Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2017. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-05-11T17:55:25Z No. of bitstreams: 1 2017_JulianaVieiraFerreiraName.pdf: 1833058 bytes, checksum: b4c218ac98286257ce515f3efda357b8 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2017-05-17T12:34:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_JulianaVieiraFerreiraName.pdf: 1833058 bytes, checksum: b4c218ac98286257ce515f3efda357b8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-17T12:34:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_JulianaVieiraFerreiraName.pdf: 1833058 bytes, checksum: b4c218ac98286257ce515f3efda357b8 (MD5) / A Doença de Chagas ou tripanossomíase americana é uma doença causada pelo parasita protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi) e é considerada endêmica em 21 países da América Latina. Estudos mostraram que a infecção por T. cruzi interfere na expressão em nível pós-transcricional de proteínas da via de apresentação MHC classe I, especificamente as subunidades induzíveis do imunoproteassoma (β1i, β2i e β5i), a subunidade PA28α, a proteína TAP e o MHC I. O presente estudo teve como objetivo avaliar se as regiões 5’ e 3’ UTR dos mRNAs dessas proteínas estão envolvidas na inibição da expressão no nível traducional pelo parasita, utilizando como modelo a subunidade β1i do imunoproteassoma. Para isso, essas duas regiões foram amplificadas e clonadas flanqueando o gene repórter EGFP em um vetor de expressão para células eucarióticas. Células transfectadas foram infectadas com T. cruzi e após quatro dias foram realizadas citometria de fluxo e microscopia de fluorescência para analisar a expressão da EGFP. Foi possível observar que as células HeLa transfectadas com a montagem do gene EGFP contendo as regiões 5’UTR e 3’UTR da subunidade B1i e infectadas com o parasita apresentaram queda na expressão da EGFP em sua população. Em uma visão mais individualizada por microscopia foi observado que células que apresentavam uma parasitemia elevada não emitiam fluorescência, ou apresentavam menor intensidade que as células na mesma população não infectadas. Nas células transfectadas com o gene EGFP sem as regiões UTRs observamos que a presença dos parasitas no interior das células não interferiu na expressão da EGFP. Esses resultados indicam que há uma interferência na expressão da subunidade β1i do imunoproteassoma durante a infecção por T. cruzi e que as regiões UTR são alvos nesse processo de inibição pós-transcricional. / Chagas disease or American trypanosomiasis is a disease caused by the protozoan parasite Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and is considered endemic in 21 countries in Latin America. Studies have shown that T. cruzi infection interferes in post-transcriptional level expression of MHC class I pathway proteins, specifically the inducible subunits of the immunoproteasome (β1i, β2i and β5i), the PA28α subunit, the TAP protein and the MHC I. The present study aimed to evaluate whether the 5 'and 3' UTR regions of the mRNAs of these proteins are involved in the inhibition of expression at the translational level by the parasite, using as template the β1i subunit of the immunoproteasome. To that end, these two regions were amplified and cloned flanking the EGFP reporter gene into an expression vector for eukaryotic cells. Transfected cells were infected with T. cruzi and after four days flow cytometry and fluorescence microscopy were performed to analyze EGFP expression. It was possible to observe that HeLa cells transfected with EGFP gene assembly containing the 5'UTR and 3'UTR regions of the β1i subunit and infected with the parasite showed a decrease in EGFP expression in their population. In a more individualized view by microscopy it was observed that cells that had a high parasitemia did not emit fluorescence or were emitted much less intensely than cells in the same uninfected population. In cells transfected with the EGFP gene without the UTRs regions we observed that the presence of the parasites inside the cells did not interfere in the EGFP expression. These results indicate that there is interference in the expression of the β1i subunit of the immunoproteasome during T. cruzi infection and that the UTR regions are targets in this post-transcriptional inhibition process.