Ce travail porte sur la tétraspanine Co-029/Tspan8 et son rôle dans la progression tumorale dans le cancer du côlon. Les tétraspanines constituent une famille de glycoprotéines membranaires qui ont la propriété de s’associer directement à d’autres protéines membranaires pour former des complexes primaires. Ces complexes primaires s’assemblent ensuite pour former des complexes d’ordre secondaire réalisant ainsi une compartimentation membranaire, appelée « Tetraspanin Web » ou microdomaines enrichis en tétraspanines. De nombreuses études cliniques et expérimentales ont établi une corrélation entre le niveau d'expression de certaines tétraspanines et la progression tumorale, notamment la formation de métastases.L’objectif de ce travail était de faire avancer la compréhension du mécanisme par lequel la tétraspanine Co-029/Tspan8 peut moduler l’action d’autres molécules de surface comme des récepteurs de facteurs de croissance ou des molécules d’adhérence sur la migration cellulaire, nécessaire à l’invasion et au processus métastatique. Nous avons utilisé comme outils cellulaires, des lignées n’exprimant pas ou peu de Co-029/Tspan8 et les mêmes lignées transduites exprimant fortement cette tétraspanine. Nous avons identifié de nombreux partenaires de Co-029/Tspan8 par co-immunoprécipitation, pontage covalent et spectrométrie de masse (SM), en particulier EGFR, CD44 et ECE1.L’EGFR dans les cellules inhibe la migration cellulaire seulement quand Co-029/Tspan8 est exprimé, ce qui a été démontré par l’inhibition d’expression par ARN interférence ou l’utilisation des inhibiteurs de l’EGFR comme AG-1478 ou le Cetuximab. Cet effet est supprimé soit par la double inhibition d’EGFR et Co-029/Tspan8 ou par traitement simultané avec l’anticorps anti-Co029. Nous avons observé, d’une part une nette augmentation de l’association d’EGFR aux complexes à tétraspanines en présence de Co-029/Tspan8 et, d’autre part une augmentation de la phosphorylation d’EGFR (pEGFR) suggérant un mécanisme possible impliquant la signalisation de ce récepteur.Nous avons également observé que l’effet de CD44 sur la migration de cellules isolées est dépendante de Co-029/Tspan8. Comme de nombreux types de tumeurs, ainsi que leurs métastases expriment des niveaux élevés de variants de CD44 tels que le cancer gastro-intestinal ou le cancer du sein, nous avons étudié les isoformes de CD44 associées au Co-029/Tspan8. Nous avons retrouvé les peptides des exons variables v8-v10 de CD44 par immunoprécipitation de CD44 sur notre modèle cellulaire exprimant Co-029/Tspan8 après analyse en spectrométrie de masse. CD44 v8-v10 correspond à des produits des 3 derniers exons de la région variable de CD44. D’autre part, pour étudier si l'effet de CD44 pouvait être médié par une interaction avec EGFR, nous avons mesuré le niveau de pEGFR dans les cellules traitées par ARN interférence ciblant CD44. Nous avons observé qu’une réduction de l'expression de CD44 était accompagnée d’une réduction de 50% de pEGFR spécifiquement dans les cellules exprimant Co-029/Tspan8.Finalement, l’analyse des complexes à tétraspanines en spectrométrie de masse nous a permis de découvrir un nouveau partenaire de Co-029/Tspan8, l’enzyme de conversion de l’endothéline de type 1 (ECE1). Il s’agit d’une une enzyme membranaire de la famille des métallopeptidases à Zn qui génère la forme active de l’endothéline. Il est exprimé dans différents types de cancer et est associé à un phénotype invasif. Sa présence dans les complexes à tétraspanines dépend de Co-029/Tspan8 et cette association augmente son activité de clivage de la Big-endothéline, précurseur de l’endothéline. Nous avons étudié la relation fonctionnelle entre Co-029/Tspan8 et ECE1 dans des tissus digestifs normaux en comparant des souris sauvages et des souris dont nous avons inactivé le gène Co-029/Tspan8. / This work deals with the tetraspanin Co-029/Tspan8 and its role in tumor progression in colon cancer. Tetraspanins are a family of glycoproteins that have the property to associate directly with other membrane proteins to form primary complexes. These primary complexes then assemble into secondary order complexes realizing a membrane compartmentalization, called "Tetraspanin Web " or Tetraspanins Enriched Microdomains. Numerous clinical and experimental studies have established a correlation between the expression level of certain tetraspanins and tumor progression, including metastasis.The objective of this work was to advance the understanding of the mechanism by which the tetraspanin Co-029/Tspan8 can modulate the action of other surface molecules such as receptors for growth factors or adhesion molecules on cell migration, required for invasion and metastasis. We use as cellular tools, lines expressing little or no Co-029/Tspan8 and the same transduced cell lines strongly expressing this tetraspanin. We have identified several partners for Co-029/Tspan8 by co-immunoprecipitation, cross-linking and mass spectrometry (MS), particularly EGFR, CD44 and ECE1.EGFR expression in cells inhibits cell migration only when Co-029/Tspan8 is expressed, which was demonstrated by the inhibition of expression by RNA interference or the use of EGFR inhibitors such as AG-1478 or cetuximab. This effect is reversed