MELLO, C. P. Estudo in vitro da atividade tripanocida da batroxicidina–catelecidina da glândula de veneno da serpente Bothrops atrox. 2017. 114 f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by ciências farmacêuticas pgcf (pgcf.ufc@gmail.com) on 2017-08-28T11:42:27Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_cpmello.pdf: 7153983 bytes, checksum: 31cc5d5186e81d06b8e89171f005aecc (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-08-28T11:49:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_cpmello.pdf: 7153983 bytes, checksum: 31cc5d5186e81d06b8e89171f005aecc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-28T11:49:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_cpmello.pdf: 7153983 bytes, checksum: 31cc5d5186e81d06b8e89171f005aecc (MD5) Previous issue date: 2017-07-12 / Chagas disease, also known as American trypanosomiasis, is a potentially fatal disease caused by the parasite Trypanosoma cruzi. There are two drugs available for the treatment of the disease, nifurtimox and benzonidazole. Both are toxic and have limited efficacy, requiring the search for new therapeutic alternatives. Antimicrobial peptides (AMPs) may be potential alternatives to conventional treatments already available, as they have a rapid action mode, a low resistance development and can work with existing drugs. The aim of this study was to investigate the effects of Batroxicidin (BatxC), a catalicidine peptide of the venom Bothrops atrox venom gland, on the different forms of of Trypanosoma cruzi Y strains. The treatment with BatxC at 24, 48 and 72 h caused a decrease in the viability of the parasites in almost all the studied concentrations (1.56, 3.12, 6.25, 12.5, 25 and 50 μM) with an IC50 of 11, 3; (0.045, 0.09, 0.18, 0.39, 0.78 and 1.56 μM), respectively, with a selectivity index of 315. Assays with trypomastigote forms at different concentrations demonstrated that BatxC is toxic from concentrations of 0.18 μM, approaching 100% lethality at the concentration of 1.56 μM. Amastigote forms were also performed following cytotoxicity study in LLC-MK2 and RAW264.7 cells, showing that the studied concentrations (0.44 and 0.88 μM) in 24h, was a reduction of 40% and 45% of infected cells, respectively. In 48h, there was no decrease in the percentage of cell infection. The percentage inhibition of amastigote forms treated with BatxC was 33% (IC50) and 43.5% (2xIC50) in 24h, and 23% (IC50) and 33% (2xIC50) in 48h. These results demonstrated a reduction in the survival rate of amastigote forms. Subsequently, flow cytometric assays with Annexin V-PE and 7- aminoactinomycin (7-AAD) demonstrated a higher population of 7ADAD-labeled parasites at IC 50 (11.3μM) and 2x IC 50 (22.6μM ) demonstrating that death induced by BatxC was predominantly by necrosis. Then, the experiments were performed with DCF and Rhodamine 123 to investigate the involvement of reactive oxygen species (EROS) and alteration of the mitochondrial membrane potential in cell death mechanism. The results showed that there was an increase in EROS and alteration of mitochondrial transmembrane potential. The T.cruzi cell death pathway by a necrotic mechanism was finally confirmed by scanning electron microscopy (SEM) that observed loss of cellular membrane integrity. In conclusion, BatxC inhibited all forms of T. cruzi Y strain, with high selectivity index, inducing necrosis. / A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana, é uma doença potencialmente fatal causada pelo parasito Trypanosoma cruzi. Existem atualmente, dois medicamentos disponíveis para o tratamento da doença, o nifurtimox e o benzonidazol. Ambos são tóxicos e apresentam eficácia limitada, sendo necessária a busca de novas alternativas terapêuticas. Os peptidios antimicrobianos (PAMs) podem ser alternativas potenciais aos tratamentos convencionais já disponíveis, pois eles apresentam mecanismo de ação rápido, baixa probabilidade de desenvolvimento da resistência e podem atuar em conjunto com esquema de fármacos existentes. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da Batroxicidina (BatxC), um peptideo relacionado à catalicidina da glândula de veneno da serpente Bothrops atrox, sobre as formas diferentes formas evolutivas de cepas Y de Trypanosoma cruzi . O tratamento com BatxC em 24,48 e 72h, causou diminuição da viabilidade dos parasitos em praticamente todas as concentrações estudadas (1,56; 3,12;6,25; 12,5;25 e 50μM) com um IC50 de 11,3; 6,33 e 9,6 μM respectivamente, com índice de seletividade de 315. Ensaios com as formas tripomastigotas em diferentes concentrações (0,045; 0,09; 0,18; 0,39; 0,78 e 1,56 μM), demostraram que o BatxC é tóxico a partir das concentrações de 0,18 μM, aproximando-se 100% de letalidade na concentração de 1,56 μM. Finalizando os ensaios de toxicidade do BatxC, ensaios em formas amastigotas também foram realizados após estudo da citotoxidade em células LLC-MK2 e RAW264.7, mostrando que nas concentrações testadas (0,44 e 0,88 μM) em 24 , houve uma redução de 40% e 45% de células infectadas, respectivamente. Em 48h não houve diminuição do percentual de infecção das células. O percentual de inibição das formas amastigotas tratadas com BatxC foi de 33% (IC50) e 43,5% (2xIC50) em 24h, e 23% (IC50) e 33% (2xIC50) em 48h. Esses resultados demostraram uma redução do índice de