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Ruthléa Nascimento (ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2014-05-20T12:37:28Z No. of bitstreams: 1 2014_AgenordeCastroMoreiradosSantosJunior.pdf: 2582950 bytes, checksum: b1ada59cf3e421cbc9fe13c04ade54a9 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-21T11:48:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_AgenordeCastroMoreiradosSantosJunior.pdf: 2582950 bytes, checksum: b1ada59cf3e421cbc9fe13c04ade54a9 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-21T11:48:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_AgenordeCastroMoreiradosSantosJunior.pdf: 2582950 bytes, checksum: b1ada59cf3e421cbc9fe13c04ade54a9 (MD5) / O Trypanosoma cruzi é o protozoário causador da doença de Chagas, uma parasitose de grande relevância na América Latina. A divisão celular do T. cruzi possui características incomuns à maioria dos eucariotos, dado que durante o processo não ocorre o desaparecimento da membrana nuclear e condensação de seus cromossomos. O objetivo deste trabalho foi o estudo do conjunto de proteínas (proteoma) presentes no núcleo da forma epimastigota do T. cruzi. Para tanto, lisados celulares do parasito foram submetidos a um fracionamento celular por ultracentrifugação em gradiente de sacarose. O enriquecimento nuclear foi validado por microscopia de fluorescência com marcação para DNA e as imagens comparadas com a microscopia de campo claro, mostrando que a fração nuclear foi obtida com alto grau de pureza. A análise por SDS-PAGE mostrou diferenças evidentes de perfil proteico entre o extrato nuclear e extratos das demais frações obtidas durante o fracionamento. As proteínas do subproteoma nuclear foram posteriormente analisadas por eletroforese bidimensional (2-DE) e por digestão tríptica seguida de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). Usando esta última abordagem foi identificadas mais de 800 proteínas sendo quase 30% hipotéticas. Dentre os principais processos biológicos encontrados para as proteínas identificadas estão processos catabólicos, biossintéticos, geração de metabólitos e energia, processo metabólicos nucleares e tradução. As proteínas encontradas poderão ser alvos de futuros estudos para a elucidação de processos como divisão celular, transcrição gênica e formação de cromossomos, que hoje ainda não são bem elucidados. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Trypanosoma cruzi is a protozoan that causes Chagas´ disease, a disease of great relevance in Latin America. The replication process of the T. cruzi possesses unusual features, when compared to other eukaryotes; given that during this process, the nuclear membrane does not disappear and there is not chromosome condensation. The goal of this project was to study the set of proteins (proteome) that are present in the nucleus of the T. cruzi epimastigote life form. To this end, the parasite cell lysates were subjected to cell fractionation by sucrose gradient ultracentrifugation. As a way to validate these purity of the isolated cell fractions, we used optical microscopy methods including bright field analysis and fluorescence microscopy after DNA labeling. The images demonstrated that the nuclear fractions were obtained with high purity. Furthermore, SDS-PAGE analysis showed differences in protein profiles between the nuclear extracts and extracts of other fractions obtained during the fractionation. The proteins of the nuclear subproteome were subsequently analyzed by two-dimensional electrophoresis (2-DE) and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Using the latter approach, we identified more than 800 proteins with almost 30 % being hypothetical. Among these proteins many are involved in important biological processes such as catabolic and biosynthetic pathway, metabolites and energy generation, nuclear metabolites and translation. Hence, the proteins describe in this work may be use in future studies to elucidate processes such as cell division, transcription and chromosomes packaging, which are not fully well understood.