either by dual inhibition of EGFR and Co-029/Tspan8 or by co-treatment with anti-Co029 antibody. We have observed, on the one hand a marked increase in the association of EGFR with tetraspanins complexes in the presence of Co-029/Tspan8 and, secondly an increase in the phosphorylation of EGFR (pEGFR) suggesting a mechanism linked to signaling of this receptor.We also observed that the CD44 effect on migration of isolated cells is dependent on Co-029/Tspan8. As many types of tumors and their metastases express high levels of CD44 variants such as gastrointestinal cancer or breast cancer, we studied CD44 isoforms associated with the tetraspanin Co-029/Tspan8. We found the peptides variable exons v8-v10 of CD44 by immunoprecipitation of CD44 in our cellular model expressing Co-029/Tspan8 after mass spectrometry analysis. CD44 v8-v10 corresponds to products of the last 3 exons of the variable region of CD44. On the other hand, to investigate whether the effect of CD44 could be mediated by interaction with EGFR, we measured the level of pEGFR in cells treated by RNA interference targeting CD44. We observed that a reduction in CD44 expression was accompanied by a 50% reduction of pEGFR specifically in cells expressing Co-029/Tspan8.Finally, the analysis of tetraspanin complexes by mass spectrometry allowed us to find a new partner of Co-029/Tspan8, the type 1 endothelin-1 converting enzyme (ECE1). It is a membrane enzyme of the family of Zn dependent metallopeptidases which generates the active form of endothelin. It is expressed in various types of cancer and is associated with an invasive phenotype. Its presence in the tetraspanin complexes depends on the presence of Co-029/Tspan8 and this association increases its cleavage activity of Big-endothelin, the endothelin precursor. We investigated the functional relationship between Co-029/Tspan8 and ECE1 in normal digestive tissues by comparing wild-type mice and mice in which we inactivated the Co-029/Tspan8 gene.

Le mélanome cutané est l’affection de la peau la plus meurtrière. Afin de pouvoir être traité efficacement, ce cancer nécessite un diagnostic et une exérèse chirurgicale précoce des lésions primitives non-invasives. En effet, les patients atteints de métastases ont peu de chance de survivre car les lésions de mélanome développent rapidement des résistances aux thérapies et possèdent une forte propension à disséminer des métastases dans de nombreux organes. Le franchissement de la lame basale de la peau appelée jonction dermo épidermique est la première étape cruciale dans l’invasion précoce du mélanome cutané. Notre équipe étudie cette étape depuis plusieurs années et a démontré que l’expression de la tétraspanine 8 (TSPAN8) apparait lors de la progression de ce cancer et permet l’acquisition d’un phénotype invasif par les cellules tumorales. Plusieurs membres de la famille des protéines tétraspanines sont connus pour leurs implications dans divers cancers, mais notre connaissance de leurs régulations transcriptionnelles est encore assez réduite. Les travaux présentés dans cette thèse ont permis d’identifier les premiers régulateurs transcriptionnels connus de TSPAN8, et également de commencer l’étude fonctionnelle de ces régulations sur l’invasion dépendante de TSPAN8 par le mélanome cutané. En particulier, nous montrons que l’invasion dépendante de TSPAN8 est entre autres régulée par le membre du complexe Mediator LCMR1/MED19 et par le suppresseur de tumeur p53. Ainsi, ces travaux apportent une meilleure compréhension de l’invasion précoce du mélanome cutané, ce qui devrait permettre une meilleure prise en charge des patients à l’avenir / Cutaneous melanoma is the deadliest skin condition. Curing this cancer requires an early diagnosis and surgical excision of the non-invasive primary lesions. Indeed, patients with metastasis have few chances to survive this cancer since the melanoma lesions rapidly develop treatment resistances, and can disseminate metastasis in numerous organs. Crossing the skin basal membrane called the dermal epidermal junction is the first crucial step of early melanoma invasion. Our team has studied the early invasion of melanoma for many years, and demonstrated for the first time the implication of Tetraspanin (TSPAN8) in melanoma early invasion. Indeed, the expression of this gene and the protein that it codes appears with the progression of melanoma and confers the tumor cells an invasive phenotype. Several members of the tetraspanin protein family are known for their implication in various cancers, yet their transcriptional regulation remains poorly understood. In the case of TSPAN8, nothing was known regarding its transcriptional regulation in melanoma. The experiments presented in this thesis allowed us to identify the first known regulators of TSPAN8 transcriptional expression, and also to begin the functional study of the regulators impact on TSPAN8 dependent invasion of human cutaneous melanoma. Amongst these regulators are the member of the Mediator Complex MED19/LCMR1 and the tumor suppressor p53. The results presented in the present manuscript allow a better understanding of cutaneous melanoma early invasion and should help improving the treatments against this cancer in the future