sobrevivência de formas amastigotas. Posteriormente, ensaios de citometria de fluxo com Anexina VPE e 7-aminoactinomicina (7-AAD), demostraram uma maior população de parasitos marcados com 7-AAD, nas concentrações avaliadas IC50 (11,3μM) e 2x IC50 (22,6μM) demostrando que a morte induzida pela BatxC é predominantemente por necrose. Em seguida foram realizados ensaios com DCF e Rodamina 123, para investigar o envolvimento de espécies reativas de oxigênio (EROS) e alteração do potencial de membrana mitocondrial, na morte celular induzida por BatxC. Os resultados obtidos demostraram que houve um aumento dos EROS e alteração do potencial transmembranico mitocondrial. A via de morte celular de T.cruzi por um mecanismo necrótico foi finalmente confirmada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) que demostrou perda de integridade da membrana celular. Em conclusão, a BatxC inibiu todas as formas evolutivas de cepa Y de T. cruzi, com alto índice de seletividade, induzindo necrose.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este estudo teve como objetivo ampliar a compreensão dos mecanismos de invasão celular por tripomastigotas metacíclicos das cepas G e CL de T. cruzi, que diferem marcadamente em sua infectividade in vitro e in vivo. Os nossos dados indicam que a cepa CL, que utiliza a molécula de superfície gp82 para entrar em células epiteliais in vitro e para invadir o epitélio da mucosa gástrica após inoculação oral em camundongos, aciona durante a invasão vias de sinalização envolvendo proteína quinase C e fosfatidil inositol-3 quinase. Na cepa G, que é pouco infectiva e utiliza gp35/50 para a invasão, são ativadas principalmente adenilato ciclase e a proteína quinase dependente de AMP cíclico. Durante a invasão mediada por gp82, as formas metacíclicas da cepa CL induzem a desorganização do citoesqueleto de actina da célula hospedeira, enquanto a cepa G parece estimular o recrutamento de actina. Consistente com esse achado, a invasão celular de tripomastigotas metacíclicos da cepa CL é inibida na presença de Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC), que depende da actina do citoesqueleto para entrar em células, ao contrário da cepa G. As moléculas gp35/50 e a gp82 recombinante, purificadas, mostraram efeito antagônico sobre a entrada de EIEC em células, a primeira induzindo o aumento e a segunda inibindo a invasão bacteriana. Esses dados, em conjunto, sugerem que a invasão celular mediada por gp35/50 está associada com eventos de sinalização que favorecem o recrutamento de actina, em contraste àquela dependente de gp82, que envolve a indução de vias de transdução de sinal que resulta em despolimerização de Factina. Um outro fator que pode contribuir para a capacidade infectante de formas metacíclicas é a cruzipaína, a cisteíno protease majoritária do T. cruzi. Ao contrário da cepa G, cuja atividade de cruzipaína não é detectável, as formas metacíclicas da cepa CL expressam cruzipaína, cuja atividade, se inibida, interfere na invasão celular. Com este trabalho, mais alguns passos importantes foram dados para a melhor compreensão do processo de infecção por tripomastigotas metacíclicos das cepas G e CL / This study aimed at further understanding the mechanisms of cell invasion by metacyclic trypomastigotes from Trypanosoma cruzi strains G and CL, whose infectivities differ markedly in vitro and in vivo. Our data indicate that the CL strain parasites, which engage the surface molecule gp82 to invade epithelial cells in vitro and to enter the gastric mucosal epithelium upon oral inoculation into mice, triggers the activation of protein kinase C and phosphatidyl inositol 3-kinase signaling pathways. Conversely, the less infective G strain, which invades cells through gp35/50 molecules, induces the activation of adenylate cyclase and cAMP-dependent protein kinase. During gp82-mediated cell invasion by CL strain metacyclic forms, host cell actin cytoskeleton is disorganized whereas the gp35/50- dependent internalization of G strain involves target cell actin recruitment to the site of entry. Compatible with this finding, cell invasion by CL strain but not G strain metacyclic forms is inhibited in the presence of enteroinvasive Escherichia coli (EIEC), which requires the actin cytoskeleton for invasion. Treatment of cells with gp35/50 increased EIEC entry whereas the recombinant gp82 inhibited bacterial invasion. These data suggest that gp35/50-mediated cell invasion is associated with signaling events that favor actin recruitment, as opposed to gp82-dependent internalization, which triggers signal transduction pathways that lead to F-actin depolymerization. Another factor contributing to the infective ability of CL strain metacyclic forms is cruzipain, the T. cruzi´s major cysteine proteinase, which is undetectable in G strain. Our work provides further important information towards understanding the mechanisms underlying infection by T. cruzi metacyclic trypomastigotes / BV UNIFESP: Teses e dissertações