A tripanossomose africana, ou doença do sono, como é popularmente conhecida, atingiu 25 mil pessoas só em 1995. Estima-se que a doença seja responsável pela morte de 10.000 pessoas a cada ano, segundo os dados da Organização Mundial da Saúde. Sua distribuição é exclusivamente africana, devido ao fato de sua transmissão depender da Tsé-Tsé, mosca do gênero Glossina que encontra lá condições favoráveis para sua proliferação. Atualmente os medicamentos existentes não são eficientes e devem ser ministrados em doses altas, provocando graves efeitos colaterais. O parasita Tripanosoma brucei, na forma encontrada no sangue dos mamíferos (tripomastigota), é o responsável pela doença e, assim como toda a família Trypanosomatidea, é altamente dependente de glicose. Esses parasitas consomem a quantidade de glicose equivalente à sua massa em aproximadamente sete horas. A via glicolítica torna-se, portanto, chave para o desenvolvimento de inibidores que possam ser utilizados no combate a estes parasitas. Nesse sentido, temos realizado estudos com a enzima glicose-6-fosfato isomerase (glucose-6-fosfato isomerase; Phosphoglucose Isomerase PGI; EC 5.3.1.9), responsável pela isomerização reversível da D-glicose-6-fosfato e D-frutose-6-fosfato e participa na glicólise como a segunda enzima da via. Os trabalhos realizados até aqui culminaram na sua expressão em forma recombinante, purificação através de coluna de afinidade, e caracterizações enzimáticas. Sua atividade específica foi determinada através de métodos já estabelecidos encontrados na literatura. O IC50 da enzima frente a quatro inibidores da reação foi determinado. O trabalho finaliza com a construção de um modelo estrutural da enzima determinado através de métodos de modelagem molecular por homologia. / The African trypanosomiasis, or sleeping sickness as is popularly known, affected 25 thousand people only in 1995. It is estimated that the disease is responsible for 10 thousand deaths per year, according to data provided from the World Health Organization (WHO). The distribution of the disease is exclusively African due to the transmission being dependent on the tsé-tsé vector. A fly, belonging to the Glossinia genus, finds in the African continent favorable conditions for its proliferation. Presently the existing drugs are not efficient and have to be applied in high dosage, resulting in severe side effects. The bloodstream form (tripomastigote) of the parasite Trypanosoma brucei is responsible for the disease and such as the whole Trypanosomatidae family is dependent on glucose. Those parasites consume a quantity of glucose equivalent to its mass in approximately seven hours. This characteristic results in the glycolitic pathway been a key target for drug development against those parasites. In this direction we are developing research with the enzyme glucose-6-phosphate isomerase (Phosphoglucose lsomerase PGI; EC 5.3.1.9) responsible for the reversible isomnerisation of D-glucose6-phosphate and D-fuctcose-6-phosphate. PGI participates as the second enzyme in the glycolytic pathway. The work developed so far resulted in the expression of the recombinant form of the parasite PGI, its affinity purification and enzimatic characterization. The specific activity was determined with established methods. The IC50 of four inhibitors was determined and a structural model of T brucei PGI was built by molecular modeling techniques.

Made available in DSpace on 2014-06-12T16:30:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2775_1.pdf: 2530217 bytes, checksum: f1c3233880017dc9673198e936977f37 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A doença de Chagas é uma infecção causada pelo Trypanosoma cruzi, o qual é transmitido ao homem através da picada de insetos pertencentes à espécie Triatoma infestans. Em sua fase aguda, a doença provoca febre e miocardite. No entanto, alguns pacientes podem desenvolver a forma crônica, quando então surgem as principais conseqüências cardíacas e gastrointestinais. Muitos estudos foram feitos na busca de novos fármacos e alguns deles descrevem o potencial efeito anti-T. cruzi de derivados imidazolidínicos e acridínicos, ambos conhecidos pelo suas variadas ações biológicas. Neste trabalho, descreve-se a síntese e características físico-químicas de novos derivados imidazolidínicos e imidazacridínicos. Todos os compostos sintetizados tiveram suas estruturas químicas comprovadas por espectroscopia de Infravermelho (IV), Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN1H), espectrometria de Massas (MS) e cristalografia. Adicionalmente, investigou-se