transfer RNAs. In paper I, we show that γ-toxin is a tRNA anticodon endonuclease which cleaves tRNA carrying modified nucleoside 5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine (mcm5s2U) at position 34 (wobble position). The cleavage occurs 3’ to the wobble uridine and yields 2’, 3’-cyclic phosphate and 5´-hydroxyl termini. In paper II, we identified the determinants in tRNA important for efficient γ-toxin cleavage. The modifications present on the wobble uridines have different effects on tRNA cleavage by γ-toxin. The Saccharomyces cerevisiae wobble modification mcm5 group has a strong positive effect, whereas the Escherichia coli wobble modification 5-methylaminomethyl group has a strong inhibitory effect on tRNA cleavage. The s2 group present in both S. cerevisiae and E. coli tRNAs has a weaker positive effect on the cleavage. The anticodon stem loop (ASL) of tRNA represents the minimal structural requirement for γ-toxin action. Nucleotides U34U35C36A37C38 in the ASL are required for optimal cleavage by γ-toxin, whereas a purine at position 32 or a G at position 33 dramatically reduces the reactivity of ASL. Screening for S. cerevisiae mutants resistant to zymocin led to the identification of novel proteins important for mcm5s2U formation (paper III). Sit4p (a protein phosphatase), Sap185p and Sap190p (two of the Sit4 associated proteins), and Kti14p (a protein kinase) are required for the formation of mcm5 side chain. Ncs2p, Ncs6p, Urm1p, and Uba4p, the latter two function in a protein modification (urmylation) pathway, are required for the formation of s2 group. The gene product of YOR251C is also involved in the formation of s2 group. The involvement of multiple proteins suggests that the biogenesis of mcm5s2U is very complex.

Résumé La Ribonucléase P (RNase P) est une enzyme principalement reconnue pour sa participation à la maturation en 5’des ARN de transfert (ARNt). Cependant, d’autres substrats sont reconnus par l’enzyme. En général, la RNase P est composée d’une sous-unité ARN (le P-ARN, codé par le gène rnpB) qui porte le centre actif de l’enzyme et d’une ou de plusieurs sous-unités protéiques (la P-protéine). Les P-ARN chez toutes les bactéries, la majorité des archéobactéries et dans le génome nucléaire de la plupart des eucaryotes, possèdent généralement une structure secondaire très conservée qui inclut le noyau (P1-P4); l’hélice P4 constitue le site catalytique de l’enzyme et l’hélice P1 apparie les extrémités du P-ARN en stabilisant sa structure globale. Les P-ARN mitochondriaux sont souvent moins conservés et difficiles à découvrir. Dans certains cas, les seules régions de structure primaire qui restent conservées sont celles qui définissent le P4 et le P1. Pour la détection des gènes rnpB, un outil de recherche bioinformatique, basé sur la séquence et le profil de structure secondaire, a été développé dans le laboratoire. Cet outil permet le dépistage de toutes les séquences eucaryotes (nucléaires et mitochondriales) du gène avec une très grande confiance (basée sur une valeur statistique, E-value). Chez les champignons, plusieurs ascomycètes encodent un gène rnpB dans leur génome mitochondrial y compris tous les membres du genre d’Aspergillus. Cependant, chez les espèces voisines, Neurospora crassa, Podospora anserina et Sordaria macrospora, une version mitochondriale de ce gène n’existe pas. Au lieu de cela, elles contiennent deux copies nucléaires du gène, légèrement différentes en taille et en contenu nucléotidique. Mon projet a été établi dans le but d’éclaircir l’évolution de la RNase P mitochondriale (mtRNase P) chez ces trois espèces voisines d’Aspergillus. En ce qui concerne les résultats, des modèles de structures secondaires pour les transcrits de ces gènes ont été construits en se basant sur la structure consensus universelle de la sous-unité ARN de la RNase P. Pour les trois espèces, par la comparaison de ces modèles, nous avons établi que les deux copies nucléaires du gène rnpB sont assez distinctes