BEZERRA, Claudia Mendonça. Hospedeiros domésticos, peridomiciliares e silvestres na transmissão de Trypanosoma cruzi pelo Triatoma brasiliensis em área de caatinga no município de Tauá – CE. 2013. 147 f. Dissertação (Mestrado em Saúde Pública) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-08-02T12:56:23Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_cmbezerra.pdf: 3319817 bytes, checksum: fa73aea1a25305b0c8d1fef88b66caa3 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-08-06T11:51:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_cmbezerra.pdf: 3319817 bytes, checksum: fa73aea1a25305b0c8d1fef88b66caa3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T11:51:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_cmbezerra.pdf: 3319817 bytes, checksum: fa73aea1a25305b0c8d1fef88b66caa3 (MD5) Previous issue date: 2013 / Traditionally, the control of human transmission of Trypanosoma cruzi is accomplished by the application of insecticides with residual action. However, knowledge about the role of hosts domestic and wild outdoor environments are critical for determining the maintenance and / or dispersion of T. cruzi. This study aimed to characterize the importance of domestic reservoirs, wild and peridomestic transmission of T. cruzi in the rural municipality of Taua (EC), inserted in Caatinga area, with emphasis on environments colonized by Triatoma brasiliensis. Among the animals household and neighbors were considered dogs, cats, pigs, goats and sheep 83 housing units (DUs). In the wild capture and examination was performed on small mammals at three sites with different degrees of antropofização, and also the capture of insects. The survey of domiciliary infestation by triatomines was performed in 251 DUs. Direct parasitological examinations were performed in insects and mammals, animals in serologic household and neighbors, Multiplex PCR on wild reservoirs and research of wild food source for insects. The proportion of infection of pigs was 6% (2/34), ovine 1% (1/102), cats 2.4% (1/41) dogs 38% (20/53). We captured nine species among rodents and marsupials. The Trichomys laurentius, with 74% (83/112), was the most abundant and widely distributed in the wild, followed by rock Kerodon 10% (11/112) and Didelphis albiventris 3.5% (4/112). 749 triatomines were captured in the household survey, with 369 (49.3%) of T. brasiliensis and 377 (50.3%) of Triatoma pseudomaculata. Only specimens of T. brasiliensis were infected with T. cruzi (25, 12.8%). Of these 3 (5.9%) were inside the home and 22 (14%) outside the home. Of the 166 triatomines captured, 132 (79%) were nymphs and other 35 (21%) adults. These, a fifth instar nymph and one male were infected with T. cruzi. The T. brasiliensis sharing the natural environment with T. laurentius, K. rock, D. albiventris, M. domestica, G. spixii, W. pyrrhorinos, C. and M. semistriatus musculus (captured animals) and G. spixii, K. cave, T. oreadicus and T. merianae (identified via food source), and animals observed during the catch (Athene cuniculariae and Felis catus) and confirmed via food source (C. hircus and G. gallus). The movement of the T. cruzi between sylvatic, peridomestic household in mammals and insects emphasizes the possibility of cases of Chagas disease in the studied region, as well as the difficulty and real necessity for its control in semi-arid areas in Northeast Brazil. / Tradicionalmente o controle da transmissão humana do Trypanosoma cruzi é realizado pela aplicação de inseticidas de ação residual. Entretanto, o conhecimento sobre o papel desempenhado por hospedeiros domésticos, peridomiciliares e silvestres são fundamentais para a determinação da manutenção e/ou dispersão do T. cruzi. Esta pesquisa teve por objetivo caracterizar a importância dos reservatórios domésticos, peridomiciliares e silvestres na transmissão de T. cruzi na zona rural do município de Tauá (CE), inserido em área de Caatinga, com ênfase nos ambientes colonizados por Triatoma brasiliensis. Dentre os animais domiciliares e peridomiciliares foram considerados cães, gatos, suínos, caprinos e ovinos de 83 unidades domiciliares (UDs). No ambiente silvestre foi realizada captura e exame de pequenos mamíferos em três locais, com diferentes graus de antropofização, e também a captura de triatomíneos. A pesquisa de infestação domiciliar por triatomíneos foi realizada em 251 UDs. Foram realizados exames parasitológicos diretos em insetos e mamíferos, sorológicos em animais domiciliares e peridomiciliares, PCR Multiplex em reservatórios silvestres e pesquisa de fonte alimentar em insetos silvestres. A proporção de infecção para os suínos foi de 6% (2/34), ovinos 1% (1/102), gatos 2,4% (1/41), cães 38% (20/53). Foram capturados nove espécies dentre roedores e marsupiais. O Trichomys laurentius, com 74% (83/112), foi a mais abundante e amplamente distribuída no ambiente silvestre, seguida por Kerodon rupestres 10% (11/112) e Didelphis albiventris 3,5% (4/112). Foram capturados 749 triatomíneos na pesquisa domiciliar, sendo 369 (49,3%) de T. brasiliensis e 377 (50,3%) de Triatoma pseudomaculata. Apenas espécimes de T. brasiliensis estavam infectados por T. cruzi (25, 12,8%). Destes 3 (5,9%) estavam no intradomicílio e 22 (14%) no peridomicílio. Dos 166 triatomíneos silvestres capturados, 132 (79%) eram ninfas e outros 35 (21%) adultos. Destes, uma ninfa de 5º estádio e um macho encontravam-se infectados pelo T. cruzi. O T. brasiliensis partilha o ambiente natural com T. laurentius, K. rupestres, D. albiventris, M. domestica, G. spixii, W. pyrrhorinos, C. semistriatus e M. musculus (animais capturados) e com G. spixii, K. rupestres, T. oreadicus e T. merianae (identificados via fonte alimentar), além de animais observados durante as capturas (Athene cuniculariae e Felis catus) e confirmados via fonte alimentar (C. hircus e G. gallus). A circulação do T. cruzi entre o ambiente silvestre, peridomiciliar e intradomiciliar em mamíferos e insetos enfatiza a possibilidade de ocorrência de casos da doença de Chagas na região estudada, bem como a dificuldade e real necessidade de seu controle em áreas do semiárido no Nordeste Brasileiro.