a citotoxicidade de todos os compostos utilizando-se células esplênicas de camundongos. O estudo da atividade anti-parasitária dos derivados imidazacridínicos e do composto 5-(9H-fluoren-2-il-metileno)-2-(4-nitrobenzilsulfonil)- 3,5-diidro-imidazol-4ona (LPSF/NN-237) foi realizado através da técnica de ensaio MTT. O cálculo da IC50, para esses mesmos compostos, foi determinado por meio de uma regressão linear simples utilizando o software Prisma 4 Graphpad. Os resultados demonstraram que o composto 5-(acridin-9-il-metileno)- 3-benzil-4-tioxo-imidazolidin-2-ona (LPSF/AC-128) obteve os melhores resultados de atoxidade e atividade anti-parasitária para T.cruzi, sendo um potencial candidato a novos fármacos no combate à doença de Chagas

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-07-13T17:36:08Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Doutorado Jana Sandes.pdf: 7518474 bytes, checksum: ffe5eecd1e8f6f0f35f618607ab2e4c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-13T17:36:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Doutorado Jana Sandes.pdf: 7518474 bytes, checksum: ffe5eecd1e8f6f0f35f618607ab2e4c3 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / FACEPE / O retículo endoplasmático (RE) é uma organela vital para as células eucarióticas, envolvido na síntese, modificação e enovelamento de proteínas, homeostase do cálcio e metabolismo de lipídios. Variações no nível de cálcio, inibição da glicosilação, estresse oxidativo, entre outros, podem levar o RE a uma condição de estresse, a qual dispara vias de sinalização específicas incluindo a Unfolded Protein Response (UPR). A UPR promove aumento na expressão de chaperonas, inibe a tradução de novas proteínas e aumenta a degradação de proteínas mal enoveladas. No entanto, quando o estresse é severo ou persistente, a UPR induz mecanismos de morte celular, principalmente por apoptose. Embora o RE possua papel fundamental na sobrevivência das células de mamíferos, estudos sobre a fisiologia desta organela em Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas, ainda são escassos. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi caracterizar molecular e morfologicamente a resposta de formas epimastigotas de T. cruzi ao estresse do RE induzido por ditiotreitol (DTT) ou tunicamicina (TM). As células tratadas com DTT apresentaram inibição do crescimento de maneira dose-dependente, com recuperação do crescimento após a retirada da droga. O tratamento com DTT não alterou os níveis proteicos de BiP (binding protein) mas reduziu significativamente os níveis de RNAm de BiP e calreticulina (CRT), sugerindo que o T. cruzi tenha uma resposta diferente da UPR de eucariotos superiores. O estresse persistente do RE induzido pelo DTT causou drásticas alterações morfológicas e fisiológicas compatíveis com morte celular por apoptose tardia/necrose, como observado pela dupla marcação com anexina-V e iodeto de propídeo, além da redução do tamanho do corpo celular, inchaço e desorganização das cristas mitocondriais, despolarização do potencial de membrana mitocondrial (ψm) e aumento da produção (21 – 94%) de espécies reativas de oxigênio (ROS). No entanto, a presença de perfis do RE envolvendo porções do citoplasma sugere que a autofagia também esteja ocorrendo. Por outro lado, a TM apresentou um forte efeito tripanostático, sem crescimento celular independentemente da dose ou do tempo de incubação, inclusive após a retirada da droga. O tratamento com a TM também não foi capaz de alterar os níveis proteicos de BiP, porém induziu um aumento nos níveis de RNAm de BiP e CRT. A análise por citometria de fluxo demonstrou que o tratamento com TM induziu despolarização do ψm sem um aumento pronunciado na produção de ROS, e apenas cerca de 10% das células tratadas apresentaram fenótipos de apoptose. Alterações ultraestruturais também foram observadas nas células tratadas com TM, como o arredondamento do corpo celular, a presença de inclusões lipídicas e um grande número de perfis de RE ao redor de estruturas citoplasmáticas em processo de degradação. Dessa forma, nossos resultados sugerem que o tratamento com DTT compromete o funcionamento da célula de maneira geral mais do que atua como estressor do RE, devido ao seu forte efeito oxidativo, levando à morte da célula. Já a TM atua mais especificamente sobre o RE, desencadeando um processo de autofagia/RE-fagia na tentativa de reverter o estresse de RE sem induzir morte celular por apoptose. / The endoplasmic reticulum (ER) is a vital organelle to eukaryotic cells, involved in the protein