en séquence et en structure pour pouvoir y penser à une spécialisation de fonction de la RNase P. Chez N. crassa, les deux P-ARN sont modifiés probablement par une coiffe et les extrémités 5’, 3’ sont conformes à nos modèles, ayant un P1 allongé. Encore chez N. crassa, nous avons constaté que les deux copies sont transcrites au même niveau dans le cytoplasme et que la plus petite et la plus stable d’entre elles (Nc1) se retrouve dans l’extrait matriciel mitochondrial. Lors du suivi du P-ARN dans diverses sous-fractions provenant de la matrice mitochondriale soluble, Nc1 est associée avec l’activité de la RNase P. La caractérisation du complexe protéique, isolé à partir de la fraction active sur un gel non dénaturant, révèle qu’il contient au moins 87 protéines, 73 d’entre elles ayant déjà une localisation mitochondriale connue. Comme chez la levure, les protéines de ce complexe sont impliquées dans plusieurs fonctions cellulaires comme le processing de l’ADN/ARN, le métabolisme, dans la traduction et d’autres (par exemple : la protéolyse et le repliement des protéines, ainsi que la maintenance du génome mitochondrial). Pour trois protéines, leur fonction est non déterminée. / Abstract Ribonuclease P (RNase P) is an endonuclease that cleaves 5’- leader sequences from tRNA precursors and a few other small RNAs. In most cases, the enzyme is a ribonucleo-protein complex (ribozyme), containing an RNA subunit (P-RNA; encoded by the rnpB gene) that carries the active centre of the enzyme, plus one or more protein subunits. P-RNAs in Bacteria, Eukarya and Archaea have a highly conserved secondary structure including the core P1 and P4 helices. P4 forms the catalytic site of the ribozyme, and P1 pairs the RNA termini, stabilizing overall structure and protecting from nuclease degradation. For processing of mitochondrial (mt) tRNAs, certain eukaryotic species (e.g., Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans) have separate mtDNA-encoded P-RNAs (of bacterial origin). Mt P-RNAs are often less conserved, and difficult to discover. To identify rnpB genes, we have developed a search tool based on sequence plus secondary structure profiles. It predicts all known eukaryotic (nuclear and organellar) rnpB genes with high confidence (based on E-values). In fungi, many ascomycetes encode a mitochondrial rnpB gene, including all members of Aspergillus. Yet, the closely related Neurospora crassa, Podospora anserina and Sordaria macrospora lack an mtDNA-encoded gene version. Instead, they contain two nuclear gene copies with slightly different sequences. My project aims to elucidate the evolution of mitochondrial RNase P in these three closely related species. We have established secondary structure models based on comparisons with the universal minimum consensus secondary structure for all nuclear gene mtP-RNAs copies in all three species. By comparison of these secondary structure models, we have established that the two nuclear copies of rnpB gene are quite distinct in sequence and structure, suggesting a specialization of function. In N. crassa, both P-RNAs are modified most likely by capping, and 5’- 3’ termini perfectly conform to P-RNA structure models that have an elongated P1 helical pairing. Furthermore, we find that the two nuclear copies of rnpB gene are present at about the same level in the cytoplasm, and that the shorter form of P-RNA (Nc1) translocates into the (soluble) mitochondrial matrix. When tracing P-RNA in different mitochondrial sub-fractions of a native gel, the presence of Nc1 and mitochondrial RNase P activity are associated. A proteomics characterization of a P-RNA complex isolated by native gel electrophoresis reveals that it contains at least 87 proteins, 73 of which are of known mitochondrial localization. Like in yeast, the complex contains proteins potentially involved in other DNA/RNA processing activities, but also in translation, in metabolism, and in protein folding. Only three proteins are of unknown function.