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T21:13:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 328413.pdf: 6003694 bytes, checksum: cbbd067975d73d6c668de99d7111401e (MD5) Previous issue date: 2014 / A família das trans-sialidases (TS) é a maior família gênica de Trypanosoma cruzi. O grupo II da superfamília TS reúne diversas glicoproteínas (entre elas, a gp82 e a gp85) presentes na superfície das formas tripomastigotas do T. cruzi. A gp82 está envolvida no processo de adesão do parasito à célula hospedeira e a gp85 na adesão e penetração. Embora sialidases estejam presentes no T. rangeli, a função destas proteínas no ciclo de vida deste parasito ainda não foi esclarecida. Em função disso, o objetivo deste estudo foi estudar os genes de T. rangeli relacionados à superfamília das TS e avaliar a expressão heteróloga da gp82 de T. cruzi por T. rangeli (T. rangeli-gp82). Inicialmente, foram identificadas no genoma do T. rangeli oito ORFs completas similares a gp82 e gp85 de T. cruzi. Por se tratar de várias cópias gênicas, diferentes sequências foram analisadas a partir de amplificação e clonagem destes genes em duas cepas de T. rangeli. As sequências avaliadas continham de um a dois motivos Asp, um motivo subterminal, sítio de ancoramento a GPI e um domínio que pertence a superfamília das glucanases/lectina tipo Concanavalina A. Após a obtenção da cepa recombinante T. rangeli-gp82, observou-se que a gp82 foi expressa na superfície dos parasitos de forma semelhante ao T. cruzi. Além disso, a expressão da gp82 não interferiu nos padrões de crescimento e de diferenciação in vitro do T. rangeli. Em ensaios de interação destes parasitos com células Vero, verificamos um maior número de parasitos da cepa T. rangeli-gp82 nas células hospedeiras em relação à cepa selvagem, além de um maior número de parasitos aderidos às células em relação as demais cepas analisadas. Tanto as formas epimastigotas quanto tripomastigotas de T. rangeli-gp82 foram capazes de mobilizar cálcio intracelular. Estes resultados diferem do observado na interação com células THP-1, onde não verificamos diferença significativa entre T. rangeli-gp82 e as demais cepas analisadas. Em triatomíneos, verificamos que a cepa T. rangeli-gp82 apresenta desenvolvimento semelhante à cepa selvagem, sendo capaz de colonizar a hemolinfa e invadir as glândulas salivares de R. prolixus. Em camundongos, tripomastigotas de todas as cepas de T. rangeli foram observados na corrente sanguínea de animais C57BL/6 infectados via intraperitoneal, porém não foi observada proliferação, sendo a cinética parasitêmica similar para todas as cepas do T. rangeli. Quando estes camundongos foram desafiados com T. cruzi, não observamos alteração na parasitemia deste parasito em relação à infecção controle, entretanto houve uma diminuição do parasitismo tecidual por este parasito nos animais pré-infectados com as três cepas de T. rangeli, principalmente T. rangeli-selvagem e GFP. Com estes resultados, podemos inferir que a proteína gp82 facilita a adesão e penetração do parasito a célula hospedeira, entretanto a expressão desta proteína pelo T. rangeli não promove uma proteção substancial contra a infecção por T. cruzi.

Made available in DSpace on 2014-05-29T12:27:47Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69318.pdf: 2705339 bytes, checksum: 57938129a86016619372b159e93db18e (MD5) 69318.pdf.txt: 146396 bytes, checksum: d375b57913c69cc2fa43e4ddc043a908 (MD5) 69318.pdf.jpg: 1174 bytes, checksum: eee38814774015c69c4605ad49e693ac (MD5) Previous issue date: 2014-05-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, Brasil / Os métodos de diagnóstico usados hoje para a Doença de Chagas, embora simples e de baixo custo, podem apresentar baixas sensibilidade e especificidade ou reações cruzadas com outros patógenos. Da mesma forma, os medicamentos usados no tratamento apresentam severos efeitos colaterais. Dentre os vários alvos metabólicos sugeridos, as proteases têm sido apontadas como moléculas candidatas devido às suas particularidades. Recentemente o nosso grupo identificou duas aspartil proteases em T. Cruzi: uma solúvel (Cruzipsina-II) e outra membranar (Cruzipsina-I); entretanto, suas funções biológicas permaneceram desconhecidas. Os nossos resultados demonstram, pela primeira vez, a existência de um complexo proteolítico membranar em T. Cruzi com propriedades similares ao complexo \03B3-secretase de outras células eucarióticas. Usando ferramentas de bioinformática localizamos em banco de dados as sequências primárias de 3 das 4 proteínas do complexo (presenilina, nicastrina e Aph-1). Esta informação foi importante para caracterizarmos através de síntese paralela de peptídeos os epitopos B lineares das 3 proteínas usando soros de pacientes. A presenilina apresentou 10 epitopos