synthesis, folding and modification, calcium homeostasis and lipid metabolism. Changes in calcium levels, glycosylation inhibition, oxidative stress or others, can lead to an ER stress condition, which triggers specific signaling pathways including the Unfolded Protein Response (UPR). The UPR promotes an increase in the chaperone expression, inhibits the translation of new proteins and increases the degradation of unfolded proteins. However, when the stress is severe or persistent, the UPR induces cell death mechanisms, mainly by apoptosis. Although the ER has a pivotal role in the survival of mammalian cell, studies about the physiology of this organelle in Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease, are still scarce. In this regard, the aim of this study was to characterize molecular and morphologically the response of epimastigote forms of T. cruzi to the ER stress induced by dithiothreitol (DTT) or tunicamycin (TM). DTT-treated cells showed a dose-dependent growth inhibition, with growth recovery after drug withdrawal. The DTT treatment did not alter the BiP (binding protein) protein levels but significantly reduced the mRNA levels of BiP and calreticulin (CRT), suggesting that T. cruzi has a different response from higher eukaryotes UPR. Persistent ER stress induced by DTT caused drastic morphological and physiological changes compatible with cell death by late apoptosis/necrosis, as observed by double staining with annexin-V and propidium iodide, reduction of cell body, swelling and disorganization of mitochondrial cristae, mitochondrial membrane potential (ψm) depolarization and increasing of reactive oxygen species (ROS) production (21-94%). However, the presence of ER profiles involving cytoplasmic portions suggests that autophagy may also be occurring. On the other hand, the TM showed strong trypanostatic effect, with no cell growth observed independent of the dose and the time of incubation, even after drug withdrawal. The TM treatment was also unable to change the BiP protein levels, but induced an increase in BiP and CRT mRNA levels. The flow cytometry analysis showed that TM-treatment induced ψm depolarization without a pronounced increase in the ROS production (10 - 15%) and only about 10% of the treated cells exhibited apoptotic phenotypes. Ultrastructural changes were also observed in TM-treated cells, such as rounding of the cell body, the presence of lipid inclusions and a large number of ER profiles surrounding cytoplasmic structures in degradation process. Therefore, our results suggest that the DTT treatment compromises the whole cell function rather than acts as a specific inductor of ER stress, due to its strong oxidative effect, leading to cell death. The TM treatment acts more specifically on the ER, triggering an autophagy/ER-phagy process in an attempt to reverse the ER stress, without inducing cell death by apoptosis.

Orientador: Irineu Jose Barsanti de Camargo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T07:13:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nagamatsu_RoselyYukiko_M.pdf: 14747556 bytes, checksum: 774a8d03fd93c514b223bc33693a8bb0 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Foram estudadas respostas imunológicas apresentadas por diferentes linhagens de camundongos à infecção por estoques de Tripanosoma cruzi, cepa Y, mantidos em in vitro (TC) ou in vivo (TS). Foi observado que a manutenção do parasita em cultura celular atenua a virulência, refletida em menor mortalidade. As linhagens também apresentaram diferentes graus de resistência. Entretanto a linhagem BALBI/cJ, de mortalidade intermediária à linhagem AI J e C57Bl61 J, apresentou uma cinética parasitêmica maior, e portanto a parasitemia nem sempre correlaciona com a taxa de mortalidade. A imunização com o TC seguido de desafio após 72hs com o TS provocou uma proteção parcial à letalidade desse estoque. Análises imunohistoquímicas na fase precoce da infecção demonstraram uma hipertrofia do linfonodo poplíteo, do baço e das respectivas áreas povoadas por linfócitos, entretanto sem diferença entre localização das células T CD4 e T CD8. A análise percentual mostrou que na fase inicial da infecção existe zuna variação do número de linfócitos T CD4 e T CD8 dependente do estoque utilizado, que pode refletir a proteção induzida por TC / Abstract: Imune responses from differents strains of mice were studied after infection by stocks of Trypanosoma cruzi, Y strain, with in vitro (TC) or in vivo (TS) maintance. It was observed that maintance of parasite in celullar culture reduces