Toxoplasma gondii, parasite digestif des Félidés, est l'agent de la toxoplasmose, maladie pouvant être grave voire mortelle en cas d'infection fœtale ou chez l'immunodéprimé. Les traitements actuellement disponibles permettent de prévenir ou traiter la plupart des cas, mais peuvent présenter un risque d'effets indésirables relativement sévères et ne permettent pas de détruire les kystes responsables de l'infection chronique et du risque de réactivation chez l'immunodéprimé. Les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS) sont des enzymes essentielles au mécanisme de traduction, où elles participent au chargement d'un acide aminé sur une molécule dédiée d'ARN de transfert, une étape initiale du processus de synthèse protéique. Un gène codant une protéine homologue de p43, un partenaire protéique de certaines aaRS chez les Eucaryotes supérieurs, a été identifié dans le génome de T. gondii. La localisation subcellulaire post-invasion de Tg-p43 montre qu'il ne s'agit pas d'une cytokine sécrétée, contrairement à son homologue humaine ; au contraire, son immunopurification a révélé son association à quatre aaRS, les Méthionyl-, Glutamyl-, Glutaminyl- et Tyrosyl-ARNt synthétases, qui constituent donc le premier complexe multi-aaRS (MARS) décrit chez les parasites Apicomplexes, de localisation exclusivement cytoplasmique. La présence inattendue de la Tyrosyl-ARNt synthétase soulève plusieurs questions sur le plan de l'organisation et de l'assemblage du complexe. Des images de microscopie électronique et des analyses biochimiques soulignent l'hétérogénéité et la structure relâchée du complexe et confirment les récentes données issues des complexes MARS purifiés chez d'autres organismes. L'inactivation du gène Tg-p43 n'induit pas de modifications phénotypiques majeures (capacité d'invasion, prolifération) ni de diminution de la virulence ou de la kystogénèse en modèle murin. Les résultats sur la caractérisation du MARS ont été complétés par une approche thérapeutique. Un criblage in vitro de candidats-médicaments présélectionnés in silico pour inhiber la Glutaminyl-ARNt synthétase toxoplasmique a permis de mettre en évidence un composé parasitostatique, inhibiteur de la croissance des tachyzoïtes, avec une toxicité sur les cellules hôtes in vitro relativement faible. Ce travail de thèse pose les bases moléculaires et structurales du complexe MARS chez T. gondii. Il permet également d'aborder dans une certaine mesure l'histoire évolutive de ce complexe. Sa fonction biologique reste cependant un mystère ; le rôle de Tg-p43 dans le contrôle post-transcriptionnel, voire d'autres fonctions biologiques, est probablement trop subtil pour être mesuré dans nos conditions expérimentales. Le versant thérapeutique de ce travail constitue une étude préliminaire pouvant servir de point de départ pour la recherche de médicaments anti-toxoplasmiques ciblant les aaRS, qui constituent assurément des cibles thérapeutiques intéressantes. / Toxoplasma gondii, a parasite of felids gut, is responsible for toxoplasmosis, a disease that can induce severe sequelae or death in the foetus or immune-depressed patients. Currently available treatments can prevent or cure most of the cases, but are at risk for side effects and cannot suppress cysts, which cause the chronic disease and are responsible for disease when the immune status is altered. Aminoacyl-tRNA synthetases (aaRS) are essential for translation, by charging tRNA with cognate aminoacids, a preliminary step of the protein synthesis process.A gene coding for a protein homologous to p43 (which interacts with a subset of aaRSs in higher eukaryotes) was identified in the genome of T. gondii. Following its epitope tagging, we show that Tg-p43 is not secreted nor exported beyond the vacuole as a cytokine, as it is for its human counterpart; however, biochemical analysis of the Tg-p43 interactome reveals four aaRSs as interacting partners, namely Methionyl-, Glutamyl-, Glutaminyl- and Tyrosyl-tRNA synthetases. This is the first description of the multi-aaRS (MARS) complex in the Apicomplexa phylum; it is strictly localized in the parasite cytoplasm. The unexpected presence of the Tyrosyl-tRNA synthetase in the complex raises several questions about how the complex is organised and assembled, and also evolved. Electronic microscopy along with size exclusion chromatography shows heterogeneity and loose structure of the complex, similarly to recent data characterizing higher eukaryotic complexes. Disruption of the complex by knocking-out of the gene Tg-p43 does not induce detectable phenotypic modification, nor alterations of the virulence and cystogenesis in a murine model.Alongside the study on the MARS complex, we used an in silico approach to screen for new compounds to inhibit T. gondii Glutaminyl-tRNA synthetase. We thus identified one parasitostatic compound that was able to significantly slow down parasite growth while having a relatively low in vitro toxicity against the human host cell. The function of the MARS in T. gondii still remains unknown; the role of Tg-p43 in the post-transcriptional control or any other biological function is probably too subtle to be measured under our experimental conditions. However, our data help to some extent to better measure the evolutionary history of the MARS family. The therapeutic side of this work, although preliminary, may serve as a base for anti-T. gondii drug discovery focusing on aaRS inhibitors, which are obviously good candidate targets.