majoritários, a nicastrina, 5 e a Aph-1, 10. Alguns epitopos foram selecionados por vários critérios e anticorpos anti-peptídeos obtidos em coelhos. O soro anti-peptídeo PRE-2 de presenilina identificou por immunoblotting a banda de 48kDa na fração CZP-I como sendo presenilina, enquanto o soro anti-peptídeo NIC-1 de nicastrina apresentou também uma marcação na mesma posição A análise por microscopia confocal em epimastigotas localizou as proteínas predominantemente nas regiões anterior e mediana das células. Além disso, as marcações mostraram-se mais fortes em células permeabilizadas, sugerindo a co-localização de ambas as proteínas nas membranas internas da célula. Um teste de ELISA empregando 4 peptídeos sintéticos da presenilina e nicastrina de T. Cruzi apresentou sensibilidade e especificidade de 71,59% e 70,53%, respectivamente. Utilizando a extração diferencial com detergente e análise por EGPA-SDS após cromatografia de afinidade, confirmamos na cepa CL Brener de T. Cruzi o perfil de bandas presentes na cepa Y, de 240, 56, 48 e 34 kDa na fração CZP-I (detergente) e 56, 52, 37 e 34 kDa na fração CZP-II (solúvel). Ensaios enzimáticos usando o inibidor L-685,458 e moduladores alostéricos DAPT e Composto XXI/E da presenilina humana sugeriram que aparentemente o sítio catalítico da presenilina de T. Cruzi possui uma constituição semelhante ao da presenilina humana, enquanto diferenças significativas puderam ser observadas no sítio alostérico. O inibidor de sítio ativo L-685,458 foi capaz de inibir 100% da atividade enzimática em 5\03BCM, enquanto os moduladores DAPT e Composto XXI/E não apresentaram uma inibição significativa. Portanto, os nossos estudos sugerem que devido as suas funções enzimáticas e localização celular a presenilina do T. Cruzi é um bom alvo quimioterapêutico e imunológico / The diagnostic methods used today for Chagas disease, although simple and may present low sensitivity and specificity or cross drugs used nowadays to treat metabolic targets suggested, proteases have been identified as candidate molecules due to its particularities. Recently our group identified two aspartyl proteases in (Cruzipsin-II) and a membrane remained unknown. Our results demonstrat proteolytic complex in T. cruzi eukaryotic cells. Using bioinformatics tools proteins (presenilin, nicastrin and Aph information was important for parallel synthesis of peptides epitopes of proteins using sera from eight patients. P nicastrina, 5 and Aph-1, 10. Some epitopes we sera were obtained in rabbits. Serum immunoblotting a 48 kDa band in fraction CZP of nicastrin also presented a marking in the same position. of epimastigotes localized addition, the markings were localization of both proteins in the inner membranes of the cell. An ELISA employ synthetic peptides for T. cruzi specificity and 70.53%. Using after affinity chromatography confirm were like those of strain Y: 37 and 34 kDa in CZP-II fraction (soluble allosteric modulators DAPT and Compound XXI/E that the catalytic site of T. cruzi while significant differences were observed in the allosteric site. T 685,458 was able to inhibit 100% of enzyme activity at 5 and Compound XXI/E showed no significant inhibition. Therefore, our studies suggest that due to their enzymatic funct target for chemotherapeutic and cross-reactions with other pathogens. Likewise, Chagas disease show severe side effects. Among the various membrane-bound (Cruzipsin-I); however, their demonstrate for the 1st time, the existence of a with similar properties to the -secretase tools, the primary sequences of three of four complex Aph-1) where localized at a protein database. and the identi Presenilin presented were selected by different criteria and anti anti-peptide PRE-2 of presenelin CZP-I as presenelin, while the anti Analysis by confocal microscopy the proteins mainly at anterior and middle portions of th found to be stronger in permeabilized cells, suggesting co presenilin and nicastrin presented sensitivity . differential detergent extraction and analysis by SDS confirmed that the profile bands present in the strain CL Brener 240, 56, 48 and 34 kDa in fraction CZP-I (detergent), and 56, 52, soluble). Enzyme assays using the inhibitor L APT of human presenilin apparently suggested presenilin has a constitution similar to the human presenilin, The active site inhibitor 458 M, while the modulator functions and cellular localization the presenilin for immune system. unexpensive, T. cruzi: a soluble biological functions membrane complex of other This identification of linear 10 major epitopes, re anti-peptide identified by , anti-peptide NIC-1 the cells. In colocalization employing four of 71.59% and SDS-PAGE says L-685,458 and he LM, modulators DAPT of T. cruzi is a good target for chemotherapeutic and for immune system.