virulence, reflected by smaller parasitemia. The strains of mice present differents levels of resistance to mortality. However, the BALBI cJ strain, of intermediated level of mortality between AI J and C57Bl61 J strains, presented greatest parasitemic kinectic, and therefore the parasitemia may not always correlacionate with mortality. The imunization with TC following challenge 72hs after with TS partially protected the lethal action of this stock. Imunohistoquimics analysis of early phase of infection demonstred hypertrophy in spleen, poplite linphonode and respectives limphocyte populated areas, however without difference between T CD4 or T CD8 lymphocyte localization. The percentual analysis showed that exist a variation of T CD4 and T CD8 lymphocyte subpopulations quantity in initial phase of infection depended of stock utilizated, which may reflect the protection induced by TC / Mestrado / Mestre em Imunologia

Orientador: Nelson Eduardo Duran Caballero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-22T19:17:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_AnnaMariaAlvesdePiloto_M.pdf: 1840150 bytes, checksum: 0aff6011fffecb965f2404ee6d9ed22a (MD5) Previous issue date: 1997 / Mestrado

Orientadores: Fernanda Ramos Gadelha, Luis Eduardo Soares Netto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-27T10:57:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_RenataVilela_M.pdf: 5015994 bytes, checksum: 1edbb85678d6958681c2f20e5bc88952 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi caracterizar e comparar a atividade enzimática da triparedoxina peroxidase (TXNp) em duas cepas de T. cruzi que apresentam diferentes resistências ao estresse oxidativo. A identificação da TXNp foi feita em extratos celulares totais da forma epimastigota de T. cruzi das cepas Y e Tulahuen 2. De um modo geral, a cepa Tulahuen 2 tem uma concentração maior desta enzÍma do que a Y. Variações na concentração da TXNp dentro de uma mesma cepa com origens geográficas diferentes também foi observada. A TXNp obtida em extratos celulares totais de T. cruzi epimastigotas possui função antioxidante, protegendo a glutamina sintetase (GS) contra as espécies reativas de oxigênio (EROs) produzidas pelo sistema oxidante DTT/Fe3+/02. Parece não estar envolvida com a proliferação celular, uma vez que uma correlação não pôde ser estabelecida através da análise por Western blotting entre os diferentes dias de crescimento e a quantidade desta proteína. A triparedoxina (TXN) também foi encontrada nos mesmos extratos e variações em sua concentração foram observadas quando as cepas e seus diferentes dias de crescimento foram comparados. Neste caso também as células Tulahuen 2 apresentaram uma maior concentração da TXN. Uma maior resistência às EROs geradas pelo sistema DTT/Fe3+/02 pode ser explicada pela maior concentração de TXN e TXNp encontradas. Isto levaria a um metabolismo de hidroperóxidos mais efetivo, quando comparado à cepay. Os "sheddings" de T. cruzi de ambas as formas (epimastigota e tripomastigota) mostraram a liberação de TXNp para o meio extracelular / Abstract: The objective of this work was to charactetize and compare the tryparedoxin peroxidase (TXNp) enzymatic activity in two strains of T. cruzi that have different resistances to oxidative stress. TXNp identification was made in total ceIlular extracts ITom epimastigote of Y and Tulahuen 2 strain. In a broad sense, Tulauen 2 strain has a higher concentration of this enzyme when compared to the Y strain. Differences in TXNp concentration into a same strain with different geographic origins were also observed. TXNp present in total ceIlular extracts ITom T. cruzi epimastigote has an antioxidant function, protecting glutamine synthetase (GS) against reactive oxygen species (ROS) produced by the DTTlFe3+/02 oxidant system. lt appears not to be involved with cellular proliferation, since a correlation could not be stablished using Westem Blot analysis, between the different growth days and the amount of this protein. Tryparedoxin (TXN) was also found in the same extracts and variation in its concentration were observed when strains and different growth days were compared. Also in this case, Tulahuen 2 ceIls had a higher concentration of TXN. The higher resistance observed in the Tulahuen 2 strain against ROS generated by DTTlFe3+/02 system can be explained by the higher concentration of TXN and TXNp found. This would led to a hydroperoxide metabolism system more effective, when compared to the Y strain. T. cruzi sheddings of both forms (epimastigote and trypomastigote) showed