Les bactéries acidophiles du genre Acidithiobacillus joue un rôle important dans les activités industrielles de récupération des métaux au sein des sites miniers. Dans cette thèse, la séquence du génome de la bactérie psychro-tolerante Acidithiobacillus ferrivorans CF27 a été re-séquencée. L’analyse comparative du génome de CF27 et des autres bactéries du genre Acidithiobacillus a permis de montrer: (i) une synthénie conservée entre 2 clusters de tRNAs trouvés dans les génomes de At. ferrivorans CF27 et At. ferrooxidans ATCC 23270, et qui ont contribué à la redondance génique des tRNAs chez ces 2 organismes. Notre analyse in silico à grande échelle de ces clusters de tRNAs au sein des génomes procaryotes a montré que les clusters de tRNAs sont présents dans très peu de phyla bactériens; (ii) la présence d’une importante proportion de gènes spécifiques chez CF27 et SS3, ce qui indique la très grande variabilité du contenu génique dans les génomes d’Acidithiobacillus et ainsi la nature unique de chaque groupe d’espèces. L’expression de ces gènes spécifiques a été confirmée chez CF27 cultivés en présence de Fer et soufre; et (iii) une composition taxonomique chimérique des génomes de la classe des Acidithiobacillia, confirmant ainsi que ce groupe appartient à une classe taxonomique particulière. Ces résultats apporte de nouvelles connaissances sur l’adaptation de CF27 à son environnement, ainsi que la nature chimérique des génomes de la classe taxonomique Acidithiobacillia. J’ai participé au projet ‘Thioredoxine réductase (TR)’ dont l’objectif est de définir la fonction biochimique, la structure moléculaire, ainsi que l’histoire évolutive de TRi, une réductase atypique. / The acidophilic Acidithiobacillus bacteria play an important role in industrial biomining operations for metal recovery. In this thesis, the genome sequence of a psychrotolerant Acidithiobacillus ferrivorans CF27 were first refined. The comparative genome analysis between CF27 and the closely related Acidithiobacillus genomes revealed: (i) a syntenic conservation of two tRNA array units which are only present in At. ferrivorans CF27 and At. ferrooxidans ATCC 23270 genomes and mainly contribute to the tRNA gene redundancy in both organisms. Moreover, our large-scale genome survey of the tRNA array units in prokaryotic organisms showed that tRNA arrays appear in few phyla; (ii) a high proportion of species-specific genes in CF27 and SS3 strains indicated the high variability of gene content in Acidithiobacillus genomes and therefore the unique nature of each group of species. Given that mRNA expression of some CF27 specific genes were confirmed in Fe(II)-grown cells and sulfur attached cells in CF27, these results highlighted the functional importance of specific genes for CF27 lifestyle; and (iii) the mosaic taxonomic composition of members of the Acidithiobacillia class, and thus confirmed that this group belongs to a particular taxonomic class, distinct to other proteobacterial groups. Taken together, our results provide insights into At. ferrivorans lifestyle as well as the chimeric genome nature of the Acidithiobacillus organisms. In addition, I also participated to the ‘Thioredoxin reductase’ project which aims to define the biochemical function, molecular structure and evolution of TRi, an atypical thioredoxin reductase.

La glycyl-ARNt synthétase humaine (GRS) est une enzyme clé dans la traduction des protéines dans le cytosol et la mitochondrie. Chez l’Homme, des mutations de la GRS conduisent à la neuropathie périphérique Charcot-Marie-Tooth (CMT). Bien que l’activité de la GRS soit ubiquitaire, les mutations associées à la CMT n’affectent que les nerfs périphériques, suggérant un rôle supplémentaire de la GRS dans les neurones. Pour comprendre ce rôle, nous avons d’abord élucidé le mécanisme particulièrement complexe qui contrôle l’expression de la GRS mitochondriale et cytosolique à partir du même gène. Nous avons identifié deux ARNm : un codant pour les deux enzymes ; et un autre plus long qui contient une IRES fonctionnelle et un uORF. Cet ARNm complexe, ne génère que la GRS cytosolique et montre que son expression et localisation sont étroitement contrôlées. De plus, nous avons montré une distribution particulière de la GRS dans des neurones, qui est un premier indice sur un rôle non canonique. / Human Glycyl-tRNA synthetase (GRS) is a housekeeping enzyme with a key role in protein synthesis, both in the cytosol and the mitochondria. In human, mutations in GRS cause the Charcot-Marie-Tooth (CMT) peripheral neuropathy. Though GRS activity is required in all cells, the CMT-associated mutations affect only the peripheral nervous system, suggesting an additional non canonical role.To understand how GRS is involved in CMT pathology, we first elucidated the original post-transcriptional regulatory mechanism that controls the expression of both the mitochondrial and the cytosolic GRS from a single gene. We identified two mRNA isoforms: one coding for both enzymes; and a longer one containing a functional IRES and an uORF encoding only the cytosolic GRS, evidence that expression and localization of human GRS are tightly controlled. Furthermore, we found a particular Ca2+ dependant distribution of GRS in neurons, giving us a first clue about a potential non-canonical role in neurons.