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-07-15T23:18:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 223531.pdf: 979006 bytes, checksum: 09cf3ec36da16e960e9f315e1d955827 (MD5) / O Trypanosoma rangeli é um protozoário flagelado, pertencente à Ordem Kinetoplastida, capaz de infectar triatomíneos, mamíferos silvestres e domésticos, bem como o homem nas Américas Central e do Sul. Quando comparado a organismos do mesmo gênero, é notória a falta de informações existentes acerca deste parasito, sobretudo a nível molecular. No presente estudo, apresentamos os resultados obtidos a partir da geração e seqüenciamento de 4 bibliotecas de cDNA de formas tripomastigotas da cepa Choachi de T. rangeli, utilizando a técnica ORESTES. O seqüenciamento dos clones obtidos resultou na geração de 2.475 ORESTES, das quais 1.295 (52,3%) apresentaram alta qualidade (Phred=15). O agrupamento das seqüências resultou em 758 seqüências não redundantes com tamanho médio de 341pb e conteúdo G+C de 54%. Destas seqüências, apenas 2,5% apresentaram similaridade com seqüências deste parasito, 61,21% com outros tripanosomatídeos e somente 5,28% com outros organismos. Além disso, 31% das ORESTES geradas não apresentaram similaridade com seqüências depositadas nos bancos de dados públicos consultados, as quais podem estar representando genes únicos do T. rangeli, os quais ainda não foram caracterizados, genes desconhecidos ou mesmo artefatos da técnica. Estes resultados representam as primeiras seqüências do transcriptoma desta forma evolutiva do parasito.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T05:11:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340762.pdf: 2249783 bytes, checksum: 26401702acb67e78e563d1df40ac6d86 (MD5) Previous issue date: 2016 / O mecanismo de RNA de interferência (RNAi) é um sistema pós-transcricional de silenciamento gênico com ampla distribuição nos organismos eucariotos. Os pequenos RNA (siRNA e miRNA) são considerados moléculas chaves nesse mecanismo, os quais são gerados pela proteína Dicer. A presença desse sistema parece não seguir um padrão de distribuição filogenético e a sua evolução ainda não foi compreendida. Entre os protozoários, o mecanismo de RNAi está muito bem caracterizado em Trypanosoma brucei, entretanto é ausente em Trypanosoma cruzi e em muitas espécies de Leishmania. O Trypanosoma rangeli não possui vários componentes da maquinaria de RNAi, tornando-a não funcional. Entretanto, o gene que codifica para a Dicer- Like2 (DCL2) foi encontrado completo em seu genoma, enquanto os demais genes codificantes para as outras proteínas da maquinaria estão truncados (pseudogenes). No presente estudo realizamos a caracterização do gene DCL2 de T. rangeli (TrDCL2), o qual apresentou-se como cópia única no genoma do parasito, possuindo uma janela aberta de leitura com 2.667 pb que codifica para uma proteína de 889 aminoácidos (±100 kDa). Foram reveladas diferenças nas sequências aminoacídicas da TrDCL2 entre as cepas KP1(+) e KP1(-) de T. rangeli e devido uma mudança na fase de leitura não é possível identificar os domínios RNAse III nas cepas KP1(-). O gene TrDCL2 é transcrito nas cepas KP1(+), sendo que os níveis de mRNA não apresentam alterações significativas durante o processo de diferenciação celular in vitro do parasito. Visando a avaliação da atividade enzimática e análise da presença e níveis proteicos, realizamos a expressão heteróloga de dois fragmentos e da proteína TrDCL2 inteira. Um dos fragmentos foi utilizado para a produção de um antissoro policlonal anti-TrDCL2. Este antissoro reconheceu uma proteína do tamanho esperado (±100 kDa) nos extratos proteicos totais das formas epimastigotas e tripomastigotas de T. rangeli. Os ensaios de imunofluorescência indireta, utilizando o mesmo antissoro, revelaram uma distribuição difusa da proteína pelo citoplasma de ambas as formas do parasito. A TrDCL2 é expressa em algumas cepas do T. rangeli, entretanto a determinação do seu papel biológico neste parasito ainda permanece a ser elucidada.<br> / Abstract : The interference RNA mechanism (RNAi) is a system of post-transcriptional gene silencing with wide distribution in the eukaryotes. Small RNA (siRNA e miRNA) are considered key molecules in this mechanism, which are generated by Dicer protein. The presence of this system seems not follow a pattern of phylogenetic distribution and its evolution is still not understood. Between trypanosomatids, the RNAi mechanism is well described in Trypanosoma brucei, but is absent in Trypanosoma cruzi and some Leishmania species. Trypanosoma rangeli does not have many components of RNAi machinery, making it not functional. However, the Dicer-Like2 (DCL2) coding gene was fully encountered in its genome, while the other genes of this machinery are truncated (pseudogenes). In the present study, we have realized the characterization of DLC2 gene of T. rangeli (TrDCL2), which presented a single copy in the parasite genome, having an open reading frame with 2.667 bp that encodes a protein with 889 amino acids (±100 kDa). Differences in aminoacidic sequences were revealed between strains KP1(+) and KP1(-) of T. rangeli and due to a change in the reading phase it was not possible to identify RNAse III domains in the KP1(-) strains. TrDCL2 gene is transcripted in the KP1(+), the mRNA levels do not show significant alterations during the process of cellular differentiation in vitro. Aiming the evaluation of the enzymatic activity and the analysis of the presence of the protein and its levels, we realized the heterologous expression of two fragments and the whole protein TrDCL2. One of the fragments was used to produce a polyclonal antiserum anti-TrDCL2. This antiserum recognized a protein with the expected size (±100 kDa) in the total protein extracts of the epimastigotes and trypomastigotes of T. rangeli. Imunofluorescence assays, using the same antiserum, revealed a diffuse distribution of the protein in the cytoplasm in both forms of the parasite. The TrDCL2 is expressed in some strains of T. rangeli, but the determination of its biological role in this parasite still needs to be elucidated.