liberation ofTXNp to the extraceIlular environrnent / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Fernanda Ramos Gadelha / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-29T00:46:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Chiavegatto_CamilaWhonrathMorisco_M.pdf: 6305800 bytes, checksum: d06eeff5b5078e4a1fd37a8c2c30a3b3 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Em resposta a invasão pelo Trypanosoma cruzi (T.cruzi) a célula libera uma série de espécies reativas de oxigênio e ao mesmo tempo ocorre um aumento de concentração de cálcio no citosol indispensável para a penetração do parasita. O T.cruzi apresenta uma capacidade limitada em lidar com o estresse oxidativo, levando esta área a ser de grande interesse para a terapêutica. A triparedoxina peroxidase (TXNPx) é uma enzima antioxidante que participa de uma cascata enzimática para a detoxificação de hidroperóxidos descrita em T.cruzi que oferece novas opções para o desenvolvimento de agentes tripanossomicidas mais específicos. Duas cepas com diferentes resistências ao estresse oxidativo gerado pelo peróxido de hidrogênio foram utilizadas nesse trabalho. A cepa Tulahuen 2 apresenta menor tempo de geração e uma maior resistência ao estresse oxidativo, além de um maior índice de crescimento e concentração de TXNPx em relação a cepa Y. Correlacionando o número de células com o conteúdo protéico total, a cepa Tulahuen 2 apresenta uma relação maior do que a outra cepa estudada. Durante a fase lag, em ambas as cepas, ocorre um aumento da expressão da TXNPx. Nas condições testadas, as duas cepas metabolizaram o H2O2 na mesma velocidade. Baixas concentrações de H2O2, levaram a um estímulo da proliferação celular (cepa Y) dando suporte a idéia que este agente pode agir como segundo mensageiro. Essas células são capazes de se adaptar ao estresse oxidativo quando tratadas inicialmente com uma concentração citotóxica e depois desafiadas com uma dose citostática. Esta adaptação é temporária, induzindo a resistência até l h 30min após o pré- tratamento. A triparedoxina peroxidase está envolvida na adaptação ao estresse oxidativo de células epimastigotas de T. cruzi uma vez que tratando-se as células com baixas e altas concentrações de H2O2 observa-se um aumento da expressão desta proteína / Abstract: In response to invasion by T. cruzi, cells generate reactive oxygen species (ROS), occurring at the same time an increase in cytosolic calcium concentration that is essential for invasion. T. cruzi has a limited capacity to deal with oxidative stress, being this area of great interest for therapeutics. Typaredoxin peroxidase (TXNPx) is an antioxidant protein that participates in an enzymatic cascade for hydroperoxide detoxyfication in T. cruzi offering new options for the development of more specific drugs. Two T. cruzi strains with different resistance to the oxidative stress generated by H2O2, were used in this study. Tulahuen 2 strain has a smaller doubling time and a higher growth index, tryparedoxin peroxidase expression and resistance to oxidative stress. The correlation between cell number and total protein content was also higher in this strain. During the lag phase, for both strains, there is a higher expression of TXNPx. In the conditions used, both strains metabolized H2O2 at the same rate. Low concentrations of H2O2 were able to stimulate cell growth in T. cruzi (Y strain) giving support to the idea that it can act as a second messenger. These cells were also able to adapt to oxidative stress when treated with atoxic H2O2 concentrations and then challenged with citostatic concentrations. This adaptation is transient inducing resistance to challenging for a maximum of 1 h 30 min. Tryparedoxin peroxidase is involved in the adaptation of T. cruzi (Y strain) to oxidative stress since treatment with lower and higher H2O2 doses induced an increase in its expression / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Fernanda Ramos Gadelha / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-01T14:12:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Finzi_JaneKelly_M.pdf: 6305136 bytes, checksum: 87b01b7f1ab85cfe5a3aa5ec4bef04bc (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O Trypanosoma cruzi (T cruzi) está exposto a espécies reativas de oxigênio (EROs) produzidas pelo sistema imunológico do hospedeiro, assim como pelo metabolismo de drogas e pelo seu próprio metabolismo. Este parasita apresenta uma capacidade limitada em lidar com esse estresse oxidativo, sendo esta área de grande interesse para fins terapêuticos. Uma