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-03-28T04:11:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 344593.pdf: 4945044 bytes, checksum: be573a4fe45eca3dde59625b082bf902 (MD5) Previous issue date: 2016 / Trypanosoma rangeli é um parasito hemoflagelado pertencente à Ordem Kinetoplastea, grupo ancestral de protistas que contém grande diversidade de espécies, entre elas organismos de vida livre e parasitos com distintos mecanismos de resposta ao estresse oxidativo. Um dos objetivos deste trabalho foi caracterizar in silico enzimas envolvidas direta ou indiretamente na defesa antioxidante de T. rangeli, além de compará-las a suas ortólogas junto a diferentes espécies de Kinetoplastídeos. Dos genes analisados, não foram identificados em T. rangeli: cisteína sintase, ornitina decarboxilase, glutamilespermidina sintase e ascorbato peroxidase, embora o primeiro e o último tenham sido identificados como pseudogenes. Todos os genes foram identificados em Bodo saltans, sugerindo que os mecanismos antioxidantes evoluíram antes do aparecimento do parasitismo nesse grupo. De forma geral, observou-se que a variabilidade de enzimas no sistema antioxidante a nível genômico entre tripanosomatídeos relaciona-se a adaptações específicas ao parasitismo em ampla gama de hospedeiros e sua transmissão pelos vetores e não somente ao isolamento geográfico. Entre as enzimas analisadas, duas destacam-se em relação a infectividade e virulência em tripanosomatídeos patogênicos, a tripanotiona redutase (TRed) e triparedoxina peroxidase em suas isoformas citosólica (TRPxcit) e mitocondrial (TRPxmit). O gene da TrTRed possui uma ORF de 1.473 pb (~490 aa/ 53 kDa) estando presente em cópia única no genoma haploide de T. rangeli. A análise da proteína predita da TrTRed revelou a presença de dois domínios relacionados à ação oxidoredutase. O gene da TrTRPxcit apresentou-se com 549 pb gerando uma proteína com 182 aminoácidos (~ 20 kDa), enquanto para TrTRPxmit a ORF possui 681pb que prediz uma sequência de 266 aminoácidos (~25 kDa). A análise das sequências aminoacídicas deduzidas da TrTRPxcit e TrTRPxmit revelou a presença dos domínios VCP e ICP, respectivamente, além das cisteínas peroxidásica (Cp) e de resolução (Cr). A análise da expressão gênica e proteíca de TrTREd, TrTRPxcit e TrTRPxmit revelou ausência de expressão significativa estágio-específica, porém a espressão da TRed é significativamente maior em T. cruzi do que em T. rangeli. O estresse oxidativo gerado pela adição de H2O2 não induziu alterações significativas na expressão de nenhuma proteína analisada. A presença de antioxidantes como N-acetilcisteína (NAC) e glutationa reduzida (GSH) no meio induziu a proliferação de epimastigotas in vitro, mas não alterou o perfil de expressão da TrTRed ao longo do tempo. A síntese de NADPH foi reduzida e a produção endógena de H2O2 é maior em T. rangeli quando comparada a T. cruzi. Estudos enzimáticos em extratos de T. rangeli mostraram maior atividade da TRed em epimastigotas do que em tripomastigotas. A superexpressão da proteína TrTRed não influenciou o crescimento ou o processo de diferenciação em tripomastigotas in vitro e os parasitos transfectados (TRed+) mostraram aumento na resistência ao estresse induzido pelo H2O2. Conclui-se que o T. rangeli apresenta uma maquinaria de defesa antioxidante semelhante ao T. brucei e ao T. cruzi em função de presença/ausência de genes e quanto à similaridade nas sequências, respectivamente. Além disso, a TrTRed parece não ser a principal envolvida na resposta do T. rangeli ao ambiente oxidante em células do hospedeiro vertebrado, mas possui papel crucial durante a infecção do hospedeiro invertebrado.<br> / Abstract : Trypanosoma rangeli belongs to the Order Kinetoplastea, an ancestral group of protists containing a variety of free-living and parasitic species with distinct mechanisms of antioxidant defence. In this study we have characterized in silico the enzymes directly or indirectly involved on the T. rangeli response t oxidative stress and to comparatively characterize to its orthologs on other kinetoplastids. Ornithine decarboxylase, glutamyl spermidin synthase were not found on the T. rangeli genome while cysteine synthase and ascorbate peroxidase were found as pseudogenes. Since all genes related to antioxidant defence were found on Bodo saltans we hypothesize that such mechanism has evolved prior the parasitic lifestyle. As a rule, we have observed that genomic variability among the antioxidant system genes from trypanosomatids are related to specific adaptations to a parasitic lifestyle between distinct hosts and vectors instead of geographical isolation. Among the studied enzymes, the trypanotion reductase (TRed) and the cytosolic (TRPxcit) and mitochondrial (TRPxmit) forms of tryparedoxin peroxidase are related to virulence and infectivity. The T. rangeli TRed (TrTRed) is a singe-copy gene and has an ORF of 1.473 bp (~490 aa/ 53 kDa) and the predicted TrTRed proteins revealed two oxidoreductase-related domains. The TrTRPxcit gene is 549 bp long coding to a 182 aa protein (~ 20 kDa) while the TrTRPxmit is 681 bp long, predicting to 266 aa protein (~25 kDa). Both TrTRPxcit and TrTRPxmit proteins revealed the presence of the VCP and ICP domains, respectively, along the peroxidatic cysteine (Cp) and resolving cysteine (Cr). The transcription and expression profiles of TrTREd, TrTRPxcit and TrTRPxmit revealed the no stage-specific differences, but was significatly higher in T. cruzi than T. rangeli. No differences on expression were observed for any of the analyzed genes when parasites were exposed to an H2O2-induced stress. Addition of antioxidants such as NAC and GSH on the culture media induced proliferation of epimastigotes in vitro, not altering the TrTRed expression overtime. NADPH generation is lower and production of endogenous H2O2 is higher in T. rangeli Choachí strain than in T. cruzi Y strain epimastigotes. Enzymatic assays revealed an increased activity of TRed on T. rangeli epimastigotes than trypomastigotes. Overexpression of TrTRed has no influence on the growth or on the in vitro differentiation to trypomastigotes, but transfectants revealed an increased resistance to a H2O2-induced stress. Based on the presence/absence of genes and on the sequence similarity, the T. rangeli antioxidant machinery is related to T. brucei and to T. cruzi, respectively. Also, TrTRed seems not to be the main enzyme involved on the T. rangeli response to the oxidative stress on the mamalian host, but having crucial relevance on the infection of the insect vectors.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T12:39:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O Trypanosoma rangeli é um parasita hemoflagelado que infecta uma grande variedade de espécies de mamíferos, incluindo o homem, nas Américas Central e do Sul. Devido a possibilidade da ocorrência de reações sorológicas cruzada com o T. cruzi, diversos estudos tem se voltado para a obtenção de formas tripomastigotas de T. rangeli. Recentemente nosso grupo padronizou a diferenciação do T. rangeli in vitro incubando parasitas em meio DMEM obtendo-se cerca de 80% de formas tripomastigotas. Testando individualmente cada um dos aminoácidos presentes no meio DMEM, parasitas incubados em L-glutamina apresentaram taxas de diferenciação superiores a 80%, enquanto que a incubação com outros aminoácidos induziram baixas diferenciações e/ou altas mortalidades. A adição de DFMO, um inibidor específico e irreversível da ornitina descarboxilase (ODC), reduziu drasticamente as taxas de diferenciação, que foram recuperadas apenas após a adição de putrescina, sugerindo que a ODC é uma enzima chave na regulação da diferenciação do T. rangeli in vitro. Porém, a incubação de parasitas com as poliaminas putrescina, espermidina e espermina, sem L-glutamina, ocasionou altas mortalidades, sugerindo a importancia da L-glutamina para a manutenção do T. rangeli. Também padronizamos duas metodologias distintas para produção e purificação de tripomastigotas de cultura e sangüíneos pelas metodologias de cromatografia de troca iônica, utilizando CM-celulose, e centrifugação diferencial de gradiente, utilizando Histopaque - 1077® respectivamente. A recuperação de tripomastigotas de cultura ficou em torno de 20% e dos tripomastigotas sangüíneos ficou em torno de 40%. Nossos resultados abrem novas perpectivas para estudos da biologia deste parasita, principalmente em relação a regulação gênica e expressão de proteínas de interesse para o diagnóstico diferencial entre T. rangeli e T. cruzi.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-22T05:27:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 200174.pdf: 780725 bytes, checksum: 5105c9e6dff3c5b93f852902d1aee0fc (MD5) / O Trypanosoma rangeli, bem como o T. cruzi, são protozoários parasitas da Ordem Kinetoplastida sendo amplamente distribuídos nas Américas Central e do Sul, onde compartilham reservatórios, vetores em regiões geográficas distintas. Infecções produzidas pelo T. cruzi resultam na doença popularmente conhecida como mal de Chagas enquanto que as infecções causadas pelo T. rangeli parecem não ser patogênicas para seres humanos. Apesar disso, cerca de 60% da constituição antigênica solúvel destes parasitas é compartilhada o que pode determinar reações sorológicas cruzadas, dificultando o diagnóstico específico e mascarando a epidemiologia da doença de Chagas humana. As metodologias rotineiramente utilizadas no diagnóstico da doença de Chagas não são capazes de distinguir entre as duas espécies fazendo-se necessária a abertura de novas estratégias que nos permitam distinguí-las de maneira fácil, rápida e economicamente viável. No presente trabalho apresentamos os resultados obtidos à partir da construção e seqüenciamento de três bibliotecas de cDNA de formas epimastigotas da cepa Choachi de T. rangeli que resultaram na obtenção de 656 ESTs, dentre as quais apenas 20 ESTs foram homólogas à seqüências de T. rangeli e 245 não apresentaram homologia com seqüências dos bancos de dados pesquisados. Estes resultados demonstram a importância do uso deste tipo de estratégia para obtenção de novas informações à respeito do T. rangeli, servindo como base para a identificação de alvos diagnósticos ou para estudos da e suas interações com seus hospedeiros.