cascata enzimática para detoxificação de hidroperóxidos foi descrita para T cruzi, sendo diferente de qualquer sistema análogo no organismo hospedeiro. O estudo deste sistema e das enzimas envolvidas, incluindo a triparedoxina peroxidase (TXNPx), poderão levar ao desenvolvimento de agentes tripanossomicidas mais específicos e portanto menos tóxicos para o hospedeiro. Este trabalho explorou o comportamento de células de Tcruzi mutantes que possuem o gene da TXNPx citosólica superexpresso. Observou-se um grande aumento de rnRNA (158%) para as células transformadas com o vetor pTEX-TXNPx, sem o acompanhamento do aumento de produção da proteína TXNPx, evidenciado por Westem blotting. Possivelmente a regulação da expressão deste gene deve ocorrer a nível pós transcricional, como na maioria dos genes em tripanossomatídeos. Quando as células que superexpressam a TXNPx foram tratadas com peróxido de hidrogênio (H2O2) durante 30 min, observou-se um grande aumento dos níveis de rnRNA, mas a quantidade de proteína traduzida não aumentou na mesma proporção. Altos níveis de rnRNA correlacionados aos níveis de proteína, foram observados em períodos de incubação maiores (1h - 2hs), demonstrando que a proteína é traduzida de acordo com a necessidade do parasita. As células que superexpressam a TXNPx apresentaram um maior índice de crescimento, menor tempo de duplicação e uma maior resistência ao estresse oxidativo gerado pelo H2O2 (50% de inibição do crescimento foi alcançada com 104JlM para as células selvagens e 125JlM para as células mutantes). A superexpressão de uma única proteína da cascata de detoxificação de hidroperóxidos dos tripanossomatídeos, neste caso a TXNPx, leva a um aumento na produção de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH) (aproximadamente 23%). A enzima responsável por este efeito, foi a glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PD), primeira enzima da Via das Pentoses Fosfato, que produz NADPH. Assim, como para as células de mamíferos existe uma correlação entre a atividade aumentada da G6PD e a proliferação, o mesmo pode ocorrer para o T. cruzi, uma vez que as células que superexpressam a TXNPx citosólica apresentaram um índice de crescimento maior, provavelmente devido a uma maior atividade da G6PD / Abstract: Trypanosoma cruzi (T cruzi) is exposed to reactive oxigen species (ROS) produced by the host immunological system, drugs metabolism and :/iom its own metabolismo This parasite has a limited capacity to cope with oxidative stress, which is of great interest to terapeutic. A hydroperoxide detoxification cascade, different :/iom any similar system in the host organism, was described for Tcruzi. The study of this system and the involved enzymes, inc1uding tryparedoxin peroxidase (TXNPx), can lead to the development of more specific trypanosomicid agents less toxic to the host. This work explored the behavior of T cruzi mutant cells, that have the cytosolic TXNPx gene overexpressed. It was observed a great increase on mRNA (158%) levels in pTEX-TXNPx transformed cells, without going along with the same increase on TXNPx protein production, as detected by Westem blotting. This result could be explained by the regulation at the post-transcriptionallevel of this gene, as the majority of trypanosomatids genes. When TXNPx overexpressed cells were treated with hydrogen peroxide (HzOz) for 30 min, a great increase on mRNA levels was observed, but protein translation did not increase at the saroe proportion. Higher mRNA levels correlated to protein levels were observed when the incubation period was longer (lh -2hs), inferring that protein translation occurs according to the parasite needs. Cells that overexpress TXNPx had a greater growing index, a smaller duplication time and a higher resistance to oxidative stress generated by HzOz (50 % of growth inhibtion was achieved at 1O4/lM for wild type and 125/lM for mutant celIs). The overexpression of on1y one protein :/iom the trypanosomatid hydroperoxide detoxification cascade, in this case TXNPx, led to an increase in reduced nicotinamide adenine dinuc1eotide phosphate (NADPH) production (23% approximately). The enzyme responsible for this effect, was glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), the first enzyme of the Pentose Phosphate Pathway, that produces NADPH. Once in mammalian celIs there is a correlation between increased G6PD activity and proliferation, the same could occur in T. cruzi since the celIs that overexpress TXNPx had a greater growth index / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular